本发明公开了一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置，利用螺旋位相片将355nm波长激光整形成空心光束，其与532nm波长光合束后同时经高数值孔径油浸显微物镜聚焦照射到偶氮苯聚合物薄膜上。被355nm波长激光照射的偶氮苯薄膜对532nm波长激光有强吸收，在355nm波长光束的中间空心部分，532nm波长激光才会穿透偶氮苯聚合物薄膜，激发位于薄膜上面的荧光分子发光，样品所发出的荧光被同一物镜收集后被探测器接收。由于355nm光束聚焦后的空心部分尺度为亚波长量级，可在被测样品上实现超衍射极限的激发光聚焦光斑，通过逐点扫描，可实现整个样品的超衍射极限的荧光显微成像。
1.一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置，其特征在于：其包括：光学探测器(1)，滤光片(2)，第一分束镜(3)，第二分束镜(4)，高数值孔径油浸显微物镜(5)，折射率匹配油(6)，样本，532nm激光光源(10)，第一扩束透镜组(11)，第二扩束透镜组(13)，355nm激光光源(12)和螺旋位相片(14)；其中，样本包括玻璃基底(7)，偶氮苯聚合物薄膜(8)，以及荧光分子标记的被测样品(9)；样本制备过程为在玻璃基底(7)上旋涂一层300nm左右厚度的偶氮苯聚合物薄膜(8)，烘干，再在偶氮苯聚合物薄膜上放置被荧光分子标记的被测样品；
所述的355nm激光光源(12)发出波长为355nm的光束，经第二扩束透镜组(13)扩束后经过螺旋位相片(14)变成涡旋光束，其为空心光束，其中心是光强为零的奇点，该空心光束经第二分束镜(4)，高数值孔径油浸显微物镜(5)，折射率匹配油(6)，玻璃基底(7)后辐照在偶氮苯聚合物薄膜(8)上；同时，由532nm激光光源(10)发出的波长为532nm的激光光束经第一扩束透镜组(11)扩束，依次经第一分束镜(3)、第二分束镜(4)后与355nm光束合束，同时经过高数值孔径油浸显微物镜(5)，折射率匹配油(6)，玻璃基底(7)后聚焦在偶氮苯聚合物薄膜(8)上，其中532nm激光和355nm激光聚焦在偶氮苯聚合物薄膜的同一位置，由于偶氮苯聚合物薄膜上被355nm波长光辐照的环形区域对532nm波长光有强吸收，使得只有在355nm波长调制光的空心部分，532nm波长光才能透过偶氮苯聚合物薄膜，通过选择合适的调制光与激发光光强比值，在偶氮苯聚合物上表面形成超衍射极限的激发光聚焦光斑，激发标记在样品上的荧光分子，其中样品放置在偶氮苯聚合物薄膜上表面，激发出来的荧光被同一高数值孔径油浸显微物镜(5)收集并经过滤光片(2)传送到光学探测器(1)，进而实现被测样品上超衍射分辨极限区域内光学信息的提取，样品的基底放置在纳米位移台上，通过逐点扫描，实现整个样品的超分辨荧光显微成像。
2.根据权利要求1所述的一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，所述的532nm激光光源(10)所发光扩束后经过高数值孔径油浸显微物镜(5)聚焦在偶氮苯聚合物薄膜(8)上，其在偶氮苯聚合物薄膜(8)上形成的光斑要落在355nm激光光源(12)在偶氮苯聚合物薄膜(8)上形成的光斑内，并且两束光的光斑中心重合。
3.根据权利要求1所述的一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，被荧光分子标记的被测样品为生物细胞。
4.根据权利要求1所述的一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，实验中通过选择合适的荧光分子和滤光片，只让被532nm激光激发出来的荧光能够到达探测器，其他波长的荧光都被过滤掉。
5.根据权利要求4所述的一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置，其特征在于，其他波长的荧光为被355nm激光激发出来的荧光。
一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显
微成像装置
技术领域
[0001] 本发明涉及超分辨光学成像领域，特别涉及一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置。
背景技术
[0002] 显微技术是人们了解微观世界最直接的手段，光学显微技术将微观世界图像直接呈现在我们眼前，是所有显微技术中最直观也是最常用的一种显微技术，但是传统光学显微技术受衍射极限的限制，分辨率只能到半个波长量级，这已经无法满足现今显微的分辨要求。近年来一些超分辨显微技术相继被提出并走向成熟，这些超分辨显微技术主要包括共聚焦显微技术，扫描探针显微技术，受激辐射荧光淬灭显微技术，随机光重建显微技术等。上述主要显微技术在实际应用中都有其局限性，其存在的问题为：
[0003] 1、成本高。如，扫描探针显微技术需要造价昂贵的控制反馈系统作为支撑，而受激辐射荧光焠灭显微技术需要在共聚焦系统支撑下才能实现，同时对荧光分子，激发光源具有较高的要求。
[0004] 2、稳定性不高。高精度设备如近场光学探针等容易损坏，需要定期更换。
[0005] 3、局限性。共聚焦显微技术对分辨率的提高较为有限；常用的扫描探针显微技术如原子力显微镜只能提供固体样品的表面起伏图像；受激辐射荧光焠灭显微技术要想获得高的分辨率需要用超短脉冲光源，并对脉冲的发射时间作精确控制。
发明内容
[0006] 本发明的目的是克服传统光学显微技术分辨率的不足，提出了一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置，其借助于聚合物薄膜吸收调制特性的低成本、实用性强的超分辨光学显微技术实现超分辨荧光显微成像。
[0007] 实现上述目的的技术方案如下：
[0008] 一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置，其包括：光学探测器，滤光片，第一分束镜，第二分束镜，高数值孔径油浸显微物镜，折射率匹配油，样本，532nm激光光源，第一扩束透镜组，第二扩束透镜组，355nm激光光源和螺旋位相片；
其中，样本包括玻璃基底，偶氮苯聚合物薄膜，以及荧光分子标记的被测样品；样本制备过程为在玻璃基底上旋涂一层300nm左右厚度的偶氮苯聚合物薄膜，烘干，再在偶氮苯聚合物薄膜上放置被荧光分子标记的被测样品；
[0009] 所述的355nm激光光源发出波长为355nm的光束，经第二扩束透镜组扩束后经过螺旋位相片变成空心的涡旋光束，其中心是光强为零的奇点，该空心光束经分束镜，高数值孔径油浸显微物镜，折射率匹配油，玻璃基底后辐照在偶氮苯聚合物薄膜上；同时，由532nm激光光源发出的波长为532nm的激光光束经第一扩束透镜组扩束，依次经第一分束镜、第二分束镜后与355nm光束合束，同时经过高数值孔径油浸显微物镜，折射率匹配油，玻璃基底后聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上，其中532nm激光和355nm激光聚焦在偶氮苯聚合物薄膜的同一位置，由于偶氮苯聚合物薄膜上被355nm波长光辐照的环形区域对532nm波长光有强吸收，使得只有在355nm波长调制光的空心部分，532nm波长光才能透过偶氮苯聚合物薄膜，通过选择合适的调制光与激发光光强比值，在偶氮苯聚合物上表面形成超衍射极限的激发光聚焦光斑，激发标记在样品上的荧光分子，其中样品放置在偶氮苯聚合物薄膜上表面，激发出来的荧光被同一高数值孔径油浸显微物镜收集并经过滤光片传送到光学探测器，进而实现被测样品上超衍射分辨极限区域内光学信息的提取，样品的基底放置在纳米位移台上，通过逐点扫描，实现整个样品的超分辨荧光显微成像。
[0010] 进一步的，所述的355nm激光光源所发光扩束后经过螺旋位相片变成涡旋光束，其为空心光束，该空心光束经过高数值孔径油浸显微物镜聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上。
[0011] 进一步的，所述的532nm激光光源所发光扩束后经过高数值孔径油浸显微物镜聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上，其在偶氮苯聚合物薄膜上形成的光斑要落在355nm激光光源在偶氮苯聚合物薄膜上形成的光斑内，并且两束光的光斑中心重合。
[0012] 进一步的，被355nm激光光源辐照的偶氮苯聚合物薄膜对532nm激光光源所发出光有强吸收，使得只有355nm激光光源所发光束的空心部分才会有532nm激光光源所发532nm波长光穿透偶氮苯聚合物薄膜。
[0013] 进一步的，受激的荧光分子自发辐射荧光，该荧光被同一高数值孔径油浸显微物镜收集，经过滤光片后，被探测器接收。
[0014] 进一步的，被荧光分子标记的被测样品可为生物细胞。
[0015] 进一步的，实验中通过选择合适的荧光分子和滤光片，只让被532nm激光激发出来的荧光能够到达探测器，其他波长的荧光都被过滤掉。
[0016] 进一步的，其他波长的荧光为被355nm激光激发出来的荧光。
[0017] 本发明技术的原理为：
[0018] 一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微成像装置，包括：光学探测器，滤光片，分束镜，高数值孔径油浸显微物镜，折射率匹配油，样本，532nm激光光源，扩束透镜组，355nm激光光源，螺旋位相片；其中，样本由玻璃基底，偶氮苯聚合物薄膜，荧光分子标记的样品层组成，其制备过程为在玻璃基底上旋涂一层300nm左右厚偶氮苯聚合物薄膜，烘干，再在偶氮苯聚合物薄膜上放置荧光分子标记的样品。
[0019] 355nm波长激光器所发光经扩束透镜组扩束后经过螺旋位相片变为空心光束，光束中心为光强为零的奇点。该空心光束经分束镜，高数值孔径油浸显微物镜，折射率匹配油，玻璃基底后聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上。同时，由532nm激光器所发出的波长为532nm的激光光束（实心高斯光束）经扩束透镜组扩束，经分束镜，与355nm波长光束合束，同时通过高数值孔径油浸显微物镜，折射率匹配油，玻璃基底后聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上。被355nm波长的空心光束辐照的偶氮苯聚合物薄膜（环形区域）对532nm波长光有强吸收，使得只有355nm波长光束中心亚波长大小的范围内532nm波长光才能穿透偶氮苯聚合物薄膜，激发薄膜上方的荧光分子。通过改变调制光（355nm）与激发光（532nm）的光强比值，可实现超衍射极限空间区域内荧光分子的发光。所发荧光被同一高数值孔径油浸显微物镜收集。通过选择合适的滤光片，只让被532nm波长光激发的荧光被光学探测器接收。样品基底放置在纳米位移台上，通过逐点扫描，实现整个被测样品的超分辨成像。
[0020] 利用偶氮苯聚合物的吸收调制特性，其被355nm激光辐照部分的偶氮苯对532nm激光有强吸收，使得该部分对532nm激光形成一种“关”的状态，即532nm波长光无法完全透过偶氮苯聚合物薄膜中被355nm光照射的区域；而只有在355nm光束中间的空心区域，偶氮苯聚合物薄膜没有被照射，不会发生吸收调制，因此532nm光可穿透此区域的偶氮苯聚合物薄膜，形成一种“开”的状态，其效果类似于形成一个光学小孔，通过选择合适的调制光与激发光的光强比值，可让此光学小孔的孔径远小于光波的衍射极限，基于此可获得超衍射分辨极限的激发光（532nm）聚焦光斑，进而激发位于偶氮苯聚合物薄膜表面荧光分子的自发辐射荧光，利用高数值孔径油浸显微物镜和滤光片将532nm激光激发出来的荧光传送到到探测器上，即可获得此超衍射极限空间区域内被测样品的光学信息。利用精密位移台的逐点扫描，可实现整个样品的超分辨成像。
[0021] 本发明与现有成像技术相比的优势为：
[0022] 1、结构简单：高数值孔径显微物镜在这里既用于对两束激光进行聚焦，又用于荧光收集探测，其结构简单紧凑；
[0023] 2、高分辨率：突破了传统光学成像的衍射极限，利用偶氮苯聚合物薄膜本身的吸收调制特性，实现了超分辨的光学成像；
[0024] 3、低成本：该显微技术光路简单，无需类似于扫描显微成像所需的高精密样品－探针近场距离控制系统，也无需各种特殊要求的昂贵激光光源。
附图说明
[0025] 图1为本发明提出的一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微装置的结构示意图；
[0026] 图2为光斑示意图和其对应的直径上的光强分布图，a为被高数值孔径油浸显微物镜聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上的532nm光斑示意图和其对应的光强分布图，b为被高数值孔径油浸显微物镜聚焦在偶氮苯聚合物薄膜上的355nm光斑示意图和其对应的光强分布图，c为透过偶氮苯聚合物薄膜后532nm光斑示意图和其对应的光强分布；
[0027] 其中，1、光学探测器；2、滤光片；3、第一分束镜；4、第二分束镜；5、高数值孔径油浸显微物镜；6、折射率匹配油；7、玻璃基底；8、偶氮苯聚合物薄膜；9、荧光分子标记的被测样品；10、532nm激光光源；11、13、第一、第二扩束透镜组；12、355nm激光光源；14、螺旋位相片。
[0028] 图3为偶氮苯聚合物的吸收光谱，可看到其有两个吸收峰，分别为350nm波段和500nm波段（接近本发明所用调制光（355nm）与激发光（532nm）波长），对应偶氮苯聚合物的顺式和反式两种结构。
具体实施方式
[0029] 下面结合附图对本发明作进一步详细描述，附图中相同的标号始终表示相同的部件。
[0030] 参照图1所示的一种基于偶氮苯聚合物光致吸收调制特性的超分辨荧光显微镜，包括：光学探测器1，滤光片2，第一分束镜3，第二分束镜4，高数值孔径油浸显微物镜5，折射率匹配油6，样本，532nm激光光源10，第一扩束透镜组11，355nm激光光源12，第二扩束透镜组13，螺旋位相片14；其中，样本由玻璃基底，偶氮苯聚合物薄膜，荧光分子标记的被测样品层，其制备过程为在玻璃基底上旋涂一层300nm左右厚的偶氮苯聚合物薄膜，烘干，再在偶氮苯聚合物薄膜上放置荧光分子标记的被测样品，如生物细胞等，将制备好的样品通过折射率1.516的匹配油6与高数值孔径油浸显微物镜5（如60X，N.A.=1.42）相接；355nm激光光源12所发的355nm激光经第二扩束透镜组13扩束后，经过螺旋位相片14变为涡旋光束（空心光束），再经过第二分束镜4反射后经过高数值孔径油浸显微物镜5会聚辐照在偶氮苯聚合物薄膜8上。532nm激光光源10所发的532nm激光经第一扩束透镜组
11扩束后被反射到高数值孔径油浸显微物镜5上，经过会聚后辐照在偶氮苯聚合物薄膜8上。选择合适的第一扩束透镜组11和第二扩束透镜组13，使得被高数值孔径油浸显微物镜聚焦后的532nm光斑落在355nm光斑内，控制两束光光斑中心重合；同时选择合适的调制光与激发光光强比值，只让尺度小于355nm光束空心部分覆盖的区域内荧光分子被532nm激光激发，发出的荧光被高数值孔径油浸显微物镜收集后传播到滤光片2上，滤光片2只让被
532nm激光激发的荧光通过并传到探测器，进而获得超衍射分辨极限区域内样品的光学信息。样品基底放置在纳米位移台上，通过逐点扫描得到整个样品的超分辨荧光图像。
[0031] 本发明未详细阐述的部分属于本领域公知技术。
