一种启动子OsP003、制备方法及其应用

摘要

本发明提供一种启动子OsP003、制备方法及其应用，所述启动子的核苷酸序列为Seq ID No.1所示的核苷酸序列或为与Seq ID No.1互补的核苷酸序列。本发明所述启动子能够用于调控单子叶植物中目的基因的表达，为研究单子叶植物中目的基因表达提供了一种新的工具和选择。

权利要求

1.一种启动子，其特征在于，所述启动子由选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列组成：a、Seq ID No：1所示的核苷酸序列；

b、与Seq ID No：1互补的核苷酸序列；

2.一种核酸构建体，其特征在于，包含权利要求1所述的启动子，以及与启动子可操作连接的基因序列，所述启动子与所述基因序列来源相同或者不同。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体。

4.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3所述的载体；所述重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。

5.一组引物对，其特征在于，所述引物对的两条引物是在Seq ID No：2和Seq ID No：

3的5’端分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。

6.如权利要求5所述的一组引物对，其特征在于，所述引物对的两条引物分别由Seq ID No：4和Seq ID No：5所示的序列组成。

7.一种制备Seq ID No：1所示的启动子的方法，其特征在于，该方法包括，以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，所述扩增引物根据SEQ ID NO：1在水稻日本晴gDNA中的序列分别针对首尾进行设计。

8.一种调控植物中基因表达的方法，其特征在于，该方法包括，将权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3所述的载体或权利要求4的重组农杆菌细胞导入植物愈伤组织，所述植物为水稻。

9.一种制备转基因植物的方法，其特征在于，在有效产生植物的条件下培养植物愈伤组织或植物外植体或植物，所述植物愈伤组织或植物外植体或植物含有权利要求1所述的启动子或权利要求2所述的核酸构建体或权利要求3所述的载体或权利要求4所述的重组农杆菌细胞，所述植物为水稻。

10.根据权利要求1所述启动子或权利要求2所述核酸构建体或权利要求3所述载体或权利要求4的重组农杆菌细胞在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途，所述植物为水稻。

说明书

一种启动子OsP003、制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及植物基因工程和生物技术领域，特别涉及一种启动子，以及该启动子的制备方法和应用。

背景技术

[0002] 启动子是指基因中一段可与RNA聚合酶及其它一些影响转录的反式因子结合实现精确有效起始转录的DNA序列。植物基因表达（转录）的起始时间和表达的程度受启动子的控制，启动子的克隆及功能分析是植物基因表达调控研究的重要内容，也是植物基因工程研究的一个重要方面。

[0003] 根据启动子的转录模式可将其分为3类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子。所谓组成型启动子是指在组成型启动子调控下，不同组织器官和发育阶段的基因表达没有明显差异，因而称之组成型启动子。双子叶植物中最常使用的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子。，双子叶植物中的一些强效启动子如CsVMV(Cassava VeinMosaic Virus)启动子、番茄E8启动子、白藜芦醇合酶基因Vst1启动子等高效启动子，在单子叶植物中也有很强的基因调控作用。

[0004] 人们高度重视从植物本身克隆组成型启动子。例如肌动蛋白(actin)和泛素(ubiquitin)等基因的启动子已被克隆。用这些启动子代替CaMV35S启动子，可以更有效地在单子叶植物中驱动外源基因的转录。Naomi等分别从拟南芥的色氨酸合酶β亚基基因和植物光敏色素基因中克隆了相应启动子，用其代替CaMV35S启动子，在转基因烟草中也取得了很好的表达效果(Plant biotechnology，2002，19(1)：19-26)。

[0005] 单子叶 植物基 因中常 见的启 动子有：Ubi启动 子(Plant ubiquitin promoter)、Actin启动子(Plant Actin promoter)和Adh-1启动子(Maize alcohol dehydrogenase1promoter)。Ubi启动子以其启动效率高、甲基化程度低、遗传性状稳定等因素而倍受青睐。目前，已经从很多泛素基因中分离得到启动子序列，包括玉米基因组中的Ubi-1启动子、水稻泛素RUBQ2启动子、拟南芥泛素启动子、向日葵泛素UbB1启动子、烟草泛素Ubi.U4启动子、马铃薯泛素Ubi7启动子、番茄泛素Ubi1-1启动子，大麦泛素Mub1启动子。玉米泛素Ubi-1启动子已经广泛地应用于玉米、小麦、水稻等单子叶植物中，水稻泛素RUBQ2启动子在水稻和甘蔗中也有较多的应用。Actin启动子1990年由康奈尔大学的McElroy等首次在水稻中发现，属于强组成型启动子。Actin启动子在单子叶禾本科中作用显著，但是邻近科属的植物中的基因调控功能却十分不理想。因此，许多相关研究通过其他单子叶植物寻找Actin启动子，并成功在香蕉、甜瓜、玉米和拟南芥中陆续发现。Actin启动子由于对基因表达的强调控作用，在单子叶植物优良性状的转基因中已经得到越来越广泛的应用。Adh-1启动子调控ADH(alcohol dehydrogenase)基因，对植物在缺氧环境下乙醇脱氢酶的表达至关重要。Adh-1启动子对单子叶植物特别是谷类植物如水稻、燕麦和大麦，和少部分双子叶植物如烟草，基因的调控功能比CaMV(花椰菜花叶病毒CaMV)35S启动子提高10-50倍。Adh-1启动子主要应用于单子叶植物，对绝大部分双子叶植物基因表达的调控效果都很有限。

发明内容

[0006] 本发明通过对水稻基因组的深入研究，提供了一种新的启动子OsP003，所述启动子能够用于调控单子叶植物中目的基因的表达，同时为研究单子叶植物中目的基因表达提供了一种新的工具和选择。

[0007] 本发明的目的是提供一种新的启动子，能够在植物中调控基因的表达。

[0008] 本发明的又一目的是提供一种含有上述启动子的核酸构建体、载体、重组细胞及植物愈伤组织、植物外植体或植物。

[0009] 本发明的再一目的是提供一种制备上述启动子的引物、制备方法，以及利用该启动子调控植物中基因表达的方法。

[0010] 本发明的再一目的是提供一种转基因植物的制备方法，以及上述启动子、核酸构建体、载体、重组细胞、或植物愈伤组织或植物外植体或植物在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途。

[0011] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

[0012] 本发明公开了一种启动子，该启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：

[0013] a、Seq ID No.1所示的核苷酸序列；

[0014] b、与Seq ID No.1互补的核苷酸序列；

[0015] c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

[0016] d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；

[0017] e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

[0018] 本发明还公开了一种核酸构建体，包含上述启动子，以及与启动子可操作连接的基因序列，上述启动子与基因序列来源相同或者不同。

[0019] 本发明还公开了一种载体，该载体含有上述启动子或核酸构建体，优选地，该载体为上述启动子或上述的核酸构建体与pMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体。

[0020] 本发明还公开了一种重组细胞，该重组细胞含有上述的启动子或核酸构建体或载体，优选地，该重组细胞为重组大肠杆菌细胞或重组农杆菌细胞。

[0021] 本发明还公开了含有上述启动子、核酸构建体、载体或重组细胞的植物愈伤组织、植物外植体或植物，该植物优选为单子叶植物，再优选为稻属，更优选为水稻，进一步优选为水稻日本晴。

[0022] 本发明还公开了一组引物对，用于扩增得到上述启动子，该引物对的两条引物分别含有Seq ID No：2和Seq ID No：3所示的序列，优选地，该两条引物在5’端还分别连接有限制性酶切位点和/或保护碱基，更优选地，该引物对的两条引物分别具有Seq ID No：4和Seq ID No：5所示的序列。

[0023] 本发明还公开了一种制备Seq ID No.1启动子的方法，该方法包括，以水稻日本晴基因组DNA为模板，使用一对扩增引物进行扩增，该扩增引物根据SEQ ID NO：1在水稻日本晴基因组gDNA中的序列分别针对首尾进行设计，扩增引物为上述技术方案所述的引物对。

[0024] 本发明还公开了一种调控植物中基因表达的方法，该方法为，将上述启动子、核酸构建体、载体或重组细胞导入植物细胞；优选导入植物愈伤组织；优选地，植物愈伤组织是通过上述启动子、核酸构建体或载体的重组农杆菌转化的；优选地，植物为单子叶植物，再优选为稻属，更优选为水稻，进一步优选为水稻日本晴。

[0025] 本发明还公开了一种制备转基因植物的方法，为：在有效产生植物的条件下培养上述的重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体或植物；优选地，植物愈伤组织或植物外植体或植物含有上述启动子或核酸构建体或载体或重组细胞；该植物优选为单子叶植物，再优选为稻属，更优选为水稻，更优选为粳稻，进一步优选为水稻日本晴。

[0026] 本发明还公开了上述启动子、核酸构建体、载体、重组细胞或植物愈伤组织或植物外植体或植物在调控植物中目的基因表达或植物育种中的用途，优选植物是单子叶植物，再优选的植物为稻属，更优选植物为水稻，进一步优选植物为水稻日本晴。

[0027] 由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于：

[0028] 本发明提供的新的启动子能够在植物中调控基因表达，并且，在单子叶植物如水稻幼苗的根、幼苗等中具有启动子功能，而在成熟植株中没有检测出启动子的功能，能够调控外源基因的表达，从而为研究单子叶植物中目的基因的表达提供了一种新的工具和选择。

附图说明

[0029] 图1为用于构建p8质粒的pGAMBIA-1301质粒示意图；

[0030] 图2为p8质粒示意图；

[0031] 图3为经转化的水稻愈伤组织的GUS染色结果；3-a：带有本发明所述启动子P003序列的重组根癌农杆菌p8+P003转化的水稻愈伤组织；3-b：不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻愈伤组织；

[0032] 图4为经转化的水稻幼苗的GUS染色结果；4-a：带有本发明所述启动子P003序列的重组根癌农杆菌p8+P003转化的水稻幼苗；4-b：不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻幼苗；

[0033] 图5为经转化的水稻根的GUS染色结果；5-a：带有本发明所述启动子P003序列的重组根癌农杆菌p8+P003转化的水稻根；5-b：不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻根。

具体实施方式

[0034] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

[0035] 本发明提供一种能够在植物中调控基因表达的启动子序列，该启动子含有选自以下任意一组并具有启动子功能的核苷酸序列：

[0036] a、Seq ID No.1所示的核苷酸序列；

[0037] b、与Seq ID No.1互补的核苷酸序列；

[0038] c、在高等严紧条件下能够与上述a或b的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；

[0039] d、对上述a或b所示核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列；

[0040] e、与上述a或b所示核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列。

[0041] 本发明中，术语“单子叶植物”具体地可以为稻属植物例如水稻，包括但不限于日本晴、中花10、中花11、丹江8号、云稻2号、皖稻90、皖稻92、皖稻201、津原101、汕优608等。

[0042] 在本发明中，所述的高等严紧条件下与Seq ID No.1所示或与其互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，其具有与Seq ID No.1所示核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

[0043] 在本发明中，所述对Seq ID No.1或与其互补的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5＇端和/或3＇端，和/或序列内部进行例如不超过2-45个，或不超过3-20个，或不超过4-15个，或不超过5-10个，或不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取代、缺失、添加修饰。

[0044] 在本发明中，所述对Seq ID No.1或与其互补的核苷酸序列进行如上述行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列，具有与Seq ID No.1所示的核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

[0045] 通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列，例如与Seq ID No.1的参考核苷酸序列至少90％同一性是指：在Seq ID No.1的参考核苷酸序列的每100个核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达10个核苷酸的不同外，该多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。即为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少90%相同的多核苷酸，参考序列中多达10%的核苷酸可以被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列总核苷酸的10%；或在一些核苷酸中，存在删除、插入和替换的组合。

[0046] 在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法，以BLAST和BLAST2.0算法为例，它们分别描述在Altschul等（1977）Nucl.Acid.Res.25:3389-3402和Altschul等（1990）J.Mol.Bio.215:403-410。采用文献中所述或默认参数，BLAST和BLAST2.0可用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。

[0047] 在本发明中，所述与Seq ID No.1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列，包括与Seq ID No.1或与其互补的核苷酸序列所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如，当采用标准参数的BLAST分析时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少90％序列同一性，优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性的那些序列。在本发明中，所述与Seq ID No.1所示核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列具有至少90％同一性的核苷酸序列具有与Seq ID No.1所示核苷酸序列相同或相似的启动子活性。

[0048] 本发明还公开了一种核酸构建体，包括上述启动子，以及与该启动子可操作连接的基因序列。“可操作连接”是指两个或多个核苷酸区域或核苷酸序列的功能性空间排列。在本发明的核苷酸构建体中，启动子被置于基因核酸序列的某个特定位置，所述基因一般是需要提高转录水平的任何核酸序列，或者，可设计本发明所述启动子和基因以便下调特定核酸序列。即通过将启动子与反义方向基因相连来实现。在本发明一个具体的实施方式中，所属基因优选为GUS基因。

[0049] 本发明还涉及一种含有上述启动子或上述核酸构建体的载体。本发明的载体可以是通过将上述启动子或上述核酸构建体插入到克隆载体或表达载体而得到的重组载体。适于构建本发明所述重组载体的表达载体。在本发明具体实施方式中，本发明含有所述启动子的载体为上述启动子与pMD18-T或p8质粒经重组得到的重组载体，优选的，本发明的重组载体为pMD18-T+P003重组载体或者p8+P003重组载体。

[0050] 本发明进一步涉及含有本发明所述启动子、核酸构建体或载体的重组细胞。本发明的重组细胞可以通过将上述含有本发明所述启动子的重组载体转化宿主细胞而得到的。适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如：大肠杆菌细胞，根癌农杆菌细胞等。在本发明一个具体的实施方式中，所述重组细胞为重组根癌农杆菌。

[0051] 本发明进一步公开了一种植物愈伤组织或植物外植体或植物，所述愈伤组织、植物外植体或植物含有本发明的上述启动子、核酸构建体、载体或重组细胞。本发明的植物愈伤组织是单子叶植物愈伤组织，如水稻愈伤组织。

[0052] 本发明还进一步涉及用于PCR扩增得到本发明所述启动子的一组引物对，该组引物对含有序列表中Seq ID No：2和Seq ID No：3所示的序列。为了便于操作，通常优选在引物的5’端还设计连接有限制性酶切位点和/或保护碱基。在本发明具体实施方式中，所述引物对的两条引物分别具有Seq ID No：4和Seq ID No：5所示的序列。

[0053] 采用上述引物，以水稻日本晴基因组DNA为模板进行PCR扩增，能够制备得到本发明的启动子。

[0054] 本发明还进一步公开了一种调控植物中基因表达的方法，该方法包括：将上述启动子、核酸构建体、载体或重组细胞导入植物细胞。优选的是通过将同时含有外源基因以及本发明启动子的核酸构建体导入植物细胞来达到调控基因表达的目的。所述核酸构建体中，外源基因与本发明所述的启动子可操作地连接。在本发明优选的实施方式中，可利用含有目的外源基因与本发明启动子的重组载体转化农杆菌，再将得到的重组农杆菌转化植物愈伤组织，从而实现将所述外源基因与本发明启动子一起导入植物细胞的目的。在本发明一个具体的实施方式中，外源基因优选为GUS基因。本发明的植物为单子叶植物。

[0055] 在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因及所述启动子插入到植物基因中，包括农杆菌介导转化、病毒介导转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物的基因转化，但其转化技术也可用于本发明启动子和外源基因的导入。当然，适于本发明的启动子和外源基因导入的另一种方法是粒子轰击，（即显微金或钨粒子包覆转化的DNA）胚性愈伤组织或胚胎开发。另外，还可以采用的转化植物细胞的方法是原生质体转化。金银转化后，采用通用的方法来筛选和再生整合有表达单元的植株。

[0056] 本发明的启动子及调控植物中基因表达的方法，可以应用于植物品种的选育。例如，可用于水稻的育种。在本发明的一个具体实施方式中，所述水稻为日本晴。

[0057] 本发明所述的启动子可称为一种新的启动子，作为植物（特别是单子叶植物）转基因的工具启动子，为开展低表达基因转化苗筛选、植物花器官败育等分子育种研究提供便利，从而极大地缩短优良品种的选育时间。

[0058] 本发明中，单子叶植物具体可以为禾本科植物，更具体的，可为稻属植物，例如水稻，包括但不限于日本晴。

[0059] 下面通过具体实施方式结合附图对本发明做进一步详细说明。但本领域技术人员应理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为对本发明范围的限定。实施例中未注明的具体技术或条件，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如，参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社），或按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可通过市购获得的常规产品。

[0060] 实施例1：P003启动子片段的PCR扩增和pMD18-T+P003重组载体的构建。

[0061] 一、P003启动子片段的PCR扩增：

[0062] 使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录号：DP320-02)提取水稻日本晴(已在申请号为200910238992.0、发明名称为“一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途”的发明申请中保藏，并于2010年9月22日公开，保藏编号为CCTCC NO：P200910)的基因组DNA，根据该启动子在水稻日本晴gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物F1，加限制性酶切位点EcoR I和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点SbfI和保护碱基)。以上述提取的水稻日本晴的gDNA为模板，使用高保真Ex Taq(TaKaRa，DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表1所示。

[0063] 表1基因启动子扩增的PCR体系

[0064]

[0065] PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后以94℃变性45s，55℃退火50s，72℃延伸90s，进行35个反应循环，最后72℃延伸7min。

[0066] 其中，上游引物F1(SEQ ID NO：4)：

[0067] GGAATT ，其中下划线代表EcoR I酶切位点，方框内为SEQ ID No：2。下游引物R1(SEQ ID NO：5)：

[0068] TGCCTGCAGG ，其中下划线代表SbfI酶切位点，方框内为SEQ ID No：3。

[0069] PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小约为3155bp左右的条带，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（目录号：DP209-03）进行纯化回收。

[0070] 二、pMD18-T+P003重组载体的构建：

[0071] 将如上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明准确。其中，T/A克隆的连接条件如表2。

[0072] 表2T/A克隆的连接条件

[0073]

[0074] 于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上，得到pMD18-T+P003重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌：

[0075] 从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化钙法制备的感受态细胞100μl DH5α(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：上海生工购得)，冰上融化后，加入10μl如上所得的连接产物，即pMD18-T+P003重组载体，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl4℃预冷的SOC培养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，用剩下的150μl上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37℃倒置培养16h-24h。获得含有pMD18-T+P003克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5α-P003。深圳华大基因科技有限公司对pMD18-T+P003克隆载体中的P003进行测序。

[0076] 测序结果表明，获得的pMD18-T+P003克隆载体中P003启动子序列正确。P003启动子的序列如序列表中Seq ID No：1所示。

[0077] 实施例2：载体-p8+P003重组载体的构建。

[0078] 一、p8质粒构建：

[0079] 本发明中所使用的p8质粒是由pCAMBIA-1301质粒(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，该公司的pCAMBIA-1301质粒的原始来源是The CAMBIA Bios(biological open source)Licensee，Australia)按照如下方式改造并构建的，具体说明如下：

[0080] 用Kpn I/Nco I(NEB)双酶切质粒pCAMBIA-1301(参见图1)，回收大片段。根据所采用的限制性内切酶位点合成如下序列：

[0081] GGTACCAAGCTTACTAGTCCTGCAGGTCTAGAGGATCCGTCGACCATG G(SEQ ID NO：6)( 包含的酶切位点是Kpn I/HindIII/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/SalI/Nco I)，用Kpn I/Nco I双酶切后回收，与上述所回收的大片段连接后转化top10细胞(中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例如：北京索莱宝科技有限公司购得)。用引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT(SEQ ID NO：7)/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(SEQ ID NO：8)筛选转化子，通过PCR检测方法，带有扩增片段为350bp的转化子即为含有需要构建的多克隆位点及GUS序列的p8质粒的转化子。P8质粒图谱见图2。

[0082] 所述p8质粒中的多克隆位点和GUS序列的长度2353碱基，如SEQ ID NO：9所示：

[0083] GTTGGCAAGCTGCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGCTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTAC GAGCTC AAGCTT CG GGATCC CATGGTAGATCTGAGGGTAAATTTCTAGTTTTTCTCCTTCATTTTCT
TGGTTAGGACCCTTTTCTCTTTTTATTTTTTTGAGCTTTGATCTTTCTTTAAACTGATCTATTTTTTAATTGATTGGTTATGGTGTAAATATTACATAGCTTTAACTGATAATCTGATTACTTTATTTCGTGTGTCTATGATGATGATATCCGTCCTGTAGAAACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAACTCGACGGCCT
GTGGGCATTCAGTCTGGATCGCGAAAACTGTGGAATTGATCAGCGTTGGTGGGAAAGCGCGTTACAAGAAAGCCGGGCAATTGCTGTGCCAGGCAGTTTTAACGATCAGTTCGCCGATGCAGATATTCGTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATCAGCGCGAAGTCTTTATACCGAAAGGTTGGGCAGGCCAGCGTATCGTGCTGCGTTTCGATGCGGTCACTCATTACGGCAAAGTGTGGGTCAATAATCAGGAAGTGATGGAGCATCAGGGCGGCTATACGCCATTTGAAGCCGATGTCACGCCGTATGTTATTGCCGGGAAAAGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAACAACGAACTGAACTGGCAGACTATCCCGCCGGGAATGGTGATTACCGACGAAAACGGCAAGAAAAAGCAGTCTTACTTCCATGATTTCTTTAACTATGCCGGAATCCATCGCAGCGTAATGCTCTACACCACGCCGAACACCTGGGTGGACGATATCACCGTGGTGACGCATGTCGCGCAAGACTGTAACCACGCGTCTGTTGACTGGCAGGTGGTGGCCAATGGTGATGTCAGCGTTGAACTGCGTGATGCGGATCAACAGGTGGTTGCAACTGGACAAGGCACTAGCGGGACTTTGCAAGTGGTGAATCCGCACCTCTGGCAACCGGGTGAAGGTTATCTCTATGAACTCGAAGTCACAGCCAAAAGCCAGACAGAGTCTGATATCTACCCGCTTCGCGTCGGCATCCGGTCAGTGGCAGTGAAGGGCCAACAGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACTTTACTGGCTTTGGTCGTCATGAAGATGCGGACTTACGTGGCAAAGGATTCGATAACGTGCTGATGGTGCACGACCACGCATTAATGGACTGGATTGGGGCCAACTCCTACCGTACCTCGCATTACCCTTACGCTGAAGAGATGCTCGACTGGGCAGATGAACATGGCATCGTGGTGATTGATGAAACTGCTGCTGTCGGCTTTCAGCTGTCTTTAGGCATTGGTTTCGAAGCGGGCAACAAGCCGAAAGAACTGTACAGCGAAGAGGCAGTCAACGGGGAAACTCAGCAAGCGCACTTACAGGCGATTAAAGAGCTGATAGCGCGTGACAAAAACCACCCAAGCGTGGTGATGTGGAGTATTGCCAACGAACCGGATACCCGTCCGCAAGGTGCACGGGAATATTTCGCGCCACTGGCGGAAGCAACGCGTAAACTCGACCCGACGCGTCCGATCACCTGCGTCAATGTAATGTTCTGCGACGCTCACACCGATACCATCAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAACCGTTATTACGGATGGTATGTCCAAAGCGGCGATTTGGAAACGGCAGAGAAGGTACTGGAAAAAGAACTTCTGGCCTGGCAGGAGAAACTGCATCAGCCGATTATCATCACCGAATACGGCGTGGATACGTTAGCCGGGCTGCACTCAATGTACACCGACATGTGGAGTGAAGAGTATCAGTGTGCATGGCTGGATATGTATCACCGCGTCTTTGATCGCGTCAGCGCCGTCGTCGGTGAACAGGTATGGAATTTCGCCGATTTTGCGACCTCGCAAGGCATATTGCGCGTTGGCGGTAACAAGAAAGGGATCTTCACTCGCGACCGCAAACCGAAGTCGGCGGCTTTTCTGCTGCAAAAACGCTGGACTGGCATGAACTTCGGTGAAAAACCGCAGCAGGGAGGCAAACAAGCTAGCCACCACCACCACCACCACGTGTGA(SEQ ID NO:9)

[0084] 如上序列所示本发明中所构建的p8质粒，其多克隆位点中的EcoRI/Sac I/KpnI/HindIII/Spe I/Sbf I/Pst I/Xba I/BamH I/SalI/Nco I限制性酶切位点分别用加框和下划线表示，筛选转化子所用的引物GCTTCCGGCTCGTATGTTGT/GAGTCGTCGGTTCTGTAAC(即SEQ ID NO：7和8)用双下划线表示，GUS序列用斜体表示，其内含子序列分别用斜体加底纹示出。

[0085] 二、重组载体p8+P003的构建：

[0086] 根据限制性内切酶KpnI和SbfI操作说明，按照如下条件处理实施例1中所得到的克隆载体pMD18-T+P003，以及如上所述构建的p8质粒。

[0087] 其中，克隆载体pMD18-T+P003及p8质粒的酶切条件如下（表3）：

[0088] 表3克隆载体pMD18-T+P003及p8质粒的酶切条件

[0089]

[0090] 使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号：DP209-03)分别回收经酶切的p8质粒，以及启动子P003插入片段，根据T4连接酶(TaKaRa，D2011A)操作说明，按照如下（表4）条件进行连接：

[0091] 表4连接条件

[0092]

[0093] T4buffer冰上融化，酶切后的p8质粒载体加入量约20ng，本发明中的P003片段加10ng。于16℃在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接8h以上。

[0094] 将100μl氯化钙法制得的感受态细胞DH5α从超低温冰箱取出，冰上融化后，加入10μl上面的连接产物，轻轻搅匀，冰浴30min，42℃热激60s，冰浴5min，加入600μl4℃预冷的SOC，37度220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150μl，轻轻吹匀，玻璃珠涂布LB(kan)，37℃倒置培养16-24h。得到重组载体p8+P003。

[0095] 分别以F1(即SEQ ID NO：4)和R1(即SEQ ID NO：5)为引物对所得重组载体p8+P003进行PCR检测，以确证所得重组载体p8+P003中含有所需启动子P003。通过KpnI和SbfI酶切筛选含有重组载体p8+P003转化子。

[0096] 实施例3：重组根癌农杆菌EHA105-P003细胞的制备。

[0097] 将如实施例2所述方法构建的p8+P003重组载体和作为对照的p8质粒分别转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌EHA105(已在申请号为200910238992.0、发明名称为“一种启动子BgIosP587、其制备方法及用途”的发明申请中保藏，并于2010年9月22日公开，保藏编号为CCTCC NO：M209315)的感受态细胞，具体方法如下：

[0098] 将根癌农杆菌感受态细胞EHA105于超低温冰箱中取出，至于冰上解冻。融化后，分别加入5μl的p8+P003重组载体和p8质粒以及作为对照的p8空载体，轻轻混匀，冰浴10min，放入液氮中冷冻5min，37℃解冻5min，加入800μl常温的LB液体培养基，28℃160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下200μl吹匀，涂布于加有kan-rif(卡那霉素-利福平)双抗的YM固体培养基平板上(50mg/lKan，10mg/l Rif，具体配方参见表7)。28℃倒置培养2-3天。

[0099] 以F1(即SEQ ID NO：4)和R1(即SEQ ID NO：5)为引物进行PCR检测和通过EcoRI/SbfI酶切筛选转化子。PCR扩增出约3155bp左右条带和酶切出约3155bp左右条带的为重组载体p8+P003的重组根癌农杆菌。

[0100] 本发明中，按照如上述方法得到的带有重组载体p8+P003的重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-P003。

[0101] 按照本发明所述方法，得到的带有p8质粒的对照重组农杆菌，命名为重组根癌农杆菌EHA105-p8。

[0102] 实施例4：水稻愈伤组织的诱导和转化。

[0103] 按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组根癌农杆菌EHA105-P003和重组根癌农杆菌EHA105-p8转化所述愈伤组织。

[0104] （1）将水稻日本晴种子去壳，70％乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1.5％的次氯酸钠消毒30min，期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于N6D培养基(具体配方参见表5)上，用封口膜封口；29.5℃光照培养3-4周；

[0105] （2）选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径1-3mm)，在新N6D培养基上29.5℃光照培养3天；

[0106] （3）分别挑取如实施例3所构建的重组根癌农杆菌单菌落(重组根癌农杆菌EHA105-P003或重组根癌农杆菌EHA105-p8)，于添加抗生素(50mg/lKan，10mg/lRif)的YM固体培养基(具体配方参见表7)上划线培养3天，培养温度28℃；分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了30μl100mM的AS(Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM培养基(具体配方参见表8)中，温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞(重组根癌农杆菌EHA105-P003或重组根癌农杆菌EHA105-p8)；

[0107] （4）将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将如步骤3制备的重组根癌农杆菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min；

[0108] （5）倒掉重组根癌农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于N6-AS培养基(具体配方参见表9)上放一张灭菌滤纸，加1ml如上述含AS的AAM培养基，将愈伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，28℃暗培养48～60h；

[0109] （6）将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含1mg/l潮霉素B(HmB)和50mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周。

[0110] 实施例5：水稻愈伤组织中的GUS的表达。

[0111] 为检测经过实施例4所述转化的水稻愈伤组织中目的基因GUS的表达情况，按照Chen S Y等在Journal of Integrative Plant Biology，2008，50(6)：742-751所述的方法，对分别用重组根癌农杆菌EHA105-P003或重组农杆菌EHA105-p8转化的水稻愈伤组织进行染色。

[0112] GUS染色液的配方(1ml)：610μl0.2M Na2HPO4溶液(pH＝7.0)；390μl0.2M NaH2PO4溶液和10μl0.1M X-gluc。

[0113] 将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P003或重组根癌农杆菌EHA105-p8转化的水稻愈伤组织浸泡在GUS染色液中，37℃保温至出现蓝色，拍照，结果如图3所示，经含有启动子的p8+P003重组载体的重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图3-a)经染色后呈现蓝色，经不含有启动子的p8质粒重组根癌农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(作为对照，图3-b)经GUS染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明的P003启动子对GUS基因表达具有调控作用。

[0114] 实施例6：转基因水稻苗中GUS的表达

[0115] 将第四步中得到的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B(HmB)的MS-R分化培养基(具体配方见表14)分化苗；用封口膜密封培养皿，29.5℃光照培养3-4周；待幼苗长至3-4cm时转移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表15)进行生根筛选。

[0116] 转基因水稻苗的GUS染色过程如下，GUS染色液同第五步中水稻愈伤GUS染色液：

[0117] 1、经转化的水稻幼苗的GUS染色：

[0118] 将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P003或重组根癌农杆菌EHA105-p8转化的水稻幼苗浸泡在GUS染色液中，37℃保温24小时，将幼苗取出，浸入75%的酒精中进行脱色，脱去幼苗叶片的绿色，便于观察出现的蓝色，拍照，结果如图4所示，由带有本发明所述启动子P003序列的重组根癌农杆菌p8+P003转化的水稻幼苗(图4-a)经GUS染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻幼苗(对照，图4-b)经GUS染色后颜色未发生变化。

[0119] 2、经转化的水稻根的GUS染色：

[0120] 将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P003或重组根癌农杆菌EHA105-p8转化的水稻根浸泡在GUS染色液中，37℃保温24小时，取出拍照，结果如图5，由带有本发明所述启动子P003序列的重组根癌农杆菌p8+P003转化的水稻根(图5-a)经GUS染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻根(对照，图5-b)经GUS染色后颜色未发生变化。

[0121] 3、经转化的水稻花药的GUS染色：

[0122] 将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P003或重组根癌农杆菌EHA105-p8转化的水稻花药浸泡在GUS染色液中，37℃保温24小时，取出拍照，由带有本发明所述启动子P003序列的重组根癌农杆菌p8+P003转化的水稻花药经GUS染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻花药经GUS染色后颜色未发生变化。

[0123] 4、经转化的水稻颖壳的GUS染色：

[0124] 将分别用重组根癌农杆菌EHA105-P003或重组根癌农杆菌EHA105-p8转化的水稻颖壳浸泡在GUS染色液中，37℃保温24小时，取出拍照，结果如下：由带有本发明所述启动子P003序列的重组根癌农杆菌p8+P003转化的水稻颖壳经GUS染色后呈现蓝色；不带有本发明启动子序列的重组根癌农杆菌p8质粒的水稻颖壳经GUS染色后颜色未发生变化。

[0125] 结果显示，本发明的P003启动子对GUS基因表达具有调控作用。

[0126] 本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下：

[0127] 以下有关培养基中所称的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌：121℃下蒸气灭菌20分钟。

[0128] 表5N6D培养基

[0129]

[0130]

[0131] 用1N氢氧化钾调节pH值到5.8，封口后按常规方法灭菌。

[0132] N6macro母液(20X)：硝酸钾56.60g，磷酸二氢钾8.00g，硫酸铵9.26g，硫酸镁3.70g，氯化钙3.32g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

[0133] N6micro母液(1000X)：碘化钾0.80g，硼酸1.60g，硫酸锰3.33g，硫酸锌1.50g，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

[0134] 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)：将3.73g乙二铵四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)和2.78g FeSO4.7H2O分别溶解，混合并用。用蒸馏水定容至1000ml，70℃温浴2h，冷却后4℃保存不超过1个月。

[0135] N6维生素贮存液(1000X)：维生素B10.10g，维生素B60.05g，烟酸0.05g，甘氨酸0.20g，加蒸馏水定容至100ml，过滤除菌，4℃保存不超过1周。

[0136] 表6YM液体培养基(含有50mg/L Kan，10mg/L Rif)：

[0137]

[0138] 表7YM固体培养基（含有50mg/L Kan，10mg/L Rif）

[0139]

[0140] 表8AAM培养基

[0141]

[0142]

[0143] 加1N氢氧化钾调节pH值至5.2，常规灭菌。

[0144] AAM macro(10X)：2.5g七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)，1.5g二水氯化钙(CaCl2·2H2O)，1.33g二水磷酸二氢钠(NaH2PO4.2H2O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

[0145] AAM micro(100X)：0.7g单水硫酸锰(MnSO4·H2O)，0.2g七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)，0.075g碘化钾(KI)，0.3g硼酸(H3BO3)，25mg二水钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)，2.5mg五水硫酸铜(CuSO4.5H2O)，2.5mg六水氯化钴(CoCl2.6H2O)，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

[0146] AAM有机(1000X)：0.75g甘氨酸(Glycine)，0.1g烟酸(Nicotinic acid)，0.1g VB6(Pyridoxine)，1g VB1(Thiamine)，蒸馏水定容至100ml，4℃保存备用。

[0147] 铁盐(Fe2EDTA)贮存液(100X)：见表5。

[0148] 表9N6-AS共培养基

[0149]

[0150]

[0151] 表10MS-R分化培养基

[0152]

[0153]

[0154] 表111/2MS生根培养基

[0155]

[0156] MS大量元素(20X）：33g硝酸铵（NH4NO3），38g硝酸钾（KNO3），8.8g二水氯化钙（CaCl2·2H2O），7.4g七水硫酸镁（MgSO4·7H2O），3.4g磷酸二氢钾（KH2PO4），蒸馏水逐一溶解，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

[0157] MS微量元素(1000X）：0.83g碘化钾（KI），6.2g硼酸（H3BO3），22.3g四水硫酸锰（MnSO4·4H2O），8.6g七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O），0.25g二水钼酸钠（Na2MoO4·2H2O），0.025g五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）0.025g六水氯化钴（CoCl2·6H2O），蒸馏水逐一溶解，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

[0158] MS有机成分(1000X）：0.5g烟酸，0.5g盐酸吡哆醇(维生素B6)，0.5g盐酸硫胺素(维生素B1)，2g甘氨酸，蒸馏水逐一溶解，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。

[0159] 铁盐(100X）：见表5

[0160] 肌醇（500X）：50g肌醇蒸馏水溶解，蒸馏水定容至1L，4℃保存备用。