苹果MdMYB1基因中与早结果性状相关的突变及其鉴定方法

摘要

本发明苹果MdMYB1基因中与早结果性状相关的突变及其鉴定方法，属生物技术领域，为在苹果杂交后代中选择早结果植株提供依据。利用苹果着色相关基因MdMYB1中的三处突变，通过设计特异引物，开发出检测苹果着色突变的新分子标记，其显著进步是与国外已有的dCAPS标记、我们开发的CAPS标记相比，不需要进行酶切，操作简便。利用该标记方法鉴定123株苹果杂交后代基因突变和果实着色时，发现MdMYB1基因中另外两处突变与杂交后代早结果性状相关，可用来设计特异引物开发分子标记，在苗期对苹果杂交后代进行早期选择，选出具有早结果性状的植株加强管理，尽早获得较多的结果植株；也可用于分子设计育种，选出具有早结果性状的亲本进行杂交，尽早获得较多的结果植株。

权利要求

1.一种与苹果早结果性状相关的分子标记，其特征在于：所述分子标记位于MdMYB1基因的等位基因MdMYB1-1转录起始点上游-1616bp处的位点，其碱基发生与苹果早结果性状相关的杂合突变：G→G/A，苹果植株含有碱基为A的等位基因时具有早结果性状；和/或等位基因MdMYB1-1转录起始点上游-1573bp处的位点，其碱基发生与苹果早结果性状相关的杂合突变：A→T/A，苹果植株含有碱基为T的等位基因时具有早结果性状。

2.一种如权利要求1所述与苹果早结果性状相关的分子标记的检测方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1：提取DNA样本；

步骤2：利用上述MdMYB1基因突变设计一个特异引物，对应于早结果性状等位基因，另外设计一个引物与特异引物配对；

步骤3：进行PCR扩增；

步骤4：普通琼脂糖电泳检查PCR产物；

步骤5：根据电泳结果鉴定苹果杂交后代：出现早结果性状等位基因对应的PCR产物带时具有早结果性状。

3.根据权利要求2所述的分子标记检测方法在苹果杂交后代植株早结果性状进行早期选择及分子设计育种中的应用。

说明书

苹果MdMYB1基因中与早结果性状相关的突变及其鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及基于苹果MdMYB1基因突变的分子标记方法鉴定苹果杂交后代早结果性状以及果实着色性状。

背景技术

[0002] 苹果(Malus domestica Borkh.)是我国果树产业中重要的大宗水果，其着色问题是影响我国许多产区苹果质量的一个重要因素，培育着色好的品种是生产中急需的。利用苹果着色相关基因的序列变异，开发果实着色性状的分子标记，提早鉴定杂交后代植株果实着色性状，对杂交后代植株提早进行筛选，将有助于降低早期试验费用和工作量，以低成本尽快培育出着色好的苹果新品种，增强我国苹果的质量和市场竞争力。

[0003] 苹果的着色与果皮中的花色苷有关，花色苷的合成涉及查尔酮合成酶(CHS)、类黄酮3-羟基化酶(F3H)、二氢黄酮醇还原酶(DFR)、UDP-葡萄糖类黄酮-3-O-葡萄糖转移酶(UFGT)等酶的基因。研究表明，花色苷的积累与这些基因、特别是UFGT基因的表达水平有关，这些基因的表达受到MYB家族转录因子的调控，MdMYB1基因是一个与果实着色有关的功能基因(Takos等，2006)。Takos等(2006)通过分析MdMYB1-1(GenBank登录号DQ886414)等基因序列，找到了一个与果实着色性状有关的碱基突变位点，开发出一个dCAPS标记。dCAPS标记是一种改进的CAPS标记(derived CAPS)，而CAPS标记是指切割扩增的多态性序列标记(Cleaved amplified polymorphic sequence)。Takos等(2006)开发的dCAPS标记虽然不能将澳洲青苹等品种与一些着色品种区分开，但可以区分其它一些着色与非着色品种，可以完全区分杂交亲本植株(粉红女士姊妹株、金帅)及其后代植株，在杂交后代植株的早期选择中利用价值高。该dCAPS标记的缺点是酶切后的片段长度仅有29bp的差异，利用普通的琼脂糖电泳无法检测，需要用价格约为7000元／125g的昂贵NuSieve GTG琼脂糖进行电泳检测。通过进一步分析MdMYB1基因序列，除dCAPS标记涉及的位点外，我们找出其它2个与苹果果实着色性状相关的突变位点，开发出一个可用普通琼脂糖电泳检测的CAPS分子标记，可鉴定苹果植株果实着色性状，实验成本显著降低。本发明的最初目的是利用MdMYB1基因中与苹果果实着色性状相关的突变，开发不需要进行PCR产物酶切、用普通琼脂糖电泳检测PCR产物即可鉴定苹果植株果实着色性状的分子标记方法。结果不仅利用已知苹果着色相关基因MdMYB1(GenBank登录号DQ886414)中与苹果着色性状相关的三处碱基突变，开发出新的分子标记方法，而且发现基于MdMYB1基因中三处突变检测的非着色性状等位基因与苹果杂交后代早结果性状相关，此结果于2013年10月16日申请专利获得受理(申请号201310482643.X)。但进一步研究发现，实际上是杂交亲本嘎拉苹果中的非着色性状等位基因与早结果性状密切相关，含有杂交亲本富士苹果非着色性状等位基因的植株结果少。在MdMYB1-1基因转录起始点上游-1616bp和-1573bp位置的两处突变皆可鉴别富士和嘎拉苹果的非着色性状等位基因：在-1616bp位置，苹果植株含有碱基为A的非着色性状等位基因时具有早结果性状；在-1573bp位置，植株含有碱基为T的非着色性状等位基因时具有早结果性状。

[0004] 我们培育的富士苹果为亲本的另一个杂交群体27株植株，不含有嘎拉苹果中的非着色性状等位基因，开始结果比富士与嘎拉的杂交后代晚2年，从另一方面说明嘎拉苹果中的非着色性状等位基因与早结果性状密切相关。

[0005] 陈照峰等(1997)、张敏等(1998)报道金帅(又名金冠)是早结果品种，可在3～5年生时结果。鉴于本发明杂交亲本之一嘎拉的亲本是金帅，这些报道可进一步佐证我们的发现，我们找出了在金帅、嘎拉苹果中与早结果性状关系密切的等位基因。等位基因与早结果性状的关系属于国内外首次发现，对于苹果分子设计育种和分子辅助育种具有重要意义。

[0006] 参考文献

[0007] [1]苑克俊，张毅，孙瑞红，张振成.苹果、葡萄花色苷生物合成研究进展.山东农业科学，1998.6：46-49.

[0008] [2]张学英，张上隆，骆军，叶正文，李世诚.果实花色素苷合成研究进展.果树学报，2004，21(5)：456-460.

[0009] [3]Takos，A.M.，Jaffe，F.W.，Jacob，S.R.，Bogs，J.，Robinson，S.P.，Walker，A.R.Light-Induced Expression of a MYB Gene Regulates Anthocyanin Biosynthesis in Red Apples.Plant Physiology，2006，142(3)：1216-1232.

[0010] [4]Ban，Y.，Honda，C.，Hatsuyama，Y.，Igarashi，M.，Bessho，H.and Moriguchi，T.Isolation and functional analysis of a MYB transcription factor gene that is a key regulator for the development of red coloration in apple skin.Plant Cell Physiology，2007，48(7)：958-970

[0011] [5]苑克俊，黄立香，魏海蓉，刘庆忠.苹果MdMYB1基因中与着色相关的两处突变及其检测方法.专利ZL201010168149.2，2013-6-26

[0012] [6]陈照峰，陈延惠，王杰，张建璐，王国新，马喜成，宋建伟.苹果主要经济性状遗传动态的研究.河南农业大学学报，1997，31(3)：239-243

[0013] [7]张敏，丁玉英，谢重新，张景娥，高爱农，沙守峰.金冠苹果杂种后代的遗传倾向.遗传，1998，20(增刊)：95～97

发明内容

[0014] 本发明基于苹果MdMYB1基因突变与苹果杂交后代早结果性状相关，充分利用基因突变信息设计特异引物和配对引物，开发出检测突变的分子标记方法，鉴定与苹果早结果性状密切相关的等位基因、进而鉴定苹果植株早结果性状；本发明的分子标记方法能够同时鉴定出苹果着色性状。

[0015] 本发明解决问题所采用的技术方案是：已知苹果着色相关基因MdMYB1(GenBank登录号DQ886414)中有三处碱基突变与苹果着色性状相关，一处在MdMYB1-1基因转录起始点上游-1624bp位置发生突变或者杂合突变：G→A、G→G／A、G→A／T，苹果植株碱基为A的等位基因为非着色性状等位基因、含有碱基为G的等位基因时具有果实着色性状；一处在MdMYB1-1基因转录起始点上游-1603bp位置发生突变或者杂合突变：C→A、C→C／A，苹果植株碱基为A的等位基因为非着色性状等位基因、含有碱基为C的等位基因时具有果实着色性状；另一处在MdMYB1-1基因转录起始点上游-1550bp位置发生突变或者杂合突变：T→C、T→T／C、T→C／A，苹果植株碱基为C的等位基因为非着色性状等位基因、含有碱基为T的等位基因时具有果实着色性状。本发明充分利用这些基因突变信息设计两个特异引物，一个特异引物对应于非着色性状等位基因，另一个特异引物对应于果实着色性状等位基因，另外设计两个引物与两个特异引物配对，并且设计引物时注意使两对引物的PCR扩增产物大小有足够差异便于琼脂糖胶电泳检测，然后利用这两对引物进行PCR扩增检测突变，PCR产物直接用普通琼脂糖电泳检查，根据琼脂糖电泳检查结果鉴定苹果杂交后代等位基因和果实着色性状，并统计果实结果情况。出现非着色性状等位基因对应的PCR产物带时为非着色性状等位基因、出现果实着色性状等位基因对应的PCR产物带时具有果实着色性状。

[0016] 苹果着色相关基因MdMYB1(GenBank登录号DQ886414)中的两处碱基突变与苹果早结果性状相关，一处在MdMYB1-1基因转录起始点上游-1616bp位置发生与苹果早结果性状相关的杂合突变：G→G／A，苹果植株含有碱基为A的等位基因时具有早结果性状；另一处在MdMYB1-1基因转录起始点上游-1573bp位置与苹果早结果性状相关的杂合突变：A→T／A，苹果植株含有碱基为T的等位基因时具有早结果性状。本发明充分利用前述-1624bp、-1603bp、-1550bp和-1616bp、-1573bp位置五处基因突变信息设计两个特异引物，一个特异引物对应于早结果性状等位基因，另一个特异引物对应于具有果实着色性状的等位基因，另外设计两个引物与两个特异引物配对，并且设计引物时注意使PCR扩增产物大小有足够差异便于琼脂糖胶电泳检测，然后利用这两对引物进行PCR扩增检测突变，PCR产物直接用普通琼脂糖电泳检查，根据琼脂糖电泳检查结果鉴定苹果杂交后代等位基因和果实性状。
出现早结果性状等位基因对应的PCR产物带时具有早结果性状，出现果实着色性状等位基因对应的PCR产物带时具有果实着色性状。这些结果可用来对苹果杂交后代植株早结果性状进行早期选择，以便对具有早结果性状的杂交后代植株加强管理，尽早获得结果植株；也可以根据琼脂糖电泳检查结果选择苹果杂交亲本，选出具有早结果性状的亲本进行杂交，尽早获得结果植株。

[0017] 本发明的有益效果是：(1)本发明新开发的分子标记可用来鉴定苹果早结果性状和果实着色性状。(2)与现有的鉴定苹果果实着色性状的一个dCAPS标记和一个CAPS标记相比，本发明新开发的分子标记鉴定方法更简单实用。现有dCAPS标记的PCR扩增产物酶切后，片段长度仅有29bp的差异，利用普通的琼脂糖电泳无法检测；我们发明的现有CAPS标记PCR扩增产物的酶切产物片段差异大，可利用普通的琼脂糖电泳检测，实验成本降低，但仍然需要对PCR扩增产物进行酶切；本发明新开发的分子标记鉴定方法不需要对PCR扩增产物进行酶切。(3)与现有技术相比，本发明分子标记方法可节省实验成本。现有dCAPS标记实验在3％的NuSieve GTG琼脂糖上进行电泳检测，NuSieve GTG琼脂糖价格昂贵为6900元／125g；
现有CAPS标记实验在1.2％的普通琼脂糖上电泳检测，价格仅220元／100g。一次实验按
100ml凝胶溶液计算，则现有dCAPS标记实验琼脂糖费用165.6元，现有CAPS标记实验琼脂糖费用2.64元，本发明分子标记方法采用普通琼脂糖电泳，费用低，尽管增加一对引物费用，但省去酶切步骤，可节省限制性内切酶费用。(4)利用本发明可鉴定苹果杂交后代早结果性状，对苹果杂交后代植株进行早期选择，对选出的杂交后代植株加强管理，尽早获得结果植株；可选择具有早结果性状的苹果亲本进行杂交，尽早获得结果植株。

[0018] 这里需要说明的是：本发明所用2个苹果品种富士、嘎拉为生产上栽培的品种，公众能得到；本发明涉及基因序列为已知MdMYB1基因序列，不涉及核苷酸或氨基酸序列表。

附图说明

[0019] 图1是8个杂交后代PCR扩增产物的电泳图。图中M为DNA分子量标记，数字和bp为标记大小与单位，1，2，3，4，5，6，7，8为8个杂交后代植株；

[0020] 图2是实施例18个杂交后代PCR扩增产物的电泳图，图中M为DNA分子量标记，左侧数字和bp为标记大小与单位，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18为18个杂交后代植株；

[0021] 图3是实施例8个杂交后代PCR扩增产物的电泳图，图中M为DNA分子量标记，左侧数字和bp为标记大小与单位，1，2，3，4，5，6，7，8为8个杂交后代植株，Dr和Dg为PCR扩增产物带代表的等位基因代号；

具体实施方式

[0022] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

[0023] 本发明方法实施步骤：

[0024] 步骤1，试材：利用富士和嘎拉苹果作为亲本进行杂交获得种子，种子播种后获得的苹果杂交后代植株叶作为试材。

[0025] 步骤2，基因组DNA提取：试材研磨后立即加入预热至65℃的0.6mL2％CTAB提取缓冲液[2％CTAB，100mmol／L Tris-HCl(pH8.0)，20mmol／L EDTA，1.4mol／L NaCl，2％PVP-40，2％β-巯基乙醇]，在65℃水浴中提取30min，这期间轻轻倒置样品试管3次。取出加入0.6mL氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻翻转，充分混匀，12000rpm离心10min。将上清液转入另一个新试管，加入等体积经-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇匀，在12000rpm离心10min后将上清液移去。
试管中的DNA球用500μL冷的70％乙醇(-20℃)漂洗2次，将试管置于室温下晾干，加入30～
50μL灭菌无离子水或0.2X的TE，再加入1μL RNase A(2.5mg／ml)处理除去RNA，在4℃冰箱中保存备用，暂时不用的DNA则冷冻保存。

[0026] 步骤3，设计引物：在MdMYB1-1基因转录起始点上游-1624bp位置，苹果植株含有碱基A的等位基因为非着色性状等位基因、含有碱基为G的等位基因时具有果实着色性状；在MdMYB1-1基因转录起始点上游-1603bp位置，苹果植株含有碱基A的等位基因为非着色性状等位基因、含有碱基为C的等位基因时具有果实着色性状；在MdMYB1-1基因转录起始点上游-1550bp位置，苹果植株含有碱基C的等位基因为非着色性状等位基因、含有碱基为T的等位基因时具有果实着色性状，表明这三处基因突变位点碱基信息可直接用来鉴定苹果果实着色性状，可用来设计引物开发鉴定苹果果实着色性状的分子标记。本发明中，我们利用MdMYB1基因序列设计一个特异引物Mb4b(序列为ACCGGACCTATCTCATTCG)，对应于基因转录起始点上游-1603bp位置的突变，用于检测果实着色性状；设计另一个特异引物Mb3h(序列为CCAACACCCGCTATGGTCC)，对应于基因转录起始点上游-1550bp位置的突变，用于检测非着色性状等位基因；另外设计两个配对引物Mb3a(序列为CGTTCGAAGGTCTAAGGTG)和Mb2R(序列为TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)，形成Mb3a与Mb4b、Mb3h与Mb2R两对引物进行PCR扩增。为便于琼脂糖胶电泳检测，设计引物时注意控制两对引物的PCR扩增产物大小。

[0027] 步骤4，PCR扩增：一对引物的PCR反应液(20μL)含有0.5μL(25ng)基因组DNA、0.4μL dNTPs(10mmol／L)、2μL10x Taq缓冲液、1.6μLMg2+(25mmol／L)、0.5μL特异引物Mb4b(10μmol／L)、0.5μL配对引物Mb3a(10μmol／L)、0.25μL(5U／μL)的Taq DNA聚合酶和14.25μL水；PCR反应35个循环，每一循环包括94℃变性30s、55℃退火1min和72℃引物延伸2min，35个循环后获得PCR产物1。另一对引物的PCR反应液(20μL)含有0.5μL(25ng)基因组DNA、0.4μL dNTPs(10mmol／L)、2μL10x Taq缓冲液、1.6μLMg2+(25mmol／L)、0.5μL特异引物Mb3h(10μmol/L)、0.5μL配对引物Mb2R(10μmol／L)、0.25μL(5U／μL)的Taq DNA聚合酶和14.25μL水；PCR反应35个循环，每一循环包括94℃变性30s、55℃退火1min和72℃引物延伸2min，35个循环后获得PCR产物2。也可以将两对引物放在同一PCR反应液中进行PCR扩增，但效果不如两对引物分别扩增后混合PCR产物。

[0028] 步骤5，电泳检查：将3μL PCR产物1、3μL PCR产物2、3μL水和1μL上样染料混合，溴化乙锭染色，在120V电压、1.2％琼脂糖胶上进行电泳检查PCR产物，结果如图1所示，有2个植株PCR扩增产物仅出现一条与苹果果实着色性状有关的带1(大小约380bp)，其果实为红色；有2个植株PCR扩增产物仅出现一条与苹果非着色性状等位基因有关的带2(大小约420bp)，故其果实为非红色；有4个植株PCR扩增产物出现一条与苹果果实着色性状有关的带1和一条与苹果非着色性状等位基因有关的带2，其果实为红色。

[0029] 步骤6，对于研究过程中发现的富士苹果非着色性状等位基因Df和嘎拉苹果非着色性状等位基因Dg对早结果性状的影响不同，利用MdMYB1-1基因转录起始点上游-1616bp和-1573bp位置的突变进行鉴别。例如，利用MdMYB1基因序列设计一个序列为GGTCCGGTTCTATTTCGTAT的特异引物Mb3b，对应于基因转录起始点上游-1573bp位置的突变，用于检测嘎拉苹果非着色性状等位基因；另外设计一个序列为ACCGGACCTATCTCATTCG的特异引物Mb4b，对应于基因转录起始点上游-1603bp位置的突变，用于检测果实着色性状；再设计两个配对引物Mb3a(序列为CGTTCGAAGGTCTAAGGTG)和Mb2R(序列为
TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)，形成Mb3a与Mb4b、Mb3b与Mb2R两对引物进行PCR扩增。

[0030] 步骤7，PCR扩增：两对引物的PCR反应液(20μL)含有0.5μL(25ng)基因组DNA、0.4μL dNTPs(10mmol／L)、2μL10x Taq缓冲液、1.6μLMg2+(25mmol／L)、0.5μL特异引物Mb4b(10μmol／L)、0.5μL特异引物Mb3b(10μmol／L)、0.5μL配对引物Mb3a(10μmol／L)、0.5μL配对引物Mb2R(10μmol／L)、0.25μL(5U／μL)的Taq DNA聚合酶和13.25μL水；PCR反应35个循环，每一循环包括94℃变性30s、55℃退火1min和72℃引物延伸2min，35个循环后获得PCR产物。也可以按照步骤4的方法分别扩增两对引物。

[0031] 步骤8，电泳检查代表早结果性状等位基因和代表着色性状等位基因的PCR产物带。

[0032] 实施例1：本发明分子标记法鉴定苹果杂交后代植株早结果性状

[0033] 步骤1，试材：利用富士和嘎拉苹果作为亲本进行杂交获得种子，种子播种后获得的苹果杂交后代植株叶作为试材。

[0034] 步骤2，基因组DNA提取：同前述实施步骤。

[0035] 步骤3，设计引物：利用MdMYB1基因序列设计一个序列为ACCGGACCTATCTCATTCG的特异引物Mb4b，对应于基因转录起始点上游-1603bp位置的突变，用于检测果实着色性状；设计另一个序列为ACCGGACCTATCTCATTCT的特异引物Mb4h，也是对应于基因转录起始点上游-1603bp位置的突变，用于检测非着色性状等位基因；另外设计两个配对引物Mb3a(序列为CGTTCGAAGGTCTAAGGTG)和Mb2f(序列为TTGGGTGTTTGCTGTTGC)，形成Mb2f与Mb4b、Mb3a与Mb4h两对引物进行PCR扩增。

[0036] 步骤4，PCR扩增：一对引物的PCR反应液(20μL)含有0.5μL(25ng)基因组DNA、0.4μL dNTPs(10mmol／L)、2μL10x Taq缓冲液、1.6μLMg2+(25mmol／L)、0.5μL特异引物Mb4b(10μmol／L)、0.5μL配对引物Mb2f(10μmol／L)、0.25μL(5U／μL)的Taq DNA聚合酶和14.25μL水；PCR反应35个循环，每一循环包括94℃变性30s、55℃退火1min和72℃引物延伸2min，35个循环后获得PCR产物1。另一对引物的PCR反应液(20μL)含有0.5μL(25ng)基因组DNA、0.4μL dNTPs(10mmol／L)、2μL10x Taq缓冲液、1.6μLMg2+(25mmol／L)、0.5μL特异引物Mb3a(10μmol／L)、0.5μL配对引物Mb4h(10μmol／L)、0.25μL(5U／μL)的Taq DNA聚合酶和14.25μL水；PCR反应35个循环，每一循环包括94℃变性30s、55℃退火1min和72℃引物延伸2min，35个循环后获得PCR产物2。

[0037] 步骤5，电泳检查与分析：将3μL PCR产物1、3μL PCR产物2、6μL水和1μL上样染料混合，溴化乙锭染色，在120V电压、1.2％琼脂糖胶上进行电泳检查PCR产物，结果如图2所示，有5个植株PCR扩增产物仅出现一条与苹果果实着色性状有关的带1(大小约260bp)，其果实为红色；有1个植株PCR扩增产物仅出现一条与苹果非着色性状等位基因有关的带2(大小约380bp)，故其果实为非红色；有12个植株PCR扩增产物出现一条与苹果果实着色性状有关的带1和一条与苹果非着色性状等位基因有关的带2，其果实为红色。

[0038] 利用前述本发明方法实施步骤中的分子标记以及本实施例中的分子标记，对123株苹果杂交后代基因突变与杂交种子播种5年后结果情况进行分析，结果见表1。可以看出，PCR产物仅出现代表非着色等位基因的较大带时结果率高，PCR产物出现较小带、含有着色等位基因时结果率降低，PCR产物仅出现较小带、含有两个着色等位基因时结果率最低，这说明较大PCR产物带代表的非着色等位基因与苹果早结果性状相关。我们2012年的试验结果证实了这一结论。123株苹果杂交后代中，2012年结果的2株是含非着色等位基因的。

[0039] 表1不同基因型后代植株结果情况

[0040]

[0041] 步骤6，采用步骤3中的引物Mb2f为正向引物、设计引物Mb2R(序列TTCCCTTATTTGTTCCGTTG)为反向引物进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，找出8个苹果品种MdMYB1-1基因转录起始点上游-1616bp、-1603bp和-1573bp位置的突变(表2)。可以看出，利用MdMYB1-1基因转录起始点上游-1616bp和-1573bp位置的突变可鉴别富士苹果非着色性状等位基因Df和嘎拉苹果非着色性状等位基因Dg。利用MdMYB1基因序列设计一个序列为GGTCCGGTTCTATTTCGTAT的特异引物Mb3b，对应于基因转录起始点上游-1573bp位置的突变，用于检测非着色等位基因Dg；另外设计一个序列为ACCGGACCTATCTCATTCG的特异引物Mb4b，对应于基因转录起始点上游-1603bp位置的突变，用于检测果实着色性状；再利用引物Mb2R和上述步骤3中的引物Mb3a作为两个配对引物，形成Mb3a与Mb4b、Mb3b与Mb2R两对引物进行PCR扩增。为便于琼脂糖胶电泳检测，设计引物时注意控制两对引物的PCR扩增产物大小。

[0042] 表28个苹果品种中3个突变位点的核苷酸

[0043]

[0044] 步骤7，PCR扩增：两对引物的PCR反应液(20μL)含有0.5μL(25ng)基因组DNA、0.4μL dNTPs(10mmol／L)、2μL10x Taq缓冲液、1.6μLMg2+(25mmol／L)、0.5μL特异引物Mb4b(10μmol／L)、0.5μL特异引物Mb3b(10μmol／L)、0.5μL配对引物Mb3a(10μmol／L)、0.5μL配对引物Mb2R(10μmol／L)、0.25μL(5U／μL)的Taq DNA聚合酶和13.25μL水；PCR反应35个循环，每一循环包括94℃变性30s、55℃退火1min和72℃引物延伸2min，35个循环后获得PCR产物。

[0045] 步骤8，电泳检查，8个杂交植株电泳结果如图3所示，图中出现代表非着色性状等位基因Dg的PCR产物带和代表着色性状等位基因Dr的PCR产物带。在21个结果植株中，共发现18株出现代表非着色性状等位基因Dg的PCR产物带，其中在步骤5鉴别的13个杂合型结果植株中有11株出现代表非着色性状等位基因Dg的PCR产物带(表3)，表明只有2株含有非着色性状等位基因Df，非着色性状等位基因Dg与早结果性状密切相关。我们2012年的试验结果证实了这一结论。2012年结果的2株是含非着色性状等位基因Dg的。

[0046] 这一结果可用于对金帅、嘎拉苹果杂交后代植株早结果性状进行早期选择，对选出的杂交后代植株加强管理，尽早获得较多的结果植株；也可用于分子设计育种，选择含有金帅、嘎拉苹果非着色等位基因的亲本进行杂交，尽早获得较多的结果植株。

[0047] 表3不同基因型后代植株结果情况

[0048]