一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法转让专利
申请号 : CN201310607161.2
文献号 : CN103614471B
文献日 : 2015-09-16
发明人 : 陈平华 , 张卓 , 陈忠伟 , 王恒波 , 施桂姣 , 项慰 , 刘迪 , 邰连赛 , 林冰 , 陈利平 , 陈容 , 高三基 , 许莉萍 , 陈如凯
申请人 : 福建农林大学
摘要 :
以甘蔗内源基因ALS和外源基因元件（包括Ubiquitin启动子，NOS启动子、NOS 终止子，Bar基因和Bt基因）设计多重PCR引物。通过对多重PCR反应体系进行优化建立了添加60% Premix TaqTM体积、0.3μM引物浓度、150 ng DNA模板和设定56℃的退火温度的多重PCR反应体系，一次PCR反应可同时检测一个甘蔗内标准基因（ALS基因）和5个外源转基因元件（Ubi启动子、Bt基因、Bar基因、NOS启动子、NOS终止子），并且检测极限可达模板DNA含量的1%。本实验建立的多重PCR反应体系不仅可以检测转基因甘蔗外源基因成分，而且还能有效的检测其它转基因作物。
权利要求 :
1.一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法，其特征在于：多重PCR反应体系含60% 体积Premix TaqTM、热循环的退火温度56℃、引物浓度为0.3μM，一个反应体系内同时含有6种目的基因元件PCR引物；所述的6种目的基因元件，分别是甘蔗ALS基因、Ubiquitin 启动子、Bt基因、Bar基因、NOS启动子和NOS终止子；所述的甘蔗ALS基因基因元件PCR引物序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述的Ubiquitin 启动子PCR引物序列如SEQ ID NO.3-4所示，所述的Bt基因PCR引物序列如SEQ ID NO.5-6所示，所述的Bar基因PCR引物序列如SEQ ID NO.7-8所示，所述的NOS启动子PCR引物序列如SEQ ID NO.9-10所示，所述的NOS终止子PCR引物序列如SEQ ID NO.11-12所示。
2.根据权利要求1所述的一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法，其特征在于：包括PCR反应体系和扩增条件，具体如下：TM
(1) PCR反应体系：反应体系总体积为30 µl；60%体积Premix Taq ，上、下游引物各
0.6μL，模板3μl，用ddH2O将终体积调整到30μL；
(2)PCR扩增条件：95℃预变性6 min，94℃变性40 s，56℃退火35 s，72℃延伸 35 s，共36个循环，最后72℃延伸10 min。
说明书 :
一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法。
背景技术
[0002] 转基因技术越来越成熟，转基因甘蔗的种类也日趋多样。目前，抗除草剂、抗虫、抗病转基因甘蔗已经在包括美国、澳大利亚、印度、巴西在内的14个国家进行田间试验，为转基因甘蔗商业化栽培创造了条件。在我国，甘蔗基因克隆和转基因研究则是在20世纪90年代中期才开始的，虽然起步较迟，但进展较快，已经获得的转基因甘蔗有抗虫转基因甘蔗、抗旱转基因甘蔗、耐除草剂转基因甘蔗、抗病毒病转基因甘蔗、抗真菌病转基因甘蔗、抗细菌病转基因甘蔗等。随着世界范围内转基因作物的不断增多，建立转基因快速检测方法显得尤为重要。由于甘蔗染色体复杂，插入的外源基因的检测比其它作物困难得多。目前，国内外实验室和国家检测部门应用最广泛的还是核酸PCR技术，对多种靶序列通常采用单一PCR检测的方式，这样不仅耗时，而且检测成本也很高，同时，在转基因作物育种中为了避免多价转基因作物基因之间产生的“反式失活”，人们在转基因作物育种中避免使用相同的启动子，这样就进一步增加了多价转基因作物检测的靶序列。虽然Dietrich 等利用实时荧光定量PCR法、陈茹等利用PCR-ELISA技术建立了高敏感性的检测转基因作物体系，但是其操作过程复杂，检测成本较高，对操作人员要求也较高，并且仍然未摆脱对靶序列逐一检测的方式。
[0003] 甘蔗属异源多倍体植物，由于染色体数目多且遗传机制十分复杂，转基因甘蔗的检测仍存在一定难度，对于转基因甘蔗外源基因元件进行多重PCR快速筛查迄今没有研究报道。加之目前基因工程趋向于多价转基因改造，一次可以检测多个外源基因的PCR方法更能提高效率。本发明利用多重PCR技术意在建立一种快速、简单、高效和低成本的转基因甘蔗目的基因检测方法，同时检测转Bar、Bt基因的双抗甘蔗的6个基因元件。
发明内容
[0004] 本发明的目的是为转基因甘蔗PCR检测提供一种利用多重PCR方法快速筛查多个目的基因元件的方法。本发明在同一次PCR反应可以同时检出6个参数, 既可以检测转基因作物内源基因，也可以检测常见的转基因调控元件和目的基因，6个参数只需要一次电泳分析，且PCR产物可直接上样进行电泳分析，不需要添加显色液等，可大大节省时间，节省试剂。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 多重PCR反应体系：以总体积30 μL计算，含60% Premix TaqTM体积、热循环的退火温度56℃、引物浓度为0.3μM、DNA模板含量为150 ng。
[0007] 转基因甘蔗外源基因元件多重PCR快速筛查方法，包括PCR反应体系和扩增条件，具体如下：
[0008] (1) PCR反应体系：反应体系总体积为30μL，60%体积Premix TaqTM，上、下游引物各0.6μL，模板3μL(50 ng/μL)，用ddH2O将终体积调整到30μL；
[0009] (2)PCR扩增条件：95℃预变性6 min，94℃变性40 s，56℃退火35 s，72℃延伸 35 s，共36个循环，最后72℃延伸10 min。
[0010] 所述的一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法包含6种基因元件，分别是甘蔗ALS基因、Ubi启动子、Bt基因、Bar基因、NOS启动子和NOS终止子。
[0011] 本发明的优点在于：
[0012] (1)效率高：在同一次PCR反应可以同时检出6个参数，包括甘蔗ALS基因、Ubi启动子、NOS启动子，NOS 终止子、Bt基因、Bar基因；
[0013] (2)适用性广：既可以检测转基因作物內源基因，也可以检测常见的转基因调控元件和目的基因，包括甘蔗內源基因ALS基因、常用的启动子和终止子如Ubi启动子、NOS启动子、NOS 终止子；使用广泛的筛选基因Bar基因；使用最多的功能基因 Bt基因。
[0014] (3)特异性强：1次PCR反应检测6种基因（序列），各扩增产物条带清晰，互不干扰，并且没有非特异扩增。
[0015] (4)简便快速：6个参数只需要一次电泳分析，且PCR产物可直接上样进行电泳分析，不需要添加显色液等，可大大节省时间，节省试剂。
附图说明
[0016] 图1 转基因甘蔗FNSC15229的单一PCR检测。其中泳道1-3、4-6、7-9、10-12、13-15、16-18分别为ALS 基因、Bt基因、Bar基因、Ubiquitin 启动子，NOS 启动子和NOS 终止子引物的单次PCR产物；1、4、7、10、13、16为FNSC15229；2、5、8、11、14、17为阴性对照（FN15）；3、6、9、12、15、18为空白对照；M：100bp Ladder DNA Marker。
[0017] 图2 不同Premix TaqTM含量与退火温度对多重PCR的影响。泳道1~4：退火温度依次为60、58、56、55℃时FNSC15229 DNA 的PCR扩增结果；泳道5：阴性对照FN15；泳道6：空白对照；M：100bp Ladder DNA Marker；A为40%Premix TaqTM，B为50%Premix TaqTM，C为60%Premix TaqTM。
[0018] 图3 不同Premix TaqTM含量和引物浓度对多重PCR的影响。泳道1-5：引物浓度依次为0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM时FNSC15229 DNA 的PCR扩增结果；泳道6：阴性对照FN15；泳道7：空白对照； M：100bp Ladder DNA Marker；A为40%Premix TaqTM，B为50%Premix TaqTM，C为60%Premix TaqTM。
[0019] 图4 多重PCR检测极限测试。泳道1-5：FNSC15229 DNA质量分数依次为100%、3%、2%、1%、0.5%；泳道6：阴性对照FN15；泳道7：空白对照；M：100bp Ladder DNA Marker。
[0020] 图5 多重PCR体系适用性和稳定性分析。泳道1-5：依次为转基因油菜MS1、MS8、转基因水稻金恢80229、转基因甘蔗FNSC39229、FNSC22229；泳道6：阳性对照FNSC15229；泳道7：阴性对照FN15；泳道8：空白对照；M：100bp Ladder DNA Marker。
具体实施方式
[0021] 为了充分公开本发明一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法，以下结合实施例加以说明。
[0022] 实施例1：
[0023] （1）甘蔗ALS基因、Ubi启动子、Bt基因、Bar基因、NOS启动子的PCR扩增[0024] 根据权利要求2所述的甘蔗外源基因元件多重PCR快速筛查方法，其特征在于，引物序列及PCR预期扩增片段长度如下：
[0025] 表1 引物序列及PCR预期扩增片段长度
[0026]
[0027] PCR反应体系：Premix TaqTM18μL，上、下游引物各0.6μL，模板3μl（50 ng/μL），用ddH2O将终体积调整到30μL。
[0028] PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；94℃变性40 s，56℃退火35 s，72℃延伸35 s，36个循环；72℃延伸10 min。取10μl PCR扩增产物，用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0029] （2）单重PCR及引物特异性验证
[0030] 用表1合成的PCR引物，以转基因甘蔗FNSC15229的DNA为模板，以非转基因甘蔗FN15为阴对照，ddH2O为空白对照，分别进行单重PCR检测ALS 基因，Ubiquitin 启动子，NOS 启动子、NOS 终止子，Bar基因和 Bt基因，结果各转基因元件均呈阳性，与已知的FNSC15229转基因成分一致(图1)。 由图1可以看出，PCR产物特异性强，没有杂带产生，扩增效率高；与表1对比可以看出，PCR检出的元件和产物大小都与预期一致。泳道1、2也显示提取的甘蔗样品DNA模板符合PCR检测的需要，并且反应体系无污染现象。可见实验设计的各引物均具有较好的特异性，可用于转基因检测。
[0031] PCR扩增产物经测序和BLAST对比，扩增产物碱基序列与已知序列一致，内源基因ALS与本实验室克隆得到的甘蔗 ALS基因序列一致，证实PCR扩增产物确为目的扩增片段。
[0032] (3)不同Premix TaqTM含量与退火温度对多重PCR结果的影响
[0033] 多重PCR反应中多种引物共用同一套模板，有多个扩增条带，Taq酶的用量较多；加上不同PCR引物的理论Tm值不同，因此Taq酶含量与退火温度是影响多重PCR反应的两TM
个关键因素。为了确定合适的Premix Taq 用量和多重PCR最适退火温度，本实验设计了TM
40%、50%和60%三种Premix Taq 添加体积并分别设立了60℃、58℃、56℃、55℃四种退火TM
温度，其它反应条件与单重PCR相同。反应结果如图2所示，60%Premix Taq 添加体积的TM
PCR条带明显比40%和50%的Premix Taq 添加体积的PCR条带亮度高，而且60%体积比也得到了所有目的条带（图2 C），而40%和50%添加体积部分条带未得到扩增（图2 A、B）。
同时可以看到在56℃时5个目的条带不仅均得到扩增，且条带明显，说明扩增效率高，且无非特异性条带产生（图2中A、B、C的泳道3）；而退火温度在55℃时有非特异性条带出现（图
2中A、B、C的泳道4）；58℃时PCR扩增效果降低，部分条带变弱（图2中A、B、C的泳道2）；
TM
60℃时部分条带未得到扩增（图2中A、B、C的泳道1）。可见，60%Premix Taq 添加体积和
56℃的退火温度有利于提高多重PCR反应效果。
个关键因素。为了确定合适的Premix Taq 用量和多重PCR最适退火温度，本实验设计了TM
40%、50%和60%三种Premix Taq 添加体积并分别设立了60℃、58℃、56℃、55℃四种退火TM
温度，其它反应条件与单重PCR相同。反应结果如图2所示，60%Premix Taq 添加体积的TM
PCR条带明显比40%和50%的Premix Taq 添加体积的PCR条带亮度高，而且60%体积比也得到了所有目的条带（图2 C），而40%和50%添加体积部分条带未得到扩增（图2 A、B）。
同时可以看到在56℃时5个目的条带不仅均得到扩增，且条带明显，说明扩增效率高，且无非特异性条带产生（图2中A、B、C的泳道3）；而退火温度在55℃时有非特异性条带出现（图
2中A、B、C的泳道4）；58℃时PCR扩增效果降低，部分条带变弱（图2中A、B、C的泳道2）；
TM
60℃时部分条带未得到扩增（图2中A、B、C的泳道1）。可见，60%Premix Taq 添加体积和
56℃的退火温度有利于提高多重PCR反应效果。
[0034] (4)不同Premix TaqTM含量与引物浓度对多重PCR的影响
[0035] 多重PCR反应中不同引物共存于同一个反应体系中，共用同一套模板，Taq酶的用TM量与引物浓度也是影响多重PCR反应的两个重要因素。为探究不同Premix Taq 含量和引TM
物浓度对多重PCR的影响，本实验对40%、50%和60%三种Premix Taq 添加体积分别设立了0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM 5种引物浓度，PCR反应结果如图3所示。整体TM
上看，60% Premix Taq 添加体积的多重PCR效果（图C）仍然优于其它两种添加体积（图A、TM
B），条带清晰，亮度高； Premix Taq 添加体积为50%和40%时多重PCR目的条带亮度明显降低。同时可以看出引物浓度在0.3M和0.4μM时（图3 A、B、C中的泳道3、4）5个目的条带不仅均得到扩增，且条带明显，说明扩增效率高，且无非特异性条带产生；而引物浓度在
0.1M和0.2μM时（图3 A、B、C中的泳道1、2）5个目的条带的亮度明显降低，且部分目的条带未得到扩增；而在引物浓度更高时，如0.5M时（图3 A、B、C中的泳道5）5个目的条带并未如预期那样出现较强扩增，部分目的条带的亮度反而下降（100 bp和300bp位置），在接TM
近200 bp位置出现非特异性条带（图3 B、C中的泳道5）。可见，60%Premix Taq 添加体积和适当提高引物浓度有利于提高多重PCR反应效果。
物浓度对多重PCR的影响，本实验对40%、50%和60%三种Premix Taq 添加体积分别设立了0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM 5种引物浓度，PCR反应结果如图3所示。整体TM
上看，60% Premix Taq 添加体积的多重PCR效果（图C）仍然优于其它两种添加体积（图A、TM
B），条带清晰，亮度高； Premix Taq 添加体积为50%和40%时多重PCR目的条带亮度明显降低。同时可以看出引物浓度在0.3M和0.4μM时（图3 A、B、C中的泳道3、4）5个目的条带不仅均得到扩增，且条带明显，说明扩增效率高，且无非特异性条带产生；而引物浓度在
0.1M和0.2μM时（图3 A、B、C中的泳道1、2）5个目的条带的亮度明显降低，且部分目的条带未得到扩增；而在引物浓度更高时，如0.5M时（图3 A、B、C中的泳道5）5个目的条带并未如预期那样出现较强扩增，部分目的条带的亮度反而下降（100 bp和300bp位置），在接TM
近200 bp位置出现非特异性条带（图3 B、C中的泳道5）。可见，60%Premix Taq 添加体积和适当提高引物浓度有利于提高多重PCR反应效果。
[0036] (5)多重PCR体系检测极限分析
[0037] 多重PCR扩增的目的条带多，每一个条带都得到扩增的检测极限分析就显得很重TM要。为确定多重PCR的检测极限，在Premix Taq 含量为60%、退火温度为56℃、引物浓度为0.3μM的条件下把质量浓度相同的FNSC15229 和FN15 的DNA按照体积比3%、2%、1%、
0.5%梯度进行了稀释，以FNSC15229为对照进行多重PCR检测。结果如图4所示，随着转基因甘蔗质量分数的下降，Bt基因(611 bp)、Ubiquitin(295 bp)启动子和NOS终止子(103 bp)条带逐渐变弱，在模板DNA质量分数为1% 时仍可检测出所有目的条带(图4泳道4)，但DNA质量分数低于1%时部分目的条带的扩增效果降低(图4泳道5)，同时发现部分目的条带亮度增强（Bar基因430 bp)，出现了非平衡扩增。而NOS启动子（195 bp)目的条带却无太大变化。
0.5%梯度进行了稀释，以FNSC15229为对照进行多重PCR检测。结果如图4所示，随着转基因甘蔗质量分数的下降，Bt基因(611 bp)、Ubiquitin(295 bp)启动子和NOS终止子(103 bp)条带逐渐变弱，在模板DNA质量分数为1% 时仍可检测出所有目的条带(图4泳道4)，但DNA质量分数低于1%时部分目的条带的扩增效果降低(图4泳道5)，同时发现部分目的条带亮度增强（Bar基因430 bp)，出现了非平衡扩增。而NOS启动子（195 bp)目的条带却无太大变化。
[0038] (6)多重PCR体系适用性和稳定性分析
[0039] 通过以上研究建立了优化的多重PCR反应体系：60% Premix TaqTM体积含量、56℃的退火温度、0.3μM引物浓度、1%以上的模板DNA含量。为了验证建立的多重PCR反应体系的可靠性，对已知外源目的基因元件的标准品和转基因甘蔗进行了多重PCR检测，结果不同受试材料的目的基因元件均得到了扩增（如图5），证明本实验建立的多重PCR反应体系不仅可以检测转基因甘蔗外源基因成分，而且还能有效的检测其它转基因作物。受试转基因作物和外源基因元件如下：
[0040] 表2 转基因材料和外源基因元件
[0041]
[0042] 注：“+”表示有相应成分，“-”表示无相应成分
[0043] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。