甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒及其应用

摘要

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种利用双重荧光PCR法对甲型和乙型流感病毒在单管联合进行检测的引物、探针及试剂盒。本发明的针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物及探针，其核苷酸序列如SEQIDNO：1-6所示；本发明的甲型和乙型流感病毒联合检测的双重PCR试剂盒，包括甲乙型流感病毒检测混合液，所述甲乙型流感病毒检测混合液中含有前述的引物和探针。利用本发明的试剂盒和引物探针能快速检测甲型和乙型流感病毒，具有操作简便、灵敏度高、特异性好等优点；可及时发现和确诊可疑病例，提高对该类疾病的监测水平。

权利要求

1.一种针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物及探针，其特征在于，所述引物和探针的组成如下：甲型流感病毒

IFVA上游引物:5’-GCTCTCATGGAGTGGMTA-3’IFVA下游引物:5’-CGTGAACACAAAYCCYAA-3’IFVA探针：5’-荧光报告基团-ACAAGACCAATCCTGTCACCTCTG-荧光淬灭基团-3’乙型流感病毒IFVB上游引物:5’-GTTGGTTTGGTGGGAAAG-3’IFVB下游引物:5’-GATAAGGGYTCTGTGATGAA-3’IFVB探针：5’-荧光报告基团-TGACCTAGACTCTGCCTTGGAATG-荧光淬灭基团-3’其中，M＝A/C，Y＝T/C；

所述IFVA探针标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，IFVB探针标记的荧光报告基团为VIC荧光基团；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

2.一种甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，包括甲乙型流感病毒检测混合液，所述甲乙型流感病毒检测混合液中含有权利要求1所述针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物及探针。

3.如权利要求2所述的甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述甲乙型流感病毒检测混合液中还含有RT-PCR MIX和H2O。

4.如权利要求2所述的甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述甲乙型流感病毒检测混合液的组成为：IFVA上游引物0.75μl/test；IFVA下游引物0.75μl/test；IFVA探针0.1μl/test；IFVB上游引物0.75μl/test；IFVB下游引物0.75μl/test；

IFVB探针0.1μl/test；RT-PCR MIX 12.5μl/test；双蒸水3.3μl/test。

5.如权利要求2所述的甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述双重PCR检测试剂盒还包括RT-PCR酶、阴性对照品、阳性对照品中的至少一种。

6.如权利要求5所述的甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品为含有SEQ ID NO：7所示IFVA目的扩增片段的质粒，和/或含有SEQ ID NO：8所示IFVB目的扩增片段的质粒。

7.如权利要求2所述的甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述双重PCR试剂盒所采用的荧光PCR法的PCR检测体系如下：

8.如权利要求7所述的甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述待测品为样本核酸提取液、阳性对照品或阴性对照品。

9.如权利要求2所述的甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的PCR扩增程序为：45℃10min；95℃15min；95℃15sec和60℃60sec交替循环45次。

10.权利要求1所述针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物及探针，权利要求2-9任一权利要求所述甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒在制备甲型和/或乙型流感病毒检测试剂中的应用。

说明书

甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物、探针及试剂盒。

背景技术

[0002] 流感病毒属正粘病毒科，系RNA病毒。根据病毒膜蛋白和核蛋白的差异，可将流感病毒分为甲、乙、丙三型。甲、乙、丙不仅反映了病毒被发现先后顺序，也反映了对人类、动物的危害程度的大小。流感病毒特点是容易发生变异，其中甲型流感病毒最容易发生变异，可感染人和多种动物，为人类流感的主要病原，常引起大流行和中小流行。乙型流感病毒变异较少，能否感染人以外的其他动物至今不肯定，引起爆发或小流行。丙型较稳定，可感染人类，多为散发病例，目前已证实猪也可被感染。根据病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的结构及其基因特性的不同，可分为不同亚型。甲型流感病毒可分为15个H亚型和9个N亚型，仅3个H亚型(H1、H2、H3)和2个N亚型（N1、N2）在人间传播。一些低等动物和禽鸟类是自然宿主。乙型流感病毒间同样有变异，但未划分成亚型转变。

[0003] 流感病毒主要依靠实验室进行确切诊断，传统的诊断方法主要包括血清学检测及病毒的分离和鉴定两个方面。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，分子生物学技术也已广泛应用于流感病毒的检测，其中又以实时荧光PCR技术在流感病毒分子诊断领域发展最快。荧光RT-PCR技术是上世纪九十年代末才发展起来的新技术，它具有快速、特异性、灵敏度高、成本相对低等优点，被广泛应用于临床检测的各个方面。但是由于流感型别较多，检测一份标本需要同时做多种型别流感的检测，既麻烦又浪费成本，加上单一型别的检测方法不能满足所有流感病毒检测的要求，因此建立单管多重荧光PCR同时检测甲、乙、丙型流感病毒的方法具有非常重要的意义

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种利用多重荧光PCR法对甲型和乙型流感病毒在单管联合检测的引物、探针、试剂盒及检测方法等，可用于临床可疑感染患者的病原学鉴别诊断。

[0005] 本发明首先公开了一种针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物及探针，所述引物和探针的组成如下：

[0006] 甲型流感病毒：

[0007] IFVA上游引物:5’-GCTCTCATGGAGTGGMTA-3’ （SEQ ID NO：1）[0008] IFVA下游引物:5’-CGTGAACACAAAYCCYAA-3’ （SEQ ID NO：2）[0009] IFVA探针：5’-荧光报告基团-ACAAGACCAATCCTGTCACCTCTG-荧光淬灭基团-3’ （SEQ ID NO：3）

[0010] 乙型流感病毒

[0011] IFVB上游引物:5’-GTTGGTTTGGTGGGAAAG-3’ （SEQ ID NO：4）[0012] IFVB下游引物:5’-GATAAGGGYTCTGTGATGAA-3’ （SEQ ID NO：5）[0013] IFVB探针：5’-荧光报告基团-TGACCTAGACTCTGCCTTGGAATG-荧光淬灭基团-3’ （SEQ ID NO：6）；

[0014] 其中，M=A/C，Y=T/C。

[0015] 针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物具体包括两对引物及其各自对应的探针，分别扩增甲型流感病毒和乙型流感病毒。

[0016] 本发明探针的设计为现有技术，探针一端标记有荧光报告基团，探针另一端标记有荧光淬灭基团。优选的，所述IFVA探针标记的荧光报告基团为FAM荧光基团，IFVB探针标记的荧光报告基团为VIC荧光基团；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

[0017] 本发明第二方面公开了一种甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒，包括甲乙型流感病毒检测混合液，所述甲乙型流感病毒检测混合液中含有前述的引物和探针。

[0018] 较优的，所述甲乙型流感病毒检测混合液中还含有RT-PCR MIX和H2O。

[0019] 最优的，所述甲乙型流感病毒检测混合液的组成为：IFVA上游引物0.75μl/test；IFVA下游引物0.75μl/test；IFVA探针0.1μl/test；IFVB上游引物0.75μl/test；IFVB下游引物0.75μl/test；IFVB探针0.1μl/test；RT-PCR MIX12.5μl/test；双蒸水
3.3μl/test。

[0020] 所述甲乙型流感病毒检测混合液的组成中，IFVA上游引物、IFVA下游引物、IFVB上游引物，和IFVB下游引物的浓度分别为600nM/L，IFVA探针和IFVB探针的浓度分别为100nM/L。

[0021] 较优的，所述双重PCR检测试剂盒中还包括RT-PCR酶、阴性对照品（DEPC-H2O）、阳性对照品中的至少一种。

[0022] 本发明所述阳性对照品为含有SEQ ID NO：7所示IFVA目的扩增片段的质粒，和/或含有SEQ ID NO：8所示IFVB目的扩增片段的质粒。

[0023] 并且，IFVA目的扩增片段的序列为：

[0024] 5’-GCTCTCATGGAGTGGATAAAGACAAGACCAATCCTGTCACCTCTGACTAAGGGGATTTTAGGGTTTGTGTTCACG-3’ (SEQID NO：7)

[0025] IFVB目的扩增片段的序列为：

[0026] 5’-GTTGGTTTGGTGGGAAAGAATTTGACCTAGACTCTGCCTTGGAATGGATAAAAAACAAAAGATGCTTAACTGATATACAAAAAGCACTAATTGGTGCCTCTATATGCTTTTTAAAACCCAAAGACCAGGAAAGAAAAAGAAGATTCATCACAGAGCCCTTATC-3’(SEQ ID NO：8)

[0027] 较优的，本发明甲型和乙型流感病毒联合检测的双重PCR试剂盒所采用的荧光PCR法的PCR检测体系如下：

[0028] 甲乙型流感病毒检测混合液 19μl

[0029] RT-PCR酶 1μl

[0030] 待测品 5μl

[0031] 反应总体系为25μl。

[0032] 较优的，本发明试剂盒的PCR体系中，所述待测品为样本核酸提取液、阳性对照品或阴性对照品（DEPC-H2O）。

[0033] 本发明的阳性对照品中，IFVA质粒和IFVB质粒可以单独包装，也可以混合包装。

[0034] 本发明样本核酸提取液的制备方法可参考现有病毒RNA提取技术，具体可采用下述方法具体制备：取100μl样品置于1.5ml离心管中，加入300μl裂解液(Trizol)，再加入100μl氯仿，混匀器上振荡混匀5s或颠倒混匀15次；13000rpm离心15min，吸取上层液体，加入等体积异丙醇，颠倒混匀室温静置10min，13000rpm离心10min，轻轻倒去上清；加入700μl75%乙醇，颠倒洗涤，13000rpm离心5min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，弃尽液体或4000rpm离心5s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量吸干液体，加入20μl DEPC-H2O溶解RNA，即获得样本核酸提取液。

[0035] 制备本发明所述样本核酸提取液的样本来自人体鼻腔或咽部分泌物。

[0036] 本发明试剂盒的PCR扩增程序为：45℃10min；95℃15min；95℃15sec和60℃60sec交替循环45次。单点荧光检测在60℃。

[0037] 荧光通道检测选择FAM和VIC通道。

[0038] 备注：如使用ABI Prism7500实时荧光PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。

[0039] 本发明试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

[0040] 1）样本核酸提取液的制备；

[0041] 2）试剂制备：向甲乙型流感病毒检测混合液中加入RT-PCR酶，振荡、离心，获得反应混合液；

[0042] 3）加样：将步骤2）的反应混合液置于PCR管中，将样本核酸提取液、阳性对照品或阴性对照品分别加入装有反应混合液的不同PCR管，获得对应的样本反应管、阳性反应管和阴性对照反应管；

[0043] 4）PCR扩增：反应管置于定量荧光PCR仪上，设置循环参数，进行PCR扩增；

[0044] 5）PCR反应结束后，检测PCR反应体系的荧光信号值，阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H2O的最高点，荧光通道选用FAM通道和VIC通道。

[0045] 试剂盒质量控制：试剂盒各对照品须达到以下表1中的要求，否则实验视为无效。

[0046] 表1试剂盒质量标准

[0047]

[0048]

[0049] 样本核酸提取液结果的判断标准如表2所示：

[0050] 表2检测结果判断标准

[0051]

[0052] 如待检样本Ct值在42～45之间，需重复测定，如仍在42～45之间，则判为低于检测限，报告为阴性。

[0053] 本发明最后公开了前述针对甲型和乙型流感病毒的双重荧光PCR检测用引物及探针、前述甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒在制备甲型流感病毒和/或乙型禽流感病毒检测试剂中的应用。

[0054] 本发明涉及了两对PCR引物分别特异性扩增甲型流感病毒和乙型流感病毒基因序列，2对PCR引物可在同一PCR反应管里同时进行扩增，实现双重检测，大大缩短检测时间，操作简便。特异性引物和和探针的设计保证了引物和探针的高度保守和特异性，避免了两对引物和探针之间无互补配对或交叉扩增的情况。本发明选用的两个荧光基团的荧光波长相差较大且信号强度相近，避免了信号之间的相互干扰。

附图说明

[0055] 图1：FAM通道甲型流感灵敏度扩增曲线图

[0056] 图2：VIC通道乙型流感灵敏度扩增曲线图

[0057] 图3：样本1扩增曲线图

[0058] 图4：样本2扩增曲线图

[0059] 图5：样本3扩增曲线图

[0060] 图6：样本4扩增曲线图

[0061] 图7：样本5扩增曲线图

[0062] 图8：样本6扩增曲线图

具体实施方式

[0063] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

[0064] 实施例1甲型和乙型双重荧光PCR检测试剂盒检测引物探针的设计和合成[0065] 在IFVA探针的5’标记FAM荧光基团，IFVA探针的3’标记BHQ1荧光淬灭基团；在IFVB探针的5’标记VIC荧光基团，IFVB探针的3’标记BHQ1荧光淬灭基团。合成IFVA和IFVB的引物和探针。

[0066] 甲型流感病毒

[0067] IFVA上游引物：5’-GCTCTCATGGAGTGGMTA-3’ （SEQ ID NO：1）[0068] IFVA下游引物：5’-CGTGAACACAAAYCCYAA-3’ （SEQ ID NO：2）[0069] IFVA探针：FAM-ACAAGACCAATCCTGTCACCTCTG-BHQ13’ （SEQ ID NO：3）[0070] 乙型流感病毒

[0071] IFVB上游引物:5’-GTTGGTTTGGTGGGAAAG-3’ （SEQ ID NO：4）[0072] IFVB下游引物:5’-GATAAGGGYTCTGTGATGAA-3’ （SEQ ID NO：5）[0073] IFVB探针:5’VIC-TGACCTAGACTCTGCCTTGGAATG-BHQ1-3’ （SEQ ID NO：6）[0074] 其中，IFVA的上下游引物为兼并引物，兼并引物中，M=A/C；Y=T/C。

[0075] 实施例2甲乙型流感病毒检测混合液的制备

[0076] 将IFVA上游引物0.75μl/test；IFVA下游引物0.75μl/test；IFVA探针0.1μl/test；IFVB上游引物0.75μl/test；IFVB下游引物0.75μl/test；IFVB探针0.1μl/test；RT-PCR MIX（购自Qiagen公司）12.5μl/test；双蒸水3.3μl/test混匀即为甲乙型流感病毒检测混合液。制备的所述甲乙型流感病毒检测混合液的组成中，IFVA上游引物、IFVA下游引物、IFVB上游引物，和IFVB下游引物的终浓度分别为600nM/L，IFVA探针和IFVB探针的终浓度分别为100nM/L。

[0077] 实施例3甲型和乙型流感病毒联合检测的双重PCR试剂盒的灵敏度分析[0078] 1、实验方法

[0079] 1）样品的准备：

[0080] IFVA质粒的构建方法：采用PCR法对甲型流感病毒样本的核酸进行扩增，获得含甲型流感病毒目的扩增序列（SEQID NO：7所示序列）的核酸片段，引物序列如SEQ ID NO：1-2所示。将扩增的片段纯化后，通过TA克隆至pMD8-T载体上，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α，扩增，获得IFVA质粒。

[0081] IFVB质粒的构建方法：采用PCR法对乙型流感病毒样本的核酸进行扩增，获得含IFVB目的扩增序列（SEQID NO：8所示序列）的核酸片段，引物序列如SEQ ID NO：4-5所示。将扩增的片段纯化后，通过TA克隆至pMD8-T载体上，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α，扩增，获得IFVB质粒。

[0082] 取2×106copies/ml的甲型流感阳性对照品（IFVA质粒）及2×106copies/ml的乙6
型流感阳性对照品（IFVB质粒）等体积混合，获得1×10copies/ml检测样品S1。按1：10、1：
5 4 3
100、1：1000稀释，获得S2（1×10copies/ml）、S3（1×10copies/ml）、S4（1×10copies/ml）。将S1—S4共4份作为检测样品。

[0083] 2）试剂配制：

[0084] 取n×19μl实施例2的甲乙型流感病毒检测混合液与n×1μl的RT-PCR酶（购自Life technology公司，商品名One-Step RT-PCR试剂盒），振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒(n为反应管数)。

[0085] 3）加样：

[0086] 取上述各混合液各20μl置于PCR管中，然后将S1-S4各5μl分别加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

[0087] 4）PCR扩增：

[0088] 反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：

[0089] 45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环45次；单点荧光检测在60℃。反应体系为25μl。

[0090] 荧光通道检测选择FAM和VIC通道。

[0091] 备注：如使用ABI Prism7500实时荧光PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。

[0092] 2.检测结果：

[0093] 表3试剂盒灵敏度检测结果

[0094]

[0095] 荧光PCR扩增曲线结果见图1-2，检测结果见表3。该实验结果表明：S1—S4在FAM和VIC通道检测均为阳性，表明试剂盒检测甲型流感和乙型流感的检测灵敏度都能达到1×103copies/ml。

[0096] 实施例4甲型和乙型流感病毒双重荧光PCR检测试剂盒的使用

[0097] 1、实验方法

[0098] 1）样本来源：

[0099] 对6例样本进行甲型、乙型流感病毒核酸检测。6例样本编号1-6，1-4号样本经测序确认分别为甲型流感病毒H1亚型、甲型流感病毒H3亚型、甲型流感病毒H1N1、乙型流感病毒；5-6号样本为流感病毒阴性。

[0100] 2）样本处理：

[0101] 取100μl样本，置于1.5ml离心管中，加入300μl裂解液(Trizol)，再加入100μl氯仿，混匀器上振荡混匀5sec或颠倒混匀15次；13000rpm离心15min，吸取上层液体，加入等体积异丙醇，颠倒混匀室温静置10min，13000rpm离心10min，轻轻倒去上清；加入700μl75%乙醇，颠倒洗涤，13000rpm离心5min，轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，弃尽液体或4000rpm离心5sec，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量吸干液体，加入20μlDEPC-H2O溶解RNA，获得样本核酸提取液。

[0102] 3）试剂配制：

[0103] 取n×19μl甲乙型流感病毒检测混合液(n为反应管数)与n×1μl RT-PCR酶（购自Life technology公司，商品名One-Step RT-PCR试剂盒），振荡混匀数秒,3000rpm离心数秒。

[0104] 4）加样：

[0105] 取上述各混合液20μl置于PCR管中，然后将1-6号样本核酸提取液各5μl分别加入PCR反应管中，盖好PCR反应管盖，立即进行PCR扩增反应。

[0106] 5）PCR扩增：

[0107] 反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置：

[0108] 45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循环45次；单点荧光检测在60℃。反应体系为25μl。

[0109] 荧光通道检测选择FAM和VIC通道。

[0110] 备注：如使用ABI Prism7500实时荧光PCR仪，请务必于passive reference和quencher处均选择“none”。

[0111] 6）阈值设定：

[0112] 阈值设定原则以阈值线刚好超过DEPC-H2O的最高点。

[0113] 2、试验结果：

[0114] 表4试剂盒检测结果

[0115]

[0116]

[0117] 荧光PCR扩增曲线结果见图3-8，检测结果见表4。可见本发明甲型和乙型流感病毒联合检测试剂盒的多重荧光PCR检测结果与测序结果一致，本发明的引物、探针以及试剂盒可用于甲型流感病毒和乙型流感病毒的鉴定和检测。