一种提高红法夫酵母产虾青素的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，提供了一种利用可燃性气体传感器恒定控制红法夫酵母发酵液中乙醇浓度，进而提高红法夫酵母细胞中虾青素含量的方法，本方法利用可燃性气体传感器，通过开关蠕动泵控制乙醇流加量，成功地恒定控制了红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度在1~20g/L范围内的任意值。在恒定控制红法夫酵母发酵液中乙醇浓度为10g/L的情况下，再经过1天的培养，红法夫酵母细胞干重中的虾青素含量可以达到145.7 μg/g，比对照在没有流加乙醇的条件下提高了140.4%，从而达到了红法夫酵母高产虾青素的目的，具有重要的研究价值和广泛的应用前景。

权利要求

1.一种提高红法夫酵母产虾青素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

a.制备发酵培养基，其中，发酵培养基组成成分为蔗糖80、酵母粉20、KH2PO4 3、Na2HPO4

1、MgSO4 3、CaCl2 1，所述组成成分的单位为g/L，经121℃灭菌20min，待冷却至20℃后接种红法夫酵母，接种量为7％；

b.制备红法夫酵母发酵液，采用三联7升全自动发酵罐，控制培养体积3L、培养温度

20℃、搅拌转速800rpm和曝气量体积比为1:1，采用pH计探头在线全自动流加100g/L NaOH溶液或2mol/L盐酸溶液控制pH值为4.9～5.1之间；

c.控制红法夫酵母发酵液中乙醇浓度，当红法夫酵母的生长进入指数生长末期时，利用可燃性气体传感器，通过开关蠕动泵控制乙醇流加量，恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度从1g/L到20g/L的任意值；

所述步骤c中具体恒定控制过程如下：将与可燃性气体传感器中气敏元件串联的电阻两端输出电压分别设定为1.40V、1.56V和1.70V，发酵液中的乙醇浓度由于乙醇被红法夫酵母利用而降低，发酵罐排出空气中的乙醇浓度也降低，导致可燃性气体传感器中气敏元件的电阻增加，使与气敏元件串联的电阻输出电压降低，当输出电压降低到设定值时，继电器自动打开蠕动泵向发酵罐内流加乙醇，随着发酵液中乙醇浓度的增加，发酵罐排出空气中的乙醇浓度也增加，导致可燃性气体传感器中气敏元件的电阻降低，使与气敏元件串联的电阻输出电压的增加，当输出电压增加到设定值时，继电器自动关闭流加乙醇的蠕动泵，停止流加乙醇；

恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度为10g/L。

说明书

一种提高红法夫酵母产虾青素的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，特别是提供了一种在红法夫酵母高密度发酵培养过程中提高红法夫酵母细胞中天然虾青素含量的方法，对于采用红法夫酵母高效生产天然虾青素具有重要的研究价值和广泛的应用前景。

背景技术

[0002] 虾青素(astaxanthin)全称为3，3′-二羟基-β，β′-胡萝卜素-4，4′-二酮(3，3′-dihydroxy-β，β′-carotene-4，4′-dione)，分子式为C40H52O4，相对分子质量为596.86，是一种类胡萝卜素的含氧衍生物，属于酮式类胡萝卜素，虾青素的化学结构式如下：

[0003]

[0004] 虾青素具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗光敏、清除机体自由基和预防心脑血管疾病等多种生物学活性，其抗氧化能力比β-胡萝卜素高10倍，比α-生育酚（维生素E）高100倍以上，被誉为“超级维生素E”。虾青素是唯一能够通过血脑屏障的类胡萝卜素，可有效预防和治疗“年龄相关性黄斑变性”白内障等眼部疾病。虾青素有助于甲壳类动物和鱼类（如蛙鱼、鲟鱼、虹鳟鱼等）的着色，比其他类胡萝卜素如角黄质、叶黄素和玉米黄素等更容易吸收和积累。因此，虾青素在食品、药品、化妆品和水产养殖等方面具有广泛的应用前景。

[0005] 目前，虾青素的生产主要有化学合成和生物中提取两种方法。化学合成虾青素的过程复杂，而且产物大多为顺式结构，不是天然的反式结构，因此生物利用率较低，同时在其稳定性、着色性、安全性和生物效价等方面的效果也较差。提取虾青素的主要生物物种是甲壳类动物、雨生红球藻和红法夫酵母（Phaffia rhodozyma，也称 Xanthophyllomyces dendrorhous）。甲壳类动物体内虾青素含量低，不适合作为大规模生产天然虾青素的来源。虽然雨生红球藻细胞中的虾青素含量较高，可以达到细胞干重的0.2%~2.0%，但是培养周期长达15天以上，且生物量低（细胞干重一般不超过3 g/L），同时藻细胞破壁提取虾青素也比较困难，因此，雨生红球藻生产天然虾青素的效率较低。红法夫酵母属于单细胞真菌，具有生长速度快，生物量高（细胞干重一般可以达到50 g/L以上），提取虾青素容易等优点，但是其虾青素含量比较低，一般只占细胞干重的0.01%~0.30%，因此如何通过发酵培养控制，提高红法夫酵母细胞中的虾青素含量是一个关键的科学问题。

[0006] 研究发现在红法夫酵母培养基中添加适量的乙醇，可以提高虾青素生物合成途径中乙醇脱氢酶和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的活性，有助于提高细胞中的虾青素含量。乙醇作为碳源可以促进红法夫酵母对虾青素的合成，但是抑制红法夫酵母的快速生长。但在红法夫酵母生长期的何时加入乙醇，如何控制加入乙醇的量方面，进一步的如何恒定控制红法夫酵母发酵液中乙醇浓度却未见相关报道。

[0007] 随着人们生活水平的提高和安全意识的增强，天然虾青素将逐渐更加受到人们所青睐。因此，研究一种提高红法夫酵母高产虾青素的方法不仅具有重要的研究价值，而且具有广泛的应用前景。

发明内容

[0008] 本发明的目的是提供一种利用可燃性气体传感器恒定控制红法夫酵母发酵液中乙醇浓度，进而提高红法夫酵母细胞中虾青素含量的方法。当红法夫酵母的生长进入指数生长末期（发酵液光密度OD680nm达到70左右）时，利用可燃性气体传感器，通过开关蠕动泵控制乙醇流加量，恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度在1~20 g/L范围内的任意值，从而大幅度提高了红法夫酵母细胞中的虾青素含量。

[0009] 本发明实验所采用的菌种为红法夫酵母菌（Phaffia rhodozyma，也称Xanthophyllomyces dendrorhous），购自北京中科院微生物研究所菌种保藏中心，菌种编号为As 2.1557。

[0010] 本发明提高红法夫酵母产虾青素的方法包括以下步骤：

[0011] a. 制备发酵培养基，其中，发酵培养基组成成分为蔗糖80、酵母粉20、KH2PO4 3、Na2HPO4 1、MgSO4 3、CaCl2 1，所述组成成分的单位为g/L，经121℃灭菌20 min，待冷却至20℃后接种红法夫酵母，接种量为7%；

[0012] b. 制备红法夫酵母发酵液，采用三联7升全自动发酵罐，控制培养体积3 L、培养温度20℃、搅拌转速800 rpm和曝气量体积比为1:1，采用pH计探头在线全自动流加100 g/L NaOH溶液或2 mol/L盐酸溶液控制pH值为4.9~5.1之间；

[0013] c. 控制红法夫酵母发酵液中乙醇浓度，当红法夫酵母的生长进入指数生长末期（发酵液光密度OD680nm达到70左右）时，利用可燃性气体传感器，通过开关蠕动泵控制乙醇流加量，恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度从1 g/L到20 g/L的任意值。

[0014] 其中，步骤c中具体恒定控制过程如下：将与可燃性气体传感器中气敏元件串联的电阻两端输出电压分别设定为1.40 V、1.56 V和1.70 V，发酵液中的乙醇浓度由于乙醇被红法夫酵母利用而降低，发酵罐排出空气中的乙醇浓度也降低，导致可燃性气体传感器中气敏元件的电阻增加，使与气敏元件串联的电阻输出电压降低，当输出电压降低到设定值时，继电器自动打开蠕动泵向发酵罐内流加乙醇，随着发酵液中乙醇浓度的增加，发酵罐排出空气中的乙醇浓度也增加，导致可燃性气体传感器中气敏元件的电阻降低，使与气敏元件串联的电阻输出电压的增加，当输出电压增加到设定值时，继电器自动关闭流加乙醇的蠕动泵，停止流加乙醇。

[0015] 当恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度为10 g/L为最优效果。

[0016] 本发明的优点在于：当红法夫酵母的生长进入指数生长末期（发酵液光密度OD680nm达到70左右）时，利用可燃性气体传感器，通过开关蠕动泵控制乙醇流加量，恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度，达到了大幅度提高红法夫酵母细胞中的虾青素含量的目的。利用可燃性气体传感器通过恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度，可以确定红法夫酵母发酵液中乙醇浓度的优化值，最大幅度提高红法夫酵母细胞中虾青素的含量。

附图说明

[0017] 图1为本发明连接可燃性气体传感器的微生物发酵罐示意图；

[0018] 图2为本发明可燃性气体传感器接线图；

[0019] 图3为本发明在恒定控制红法夫酵母发酵液中不同乙醇浓度的条件下，再培养1天后红法夫酵母细胞干重中虾青素含量的比较图。

具体实施方式

[0020] 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

[0021] 1、制备发酵培养基：本发明所采用的发酵培养基（g/L）组成为蔗糖80、酵母粉20、KH2PO4 3、Na2HPO4 1、MgSO4 3、CaCl2 1。经121℃灭菌20 min，待其冷却至20℃后接种红法夫酵母，接种量为7%。

[0022] 2、制备红法夫酵母发酵液，本发明采用三联7升全自动发酵罐（型号为BLBIO-5GC*3），控制培养体积3 L、培养温度20℃、搅拌转速800 rpm和曝气量1:1（v:v），采用pH计探头在线全自动流加100 g/L NaOH溶液或2 mol/L盐酸溶液控制pH值为4.9~5.1之间。

[0023] 3、控制红法夫酵母发酵液乙醇浓度，当红法夫酵母的生长进入指数生长末期（发酵液光密度OD680nm达到70左右）时，开始利用可燃性气体传感器，通过开关蠕动泵控制乙醇流加量，恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度分别为1 g/L、10 g/L和20 g/L，以不流加乙醇为对照，再经过1天的培养，发现在红法夫酵母发酵液中恒定控制10 g/L乙醇浓度条件下，可以大幅度提高红法夫酵母细胞中的虾青素含量。

[0024] 具体控制方法如下：本发明采用一种连接可燃性气体传感器的微生物发酵罐来恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度。本发明连接可燃性气体传感器的微生物发酵罐示意图（如图1），其主要由微生物发酵罐、可燃性气体传感器、记录仪、继电器和蠕动泵所组成。将与可燃性气体传感器中气敏元件串联的电阻两端输出电压分别设定为1.40 V、1.56 V和1.70 V，可燃性气体传感器外加电压9 V，串联电阻51 Ω，发酵液中的乙醇浓度由于乙醇被红法夫酵母利用而降低，发酵罐排出空气中的乙醇浓度也降低，导致可燃性气体传感器（如图2）中气敏元件的电阻增加，使与气敏元件串联的电阻输出电压降低，当输出电压降低到设定值时，继电器通过控制插座开关自动打开蠕动泵向发酵罐内流加乙醇。随着发酵液中乙醇浓度的增加，发酵罐排出空气中的乙醇浓度也增加，导致可燃性气体传感器中气敏元件的电阻降低，使与气敏元件串联的电阻输出电压的增加，当输出电压增加到设定值时，继电器自动关闭流加乙醇的蠕动泵，停止流加乙醇。采用此控制方法可成功地恒定控制红法夫酵母发酵液中的乙醇浓度从1 g/L到20 g/L的任意值。

[0025] 图3为采用本发明方法在恒定控制红法夫酵母发酵液中不同乙醇浓度的条件下，再培养1天后红法夫酵母细胞中虾青素含量的比较。当红法夫酵母的生长进入指数生长末期（发酵液光密度OD680nm达到70左右）时，在采用可燃性气体传感器恒定控制红法夫酵母发酵液中乙醇浓度为10 g/L的条件下，再经过1天的培养，发现在红法夫酵母发酵液中恒定控制10 g/L乙醇浓度的条件下，红法夫酵母细胞干重中的虾青素含量可以达到145.7 μg/g，比对照在没有流加乙醇的条件下提高了140.4%。从而达到了红法夫酵母高产虾青素的目的，具有重要的研究价值和广泛的应用前景。

[0026] 以上所披露的仅为本发明的较佳实施例，不能以此限定本发明的权利范围，依照本发明申请专利范围所做的同等变化，仍属本发明所涵盖的范围。