一种松藻多糖的应用转让专利
申请号 : CN201310661898.2
文献号 : CN103622990B
文献日 : 2015-06-10
发明人 : 张全斌 , 王晶 , 张虹 , 牛锡珍
申请人 : 南通中国科学院海洋研究所海洋科学与技术研究发展中心 , 中国科学院海洋研究所
摘要 :
本发明提供了一种松藻多糖在抗补体药物中的应用。所述松藻多糖具有补体活性，所述松藻多糖的应用是指具有补体活性的松藻多糖在制备抗补体药物或/和抗补体保健品中的应用。本发明首次发现松藻多糖对经典途径和旁路途径补体活性有显著的抑制作用，并公开了将松藻多糖应用于制备抗补体药物和保健品，能够抑制补体系统的过度激活，从而对由于补体系统过度激活而导致的统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病有一定的预防和治疗作用。
权利要求 :
1. 一种松藻多糖的应用，其特征在于，所述松藻多糖具有补体活性，所述松藻多糖的应用是指具有补体活性的松藻多糖在制备抗补体药物或/和抗补体保健品中的应用。
2. 根据权利要求1所述松藻多糖的应用，其特征在于，所述松藻多糖分子量范围为
20~350 kD。
3. 根据权利要求1所述松藻多糖的应用，其特征在于，所述松藻多糖主要组成单糖为半乳糖和木糖，两者的摩尔比例为3~5：1，硫酸基含量为15%~45%。
4. 根据权利要求1所述松藻多糖的应用，其特征在于，所述松藻多糖按照以下方法制备：采用热水提取法提取，过滤，将提取液透析脱盐，将透析截留液浓缩，将浓缩液喷雾干燥、冷冻干燥或乙醇沉淀法制得松藻多糖。
5. 根据权利要求4所述松藻多糖的应用，其特征在于：所述的松藻多糖来源于绿藻门，绿藻纲，羽藻目，松藻科。
说明书 :
一种松藻多糖的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种具有补体活性的松藻多糖的应用。
背景技术
[0002] 补体系统是人体重要的免疫防御系统之一，然而该系统的非正常激活会引起人体免疫系统的过度反应，造成人体自身正常组织的损伤。研究表明补体的过度激活会参与多种疾病的病理过程，如类风湿性关节炎、老年性痴呆、系统性红斑狼疮、器官移植后的排斥反应、多器官功能衰竭综合症、急性心肌梗死、急性呼吸窘迫综合征 (ARDS)等。目前对此类疾病尚无理想的治疗药物，同时鉴于补体过度激活在引发人类许多危重疾病中的重要作用，急需寻找高效、低毒、专一的新型补体抑制剂。
[0003] 海洋是地球上所占面积最大的区域，因此开发海洋药物越来越受到重视，而海洋物质提取在制备和开发抗补体药物和保健品方面有着不可估计的社会和经济效益。
[0004] 刺松藻(Codium fragile (Suringar) Hariot)属于绿藻门，绿藻纲，羽藻目，松藻科(Codiaceae)，是一种世界性分布海藻。刺松藻的藻体呈树枝状，多为鹿角形分枝，少数为扁平状，内部为海绵形结构，由管状丝状体交织组成，成直立或甸甸生长，高达20-40 厘米，它们多生长在中低潮带的岩石上。刺松藻在古代是治水肿的药物，后来人们发现它驱蛔虫效果更好。全藻具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗凝血、利尿消肿，并有很强的杀灭肠道寄生虫的作用。少量的文献报道了松藻多糖具有抗凝血、抗氧化等生物活性，但松藻多糖的抗补体活性尚未研究。
发明内容
[0005] 本发明针对现有技术的不足，提供一种具有补体活性的松藻多糖在制备抗补体药物和保健品中的应用。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种松藻多糖的应用，所述松藻多糖具有补体活性，所述松藻多糖的应用是指具有补体活性的松藻多糖在制备抗补体药物或/和抗补体保健品中的应用。
[0007] 其中，所述的松藻多糖分子量范围为20~350 kD。
[0008] 其中，所述的松藻多糖主要组成单糖为半乳糖和木糖，两者的摩尔比例为3~5：1，硫酸基含量为15%~45%。
[0009] 其中，所述松藻多糖按照以下方法制备：采用热水提取法提取，过滤，将提取液透析脱盐，将透析截留液浓缩，将浓缩液喷雾干燥、冷冻干燥或乙醇沉淀法制得松藻多糖。
[0010] 其中，所述的松藻多糖来源于绿藻门，绿藻纲，羽藻目，松藻科(Codiaceae)。
[0011] 本发明公开了所述松藻多糖通过经典途径或旁路途径进行抗补体活性测定有显著的抗补体活性。
[0012] 上述经典途径测定抗补体活性的方法是：取100 μL用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 样品液加入试管；再加入100 μL以葡萄糖明胶巴比妥缓冲盐水按1：1008
稀释的正常豚鼠血清和100 μL致敏的绵羊红细胞(5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；
稀释的正常豚鼠血清和100 μL致敏的绵羊红细胞(5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；
[0013] 上述替代途径测定抗补体活性的方法是：取100 μL用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 的样品液加入试管；再加入等体积用GVB-Mg-EGTA(2×) 缓冲液( 含5 mMC巴比妥钠，0.14 mol/LNaCl，0.1％明胶，4 mmol/L 氯化镁，16 mmol/L EGTA，pH 7.4)，按1:28
稀释的正常豚鼠血清和100 μL兔红细胞悬液(1.5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1 mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；
稀释的正常豚鼠血清和100 μL兔红细胞悬液(1.5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1 mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；
[0014] 采用上述方法对松藻多糖进行抗补体活性测定，得到以下结果：松藻多糖经典途径抗补体活性的CH50值是0.0098- 0.0140 mg/mL，与阳性药肝素0.0206 mg/mL 相比，表现出非常好的抗补体活性；旁路途径抗补体活性的AP50 值是0.0075-0.0446 mg/mL，与阳性药肝素0.0887 mg/mL 相比也表现出非常好的活性。
[0015] 本发明首次发现松藻多糖对经典途径和旁路途径补体活性有显著的抑制作用，并公开了将松藻多糖应用于制备抗补体药物和保健品，能够抑制补体系统的过度激活，从而对由于补体系统过度激活而导致的统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病有一定的预防和治疗作用。
附图说明
[0016] 图1是松藻多糖CF经典途径的抗补体活性。其结果以平均值±SD表示。
[0017] 图2是松藻多糖CF旁路途径的抗补体活性。其结果以平均值±SD表示。
[0018] 图3是松藻多糖UF经典途径的抗补体活性。其结果以平均值±SD表示。
[0019] 图4是松藻多糖UF旁路途径的抗补体活性。其结果以平均值±SD表示。
[0020] 图5是松藻多糖GF经典途径的抗补体活性。其结果以平均值±SD表示。
[0021] 图6是松藻多糖GF旁路途径的抗补体活性。其结果以平均值±SD表示。
具体实施方式
[0022] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
[0023] 实施例1，刺松藻多糖（CF）的制备
[0024] 取刺松藻干品50 g，用2000 mL 自来水在高压锅中于115℃提取3 小时，筛绢过滤分离藻渣，硅藻土助滤，过滤提取液，滤液浓缩后装入截留分子量为3500 Da 的透析袋中透析，自来水透析48 小时，蒸馏水透析24 小时，浓缩至小体积后冷冻干燥，即得水提取的刺松藻多糖粗品（CF），得率为2.10%。
[0025] CF的化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量，分子量测定结果见表1。IR谱图-1 -1结果表明刺松藻为硫酸多糖，在1242 cm 和845 cm 左右出现硫酸基特征吸收峰。
[0026] 表1. 刺松藻多糖（CF）的化学分析
[0027]
[0028] 实施例2，实施例1 CF样品经典途径的抗补体活性作用
[0029] 本试验通过经典途径抗补体活性来反映样品对补体作用大小，来说明其在抗补体活性方面的作用。
[0030] 测试样品：实施例1中刺松藻多糖CF
[0031] 试验方法：取100 μL 用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 样品液加入试管；再加入100 μL 以葡萄糖明胶巴比妥缓冲盐水按1：100稀释的正常豚鼠血清和1008
μL 致敏的绵羊红细胞(5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。
μL 致敏的绵羊红细胞(5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。
[0032] 结果：上述经典途径测定结果显示（图1），CF在低浓度时就表现出对于补体溶血活性的良好抑制作用，CH50 （血清总补体50%溶血活性）值为0.0129mg/mL，与阳性对照样品肝素的CH50 值0.0206mg/mL相比，CF的CH50 值远低于阳性对照样品肝素，说明CF在较低浓度时即具有抗补体作用。随着浓度的增大，CF的抑制作用还有所增加。
[0033] 实施例3，实施例1 CF样品旁路途径的抗补体活性作用
[0034] 本试验通过旁路途径抗补体活性来反映样品对补体作用大小，来说明其在抗补体活性方面的作用。
[0035] 测试样品：实施例1中刺松藻多糖CF
[0036] 试验方法：取100 μL用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 的样品液加入试管；再加入等体积用GVB-Mg-EGTA(2×) 缓冲液( 含5 mMC巴比妥钠，0.14 mol/LNaCl，0.1％明胶，4 mmol/L氯化镁，1 6mmol/L EGTA，pH 7.4，按1:2稀释的正常豚鼠血清和100
8
μL兔红细胞悬液(1.5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。
8
μL兔红细胞悬液(1.5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。
[0037] 结果：如图2所示，CF在低浓度时就表现出对于旁路途径补体溶血活性的良好抑制作用，AP50 值（旁路途径50%溶血活性）为0.0227 mg/mL，与阳性对照样品肝素的AP50 值0.0887 mg/mL相比，CF的AP50 值远低于阳性对照样品肝素，说明CF在较低浓度时即具有抗补体作用。随着浓度的增大，CF的抑制作用还有所增加。
[0038] 实验例4，长松藻多糖C. cylindricum（UF）的制备
[0039] 取长松藻干品50g，用2000 mL 自来水在高压锅中于115℃提取3 小时，筛绢过滤分离藻渣，硅藻土助滤，过滤提取液，滤液浓缩后装入截留分子量为3500 Da 的透析袋中透析，自来水透析48 小时，蒸馏水透析24 小时，浓缩至小体积后冷冻干燥，即得水提取的长松藻多糖粗品（UF），得率为4.20%。
[0040] UF的化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量，分子量测定结果见表2。IR谱图-1 -1结果表明刺松藻为硫酸多糖，在1245 cm 和842 cm 左右出现硫酸基特征吸收峰。
[0041] 表1. 长松藻多糖（UF）的化学分析
[0042]
[0043] 实施例5，测试实施例4 UF样品经典途径的抗补体活性作用
[0044] 本试验通过经典途径抗补体活性来反映样品对补体作用大小，来说明其在抗补体活性方面的作用。
[0045] 测试样品：实施例4中长松藻多糖UF
[0046] 试验方法：取100 μL用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 样品液加入试管；再加入100 μL以葡萄糖明胶巴比妥缓冲盐水按1：100稀释的正常豚鼠血清和100 μL 致敏的绵羊红细胞(5×108 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。
[0047] 结果：上述经典途径测定结果显示（图3），UF在低浓度时就表现出对于补体溶血活性的良好抑制作用，CH50 值为0.0098mg/mL，而阳性对照样品肝素的CH50 值为0.0206mg/mL，UF的CH50 值大大低于阳性对照样品肝素，说明UF在较低浓度时即具有抗补体作用。随着UF浓度的增大，其对于补体活性的抑制作用还有所增加。
[0048] 实验例6：测试实施例4 UF样品旁路途径的抗补体活性作用
[0049] 本试验通过旁路途径抗补体活性来反映样品对补体作用大小，来说明其在抗补体活性方面的作用。
[0050] 测试样品：实施例4中长松藻多糖UF
[0051] 试验方法：取100 μL用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 的样品液加入试管；再加入等体积用GVB-Mg-EGTA(2×) 缓冲液( 含5mMC巴比妥钠，0.14 mol/LNaCl，0.1％明胶，4 mmol/L 氯化镁，16 mmol/L EGTA，pH 7.4)，按1:2稀释的正常豚鼠血清和100
8
μL兔红细胞悬液(1.5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。
8
μL兔红细胞悬液(1.5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。
[0052] 结果：如图4所示，UF在低浓度时就表现出对于旁路途径补体溶血活性的良好抑制作用，AP50 值为0.0075 mg/mL，而阳性对照样品肝素的AP50 值为0.0887 mg/mL，UF的AP50 值远远低于阳性对照样品肝素，说明UF在较低浓度时即具有抗补体作用。随着UF浓度的增大，其对于补体活性的抑制作用还有所增加。
[0053] 实施例7：杰氏松藻多糖C.geppii（GF）的制备
[0054] 取杰氏松藻干品50g，用2000 mL 自来水在高压锅中于115℃提取3 小时，筛绢过滤分离藻渣，硅藻土助滤，过滤提取液，滤液浓缩后装入截留分子量为3500 Da 的透析袋中透析，自来水透析48 小时，蒸馏水透析24 小时，浓缩至小体积后冷冻干燥，即得水提取的杰氏松藻多糖粗品（GF），得率为3.40%。
[0055] GF的化学组分分析，单糖比例分析，硫酸根含量，分子量测定结果见表3。IR谱图-1 -1结果表明长松藻为硫酸多糖，在1243 cm 和846 cm 左右出现硫酸基特征吸收峰。
[0056] 表3. 杰氏松藻多糖（GF）的化学分析
[0057]
[0058] 实验例8：上述实施例7 GF样品经典途径的抗补体活性作用
[0059] 本试验通过经典途径抗补体活性来反映样品对补体作用大小，来说明其在抗补体活性方面的作用。
[0060] 测试样品：实施例7中杰氏松藻多糖GF
[0061] 试验方法：取100 μL用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 样品液加入试管；再加入100 μL以葡萄糖明胶巴比妥缓冲盐水按1：100稀释的正常豚鼠血清和100 μL8
致敏的绵羊红细胞(5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长
405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100
致敏的绵羊红细胞(5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长
405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100
[0062] 结果：上述经典途径测定结果显示（图5），GF在低浓度时就表现出对于补体溶血活性的良好抑制作用，CH50 值为0.0140 mg/mL，阳性对照样品肝素的CH50 值为0.0206mg/mL，GF的CH50 值低于阳性对照样品肝素，说明GF在较低浓度时即具有抗补体作用。随着浓度的增大，GF的抑制作用还有所增加。
[0063] 实验例9：测试实施例7 GF样品旁路途径的抗补体活性作用
[0064] 本试验通过旁路途径抗补体活性来反映样品对补体作用大小，来说明其在抗补体活性方面的作用。
[0065] 测试样品：实施例7中杰氏松藻多糖GF
[0066] 试验方法：取100 μL用磷酸盐缓冲生理盐水配制的pH 7.0-7.5 的样品液加入试管；再加入等体积用GVB-Mg-EGTA(2×) 缓冲液( 含5mMC巴比妥钠，0.14 mol/LNaCl，0.1％明胶，4 mmol/L 氯化镁，16 mmol/L EGTA，pH7.4)，按1:2稀释的正常豚鼠血清和
8
100μL 兔红细胞悬液(1.5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。
8
100μL 兔红细胞悬液(1.5×10 个/mL)，轻轻混匀；37℃水浴孵育30 min，不时轻轻振摇，孵育后即加入1mL 冷生理盐水终止反应；于2000 r/min 转速下离心10 min，取上清液在波长405 nm 处测定光吸收值；样品对补体溶血活性的抑制率按下式计算：抑制率%=（标准对照OD值-样品OD值）/标准对照OD值*100。
[0067] 结果：如图6所示，GF在低浓度时就表现出对于旁路途径补体溶血活性的良好抑制作用，AP50 值为0.0446 mg/mL，阳性对照样品肝素的AP50 值为0.0887 mg/mL，GF的AP50 值低于阳性对照样品肝素，说明GF在较低浓度时即具有抗补体作用。随着浓度的增大，GF的抑制作用还有所增加。
[0068] 经典途径和旁路途径补体溶血活性的测定是最常用的两种测定样品抗补体活性的模型，松藻多糖对这两种途径的补体溶血活性具有明显的抑制作用，表明它可以用于抗补体药物和保健品的制备。
[0069] 本发明首次发现松藻多糖对经典途径和旁路途径补体活性有显著的抑制作用，并公开了将松藻多糖应用于制备抗补体药物和保健品，能够抑制补体系统的过度激活，从而对由于补体系统过度激活而导致的统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、急性呼吸窘迫综合征等多种疾病有一定的预防和治疗作用。
[0070] 以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。