细脚棒束孢子实体生产的培养基及工业化培养方法

摘要

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种细脚棒束孢子实体生产的培养基及工业化培养方法。本发明的细脚棒束孢子实体培养通过斜面种子、摇瓶种子、发酵罐种子培养，并以小麦或大麦为培养基主料，以蚕蛹粉为培养基辅料，在蒸料罐内灭菌，冷却，制备得到固体发酵培养基，种子液加入蒸料罐内，与固体培养基混合均匀，通过自动分装机分装至固体发酵培养盒，覆膜密封，移入培养室，控制培养过程中温度、光照、湿度、通风等条件，培养子实体，可实现细脚棒束孢子实体的大规模工厂化生产。本发明细脚棒束孢子实体的培养方法产量高、产品品质好，产品价格相对低廉，具有较好的工业生产及医疗应用前景。

权利要求

1.一种细脚棒束孢子实体的工业化培养方法，具体步骤如下：

1)菌种活化：将细脚棒束孢接种到斜面培养基上培养，获得斜面孢子，收集斜面孢子，制备孢子液；

2)种子液的制备：

A.一级种子液的制备：将上一步的孢子液接入摇瓶种子培养基进行培养，获得一级种子液；

B.二级种子液的制备：将上一步的一级种子液接入发酵罐种子培养基，发酵培养获得二级种子液；

3)固体发酵培养基的制备：将固体培养基原料加入蒸料罐内，灭菌，冷却，获得用于培养细脚棒束孢子实体的固体培养基；

4)将步骤2)制备的二级种子液加入步骤3)蒸料罐内的固体培养基中，通过蒸料罐旋转的方式，将固体培养基与种子液混合均匀，通过自动分装机分装至固体发酵培养盒，覆膜密封，通过振动床将培养盒内的培养基振动平整；

5)固体发酵：将步骤4)培养基振动平整的培养盒移入培养室，培养获得细脚棒束孢子实体；

步骤1)所述斜面培养基配方如下：

步骤2)所述摇瓶种子培养基配方如下：马铃薯 10～20wt％

蔗糖 1～2wt％

水 余量；

步骤2)所述发酵罐种子培养基配方如下：pH值6.0～7.0，余量为水；

步骤3)所述固体培养基配方为：小麦和/或大麦：蚕蛹粉：水的质量比为1～

1.5:0.05～0.3:1～2.5。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤1)斜面孢子的培养条件为：23～

27℃，黑暗培养10～15天。

3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2)所述一级种子的培养温度为

23～27℃，转速为120～180rpm，培养36～48h。

4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤2)所述二级种子的培养温度为

23～27℃，通气量1.5～2.5vvm，搅拌速率200～300rpm，培养48～72小时。

5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤3)所述灭菌的条件为121℃下灭菌40～60分钟。

6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤5)所述固体发酵培养子实体的温度为23～27℃，相对湿度40～80％，光照强度50～300Lux，8～12小时通风一次，培养

15～25天。

说明书

细脚棒束孢子实体生产的培养基及工业化培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种细脚棒束孢子实体生产的培养基及工业化培养方法。

背景技术

[0002] 细脚棒束孢（Isaria tenuipes），旧称细脚拟青霉（Paecilomyces tenuipes），为高雄山虫草(Coryceps takaomantana)的无性型。细脚棒束孢培养物具有免疫调节活性、抗肿瘤、降血糖、减少血脂中胆固醇含量、抑制皮肤炎症、预防和治疗外源化学物质的侵袭和病毒侵染、抗氧化、提高常压耐缺氧能力和镇静、镇痛等作用。

[0003] 在自然条件下细脚棒束孢的寄主为鳞翅目幼虫或蛹，尽管该菌种为世界性分布，但分布数量并不多，大量采集存在困难。在中国、日本、韩国开展了细脚棒束孢的人工培养及其应用研究。陈祝安报道了细脚棒束孢培养性状（真菌学报，1989，8(3):214-220）。在日本和韩国，关于细脚棒束孢的研究，更多的侧重于以家蚕或其它昆虫为活体寄主进行人工培养（Sang-Duk Ji.Mycobiology,2011,39(3):158-163）。但活的家蚕或其他昆虫来源受地理和季节限制，且单一的家蚕价格昂贵，不适合大规模工业培养，因此也难以广泛应用于下游产品的开发。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于，克服现有技术的缺陷，公开了能够实现细脚棒束孢子实体培养的细脚棒束孢培养基和细脚棒束孢子实体工业化培养方法。本发明通过斜面培养基、摇瓶种子培养基、发酵罐种子培养基分别制备斜面孢子、一级种子、以及二级种子，同时以小麦或大麦为主料，以蚕蛹粉为辅料，采用蒸料罐蒸煮灭菌，将二级种子入蒸料罐，通过蒸料罐旋转混合均匀，然后采用自动分装机分装到培养盒内，再通过振动床将培养基振动平整，覆膜密封，移入培养室内进行固体发酵培养，控制培养过程中温度、光照、湿度、通风等条件，培养获得细脚棒束孢子实体，实现蒸煮、灭菌、培养一体化和自动化，适用于细脚棒束孢子实体的工业化生产。

[0005] 本发明公开了一种细脚棒束孢子实体的工业化培养方法，具体步骤如下：

[0006] 1)菌种活化：将细脚棒束孢接种到斜面培养基上培养，获得斜面孢子，收集斜面孢子，制备孢子液；

[0007] 2)种子液的制备：

[0008] A．一级种子液的制备：将上一步的孢子液接入摇瓶种子培养基进行培养，获得一级种子液；

[0009] B．二级种子液的制备：将上一步的一级种子液接入发酵罐种子培养基，发酵培养获得二级种子液；

[0010] 3)固体发酵培养基的制备：将固体培养基原料加入蒸料罐内，灭菌，冷却，获得用于培养细脚棒束孢子实体的固体培养基；

[0011] 4)将步骤2）制备的二级种子液加入步骤3）蒸料罐内的固体培养基中，通过蒸料罐旋转的方式，将固体培养基与种子液混合均匀，通过自动分装机分装至固体发酵培养盒，覆膜密封，通过振动床将培养盒内的培养基振动平整；

[0012] 5)固体发酵：将步骤4）培养基振动平整的培养盒移入培养室，培养获得细脚棒束孢子实体。

[0013] 较优的，步骤1）所述斜面培养基配方如下：

[0014]

[0015] 所述培养基配方中，马铃薯的处理方法是马铃薯沸水煮30min，纱布过滤，取滤液与其他组分混合；蝉蛹的处理方法是蝉蛹沸水煮30min，纱布过滤，取滤液与其他组分混合。

[0016] 较优的，步骤1）斜面孢子的培养条件为：23~27℃，黑暗培养10~15天。

[0017] 所述孢子液是用灭菌水洗脱斜面培养基上的斜面孢子获得。

[0018] 较优的，步骤1）所述孢子液的浓度为106~107个孢子/ml。

[0019] 较优的，步骤2）所述摇瓶种子培养基配方如下：

[0020] 马铃薯 10～20wt%

[0021] 蔗糖 1~2wt%

[0022] 水 余量。

[0023] 较优的，步骤2）中孢子液接入摇瓶种子培养基的接种量为5~10v/v%。

[0024] 更优的，步骤2）一级种子的培养温度为23~27℃，转速为120~180rpm，培养36~48h。

[0025] 较优的，步骤2）所述发酵罐种子培养基的配方如下：

[0026]

[0027] 较优的，步骤2）中一级种子接入发酵罐种子培养基的接种量为5~10v/v%。

[0028] 较优的，二级种子的培养温度为23~27℃，通气量1.5~2.5vvm，搅拌速率200~300rpm，培养48~72小时。

[0029] 较优的，步骤3）所述固体培养基配方为：小麦和/或大麦：蚕蛹粉：水的质量比为1～1.5:0.05～0.3:1～2.5。

[0030] 较优的，步骤3）所述固体培养基在121℃下灭菌40~60分钟，灭菌时保持蒸料罐旋转，冷却，制备得到的培养基作为培养细脚棒束孢子实体的固体培养基。

[0031] 较优的，步骤4）中二级种子液接入固体培养基的接种量为5~10v/w%。

[0032] 更优的，步骤4）在室温下通过旋转的方式，将固体培养基与菌丝体混合均匀。

[0033] 更优的，步骤4）通过自动分装机分装至固体发酵培养盒，覆膜密封。

[0034] 更优的，步骤4）在震动床振动将培养盒内的培养基振动平整。

[0035] 较优的，步骤5）所述固体发酵培养子实体的温度为23～27℃，相对湿度40～80%，光照强度50～300Lux，8～12小时通风一次，培养15～25天。

[0036] 本发明的有益效果为：本发明提供了一种通过人工培养的方法大量生产细脚棒束孢子实体的工厂化培养方法，通过斜面种子、摇瓶种子、发酵罐种子进行扩大培养，以小麦或大麦为培养基主料，以蚕蛹粉为培养基辅料，采用蒸料罐蒸煮灭菌，将二级种子入蒸料罐通过蒸料罐旋转混合均匀，然后采用自动分装机分装到培养盒内，再通过振动床将培养基振动平整，覆膜密封，移入培养室内，控制培养过程中温度、光照、湿度、通风等条件，培养获得细脚棒束孢子实体，可实现细脚棒束孢的工业化生产，本发明方法培养的细脚棒束孢子实体的得率为15~20%（即每投料1Kg可产子实体150~200克），高于现有技术的9%的产量；腺苷含量达1.2mg/g，远高于文献报道的0.33mg/g（Hong In-Pyo,Mycobiology,2007,35(4):215-218）；并且，与用家蚕培养的细脚棒束孢子实体相比，本发明细脚棒束孢子实体的培养方法产量高、产品品质好，产品价格相对低廉，实现了细脚棒束孢子实体的大规模工业化培养，具有较好的工业及医疗应用前景。

附图说明

[0037] 图1：细脚棒束孢固体培养子实体

具体实施方式

[0038] 下面通过具体实施例进一步描述本发明的技术方案。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0039] 实施例1细脚棒束孢子实体的工业化培养

[0040] 方法一：

[0041] 1.培养基的制备：

[0042] 1.1斜面培养基的制备：称取100克马铃薯，沸水煮30分钟，纱布过滤得滤液，加蔗糖20克，定容至500ml；称取100克蚕蛹，沸水煮30分钟，纱布过滤得滤液，定容至500ml；将制备的两种滤液混合，加琼脂20克，溶化、分装、灭菌，冷却获得斜面培养基备用。

[0043] 1.2摇瓶种子培养基：称取200克土豆，沸水煮30分钟，纱布过滤得滤液，加蔗糖20克，定容至1000ml，每瓶装量200ml，灭菌获得摇瓶种子培养基。

[0044] 1.3发酵罐种子培养基：称取蛋白胨450g、酵母膏300g、麦芽糖450g、葡萄糖300g，溶于30L水中，pH调至7.0，于50升发酵罐中灭菌，获得发酵罐种子培养基。

[0045] 1.4取小麦50Kg、蚕蛹粉2.5Kg、水125Kg，加入蒸煮罐，121℃灭菌40分钟，冷却，作为培养子实体的固体培养基。

[0046] 2.子实体的培养方法

[0047] 1）菌种活化：将细脚棒束孢菌接入斜面培养基，23℃黑暗培养15天，用灭菌水将6 7
孢子从斜面洗脱，制备浓度为10~10 个孢子/ml的孢子液；

[0048] 2）一级种子液的制备：将孢子液按照10v/v%的接种量接入摇瓶种子培养基，摇瓶培养条件，180rpm，23℃培养48小时，获得一级种子液。

[0049] 3）二级种子液的制备：按照10v/v%接种量将一级种子液接入发酵罐中，发酵条件：23℃，通气量1.5vvm，搅拌速率200rpm，培养72小时，获得二级种子液。

[0050] 4）种子液与固体培养基的混合、分装与振动：将二级种子按10v/w%接种量入蒸料罐内，通过蒸料罐旋转的方式，将固体培养基与菌丝体混合均匀，通过自动分装机分装至固体发酵培养盒，覆膜密封；然后通过振动床将培养盒内的培养基振动平整。

[0051] 5）固体发酵：将培养盒移入培养室培养，培养温度23～25℃，相对湿度40～50%，光照强度50~200Lux，每12小时通风一次，培养25天即可获得人工培养的子实体。

[0052] 6）子实体采收：把培养物倾倒入采收机，将子实体与残余培养基分离，40～50℃烘干即得干燥子实体。培养产物的产量为细脚棒束孢子实体干重160g±5g/1kg固体培养基。

[0053] 方法二

[0054] 1.培养基的制备：

[0055] 1.1斜面培养基的制备：称取150克马铃薯，沸水煮30分钟，纱布过滤得滤液；称取75克蚕蛹，沸水煮30分钟，纱布过滤得滤液；将马铃薯滤液和蚕蛹滤液混合，加蔗糖20克，定容至1000ml；加琼脂15克，溶化、分装、灭菌，冷却获得斜面培养基备用。

[0056] 1.2摇瓶种子培养基：称取150克土豆，沸水煮30分钟，纱布过滤得滤液，加蔗糖10克，定容至1000ml，每瓶装量200ml，灭菌获得摇瓶种子培养基。

[0057] 1.3发酵罐种子培养基：称取蛋白胨300g、酵母膏600g、麦芽糖900g、葡萄糖450g，溶于30L水中，pH调至6.0，于50升发酵罐中灭菌，获得发酵罐种子培养基。

[0058] 1.4取小麦150Kg、蚕蛹粉30Kg、水100Kg，加入蒸煮罐，121℃灭菌50分钟，冷却，作为培养子实体的固体培养基。

[0059] 2.子实体的培养方法

[0060] 1）菌种活化：将细脚棒束孢菌接入斜面培养基，25℃黑暗培养10天，用灭菌水将6 7
孢子从斜面洗脱，制备浓度为10~10 个孢子/ml的孢子液；

[0061] 2）一级种子液的制备：将孢子液按照5v/v%的接种量接入摇瓶种子培养基，摇瓶培养条件，150rpm，25℃培养40小时，获得一级种子液。

[0062] 3）二级种子液的制备：按照5v/v%接种量将一级种子液接入发酵罐中，发酵条件：25℃，通气量2.5vvm，搅拌速率250rpm，培养48小时，获得二级种子液。

[0063] 4）种子液与固体培养基的混合、分装与振动：将二级种子按7.5v/w%接种量入蒸料罐内，通过蒸料罐旋转的方式，将固体培养基与菌丝体混合均匀，通过自动分装机分装至固体发酵培养盒，覆膜密封；然后通过振动床将培养盒内的培养基振动平整。

[0064] 5）固体发酵：将培养盒，移入培养室培养，培养温度24～26℃，相对湿度70～80%，光照强度200～300Lux，每10小时通风一次，培养15天即可获得人工培养的子实体。

[0065] 6）采收子实体：把培养物倾倒入采收机，将子实体与残余培养基分离，40～50℃烘干即得干燥子实体。培养产物的产量为：细脚棒束孢子实体干重200g±4g/1kg固体培养基。

[0066] 方法三

[0067] 1.培养基的制备：

[0068] 1.1斜面培养基的制备：称取200克马铃薯，沸水煮30分钟，纱布过滤得滤液；称取50克蚕蛹，沸水煮30分钟，纱布过滤得滤液；将马铃薯滤液和蚕蛹滤液混合，加蔗糖10克，定容至1000ml；加琼脂15克，溶化、分装、灭菌，冷却获得斜面培养基备用。

[0069] 1.2摇瓶种子培养基：称取100克土豆，沸水煮30分钟，纱布过滤得滤液，加蔗糖15克，定容至1000ml，每瓶装量200ml，灭菌获得摇瓶种子培养基。

[0070] 1.3发酵罐种子培养基：称取蛋白胨900g、酵母膏450g、麦芽糖300g、葡萄糖900g，溶于30L水中，pH调至6.5，于50升发酵罐中灭菌，获得发酵罐种子培养基。

[0071] 1.4取小麦125Kg、蚕蛹粉37.5Kg、水100Kg，加入蒸煮罐，121℃灭菌60分钟，冷却，作为培养子实体的固体培养基。

[0072] 2.子实体的培养方法

[0073] 1）菌种活化：将细脚棒束孢菌接入斜面培养基，27℃黑暗培养13天，用灭菌水将6 7
孢子从斜面洗脱，制备浓度为10~10 个孢子/ml的孢子液；

[0074] 2）一级种子液的制备：将孢子液按照7.5v/v%的接种量接入摇瓶种子培养基，摇瓶培养条件，120rpm，27℃培养36小时，获得一级种子液。

[0075] 3）二级种子液的制备：按照7.5v/v%接种量将一级种子液接入发酵罐中，发酵条件：27℃，通气量2.0vvm，搅拌速率300rpm，培养60小时，获得二级种子液。

[0076] 4）种子液与固体培养基的混合、分装与振动：将二级种子按5v/w%接种量入蒸料罐内，通过蒸料罐旋转的方式，将固体培养基与菌丝体混合均匀，通过自动分装机分装至固体发酵培养盒，覆膜密封；然后通过振动床将培养盒内的培养基振动平整。

[0077] 5）固体发酵：将培养盒，移入培养室培养，培养温度25～27℃，相对湿度40～80%，光照强度100～250Lux，每8小时通风一次，培养20天即可获得人工培养的子实体。

[0078] 6）采收子实体：把培养物倾倒入采收机，将子实体与残余培养基分离，烘干即得干燥子实体。本实施例培养所得的子实体见图1，培养产物的产量为：细脚棒束孢子实体干重180g±5.5g/1kg固体培养基。

[0079] 实施例2

[0080] 对细脚拟青霉人工培养产物的有效成分：腺苷及虫草酸含量进行检测，样品取自实施例1方法三。

[0081] （1）腺苷含量测定

[0082] 腺苷测定参考2010年版中国药典的方法进行。

[0083] 仪器与试药：Waters高效液相色谱仪（1525BINARY HPLC PUMP，2998 Photodiode Array Detector，美国Waters公司）；乙腈（HPLC级，Fisher）；磷酸二氢钾（AR级，国药集团化学试剂有限公司）；石油醚（AR级，60-90℃，国药集团化学试剂有限公司）；腺苷（A9251-1G，Sigma公司）。色谱条件，色谱柱：XBridge C18色谱柱（Waters，4.6mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-0.04mol/L磷酸二氢钾（5:95）；流速：1.0mL/min；检测波长：260nm；
柱温：35℃；进样量：20μL。

[0084] （2）虫草酸含量测定

[0085] 仪器与试药：

[0086] 紫外可见分光光度计；电子天平；离心机H-1650；电热恒温水箱CU600型；可调式封闭电炉。甘露醇标准品、醋酸铵、乙酰丙酮、冰醋酸、高碘酸钾、L-鼠李糖，均为AR级、国药集团化学试剂有限公司生产。

[0087] 试剂配制：

[0088] 高碘酸钾溶液：15mmol(即3.45g)高碘酸钾溶于1L0.12mol/L盐酸溶液中；Nash试剂：150g醋酸铵+2mL冰醋酸+2mL乙酰丙酮，用蒸馏水稀释至1L(现用现配)；L-鼠李糖溶液：L-鼠李糖100mg，用蒸馏水定容至100mL。

[0089] 精确称取1.0034g样品，置于干燥的500mL锥形瓶内，记录锥形瓶与样品的总质量m1，向锥形瓶中加入沸腾蒸馏水100mL，放置于电炉之上使其持续沸腾15min后，迅速放于冷水中冷却至室温，取出，擦干瓶外壁的水珠，加入蒸馏水至最终质量为m1+100g，摇匀，过滤，取滤液，即为待测样品，-20℃保存。

[0090] 精密称取D-甘露醇标准品0.1g于烧杯中，加少量蒸馏水溶解完全，转移至100mL容量瓶中定容，配制成1mg/mL的甘露醇溶液，进行稀释后，得到质量浓度分别为10、50、90、130、170mg/L的甘露醇标准溶液。取上述浓度标准品甘露醇溶液各1mL，分置不同试管中，然后分别加1mL高碘酸钠溶液，混匀，室温放置10min，加2mL0.1%L-鼠李糖溶液以除去过多的高碘酸盐，振荡混匀，加4mL新鲜配制的Nash试剂，53℃水浴加热15min使其显色，快速冷却至室温，在412nm波长处测定其吸光度。以蒸馏水代替甘露醇标准溶液，用同样的方法操作作为对照，测定其吸光度。以标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。

[0091] 将供试样品提取液加蒸馏水8倍稀释，取1ml稀释后的样品置于具塞试管中，测定吸光值，每管样品测3次Abs，求出平均值，由回归方程得待测液虫草酸浓度c，由已知的检测液体积v，样品质量m，根据下列公式得到供试品虫草酸含量（mg/g）。

[0092]

[0093] 结果显示，腺苷标准曲线，腺苷标准曲线y=7.08e+004x-1.05e+004,R2=0.999978，在1～100μg/mL与峰面积线性关系良好。

[0094] 虫草酸标准曲线，以标准品甘露醇浓度（mg/mL）为横坐标，Abs为纵坐标，得回归方程：y=0.0826x+0.0019，R2=0.9998，说明标准品甘露醇量在0～21.25mg/L范围内，与Abs呈良好的线性关系。

[0095] 经计算细脚拟青霉人工培养产物中，腺苷含量达1.2mg/g，虫草酸含量达35.0mg/g。

[0096] 与以家蚕培养的细脚棒束孢子实体相比，本发明的细脚棒束孢子实体可在人工控制条件下进行大规模的工业化培养，产量高且品质好，产品价格相对低廉，具有较好的工业应用前景。