本发明涉及一种色谱饼填料及其应用。所涉及的一种色谱饼填料为粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球。该填料的制备方法包括制备粒径小于1μm的聚苯乙烯种子液和制备粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球。所涉及的另外一种色谱饼填料为改性后的粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球。本发明的色谱饼填料颗粒均匀；改性后的色谱饼填料键合密度大、负载量高；所涉及的应用是将所涉及的改性填料用于分子量大于5000的多肽和蛋白质类生物大分子。
1.一种粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备方法，其特征在于，所述粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备方法包括以下步骤：制备聚苯乙烯种子液，所述聚苯乙烯种子的粒径小于1μm；
将聚苯乙烯种子液与十二烷基苯磺酸钠A混合，对聚苯乙烯种子液进行活化，得混合液一，其中聚苯乙烯种子液与十二烷基苯磺酸钠A的体积比为(0.2～0.4):1；
将邻苯二甲酸二丁酯和十二烷基苯磺酸钠B与混合液一混合，在25～40℃温度下对邻苯二甲酸二丁酯进行活化，得混合液二，其中邻苯二甲酸二丁酯的质量为聚苯乙烯种子液质量的25％～30％，十二烷基苯磺酸钠B的质量为邻苯二甲酸二丁酯质量的15～20倍；
将甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、无水乙醇和过氧化苯甲酰与混合液二混合，使过氧化苯甲酰溶解，得混合液三，其中甲基丙烯酸环氧丙酯的质量为聚苯乙烯种子液质量的40.0％～80.0％，乙二醇二甲基丙烯酸酯的质量为聚苯乙烯种子液质量的
40.0％～80.0％，无水乙醇的质量为聚苯乙烯种子液质量的150％～250％，过氧化苯甲酰的质量为聚苯乙烯种子液质量的5.0％～12.0％；
将混合液三与十二烷基苯磺酸钠C、体积百分比浓度为2％～5％的聚乙烯醇混合，先在20～30℃下溶胀8～16小时，然后在68～75℃下聚合反应12～32小时，得粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球；其中十二烷基苯磺酸钠C的体积为甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、无水乙醇和过氧化苯甲酰总体积的40％～75％，聚乙烯醇的体积为甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、无水乙醇和过氧化苯甲酰总体积的8％～25％；
所述十二烷基苯磺酸钠A、十二烷基苯磺酸钠B和十二烷基苯磺酸钠C均为质量百分比浓度是1％～5％的十二烷基苯磺酸钠。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备聚苯乙烯种子液包括：苯乙烯、过氧化苯甲酰、聚乙烯吡咯烷酮在无水乙醇中于68～75℃下进行反应得到粒径小于1μm的聚苯乙烯种子，其中：以所有反应物质的质量百分比之和为100％计，苯乙烯
7.0％～15.0％、过氧化苯甲酰0.4％～0.8％、聚乙烯吡咯烷酮0.5％～1.0％、无水乙醇
3.一种色谱饼填料，其特征在于，该色谱饼填料为改性后的权利要求1或2所制备的粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球，该改性后的粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备方法如下：经酸水解后的粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球与带有功能配基的化合物进行反应；所述的功能配基为苯基、羟基或羧基。
4.如权利要求3所述的色谱饼填料，其特征在于，所述酸水解的条件为：pH＜2.0，温度25～40℃，水解时间4～8小时；所述反应条件为：pH＝10、50～65℃、反应时间8～
5.如权利要求3所述的色谱饼填料，其特征在于，所述的甲基丙烯酸环氧丙酯微球与带有功能配基的化合物的质量比为(1.5～2.5):1。
6.权利要求3、4、或5所述的色谱饼填料用于分离分子量大于5000的多肽和蛋白质类生物大分子的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述分离条件包括：色谱饼尺寸为内径5～
一种色谱饼填料及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及高效液相色谱填料，具体涉及一种色谱饼填料及其应用。
背景技术
[0002] 高效液相色谱（HPLC）作为一种高效的分离分析手段，现已广泛应用于各个领域，如分析化学、生物化学、环境化学等。随着色谱技术的发展和科技的进步，色谱分离分析所涉及的样品也越来越复杂，往往一个样品里含有成千上万种组分，传统的HPLC技术已经难以满足对复杂样品的高效快速分离要求。
[0003] 本领域公知，色谱柱（固定相）是色谱的核心，通过减小固定相粒径可显著增加柱效，但问题是：一方面小颗粒填料的成本很高，另一方面填料颗粒减小会使柱压大幅度提高，这对目前使用的HPLC系统提出了新的挑战，包括输液泵、梯度混合器、进样系统以及检测器等都无法适应超高压的要求。
[0004] 考虑到色谱柱的压力与柱长成反比，通过降低柱长可有效减小柱压。耿信笃等[刘彤，耿信笃.西北大学学报（自然科学版），1999,29(2):122-126]提出了生物大分子分离的短柱理论，并设计了直径5～50cm，厚度仅为2cm的一系列色谱饼，首次实现了对变性蛋白的复性并同时纯化。但现有的色谱饼填料主要为小颗粒的硅胶，其成本较高。
发明内容
[0005] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明的目的之一在于提供一种成本低、柱效高的色谱饼填料。
[0006] 为此，本发明色谱饼填料为粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球。
[0007] 所述粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备方法包括以下步骤：
[0008] 制备聚苯乙烯种子液，所述聚苯乙烯种子的粒径小于1μm；
[0009] 制备粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球：
[0010] 将聚苯乙烯种子液与十二烷基苯磺酸钠A混合，对聚苯乙烯种子液进行活化，得混合液一，其中：聚苯乙烯种子液与十二烷基苯磺酸钠A的体积比为（0.2～0.4）:1；
[0011] 将邻苯二甲酸二丁酯和十二烷基苯磺酸钠B与混合液一混合，在25～40℃温度下对邻苯二甲酸二丁酯进行活化，得混合液二，其中：邻苯二甲酸二丁酯的质量为聚苯乙烯种子液质量的25%～30%，十二烷基苯磺酸钠B的质量为邻苯二甲酸二丁酯质量的15～20倍；
[0012] 将甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、无水乙醇和过氧化苯甲酰与混合液二混合，使过氧化苯甲酰溶解，得混合液三，其中：甲基丙烯酸环氧丙酯的质量为聚苯乙烯种子液质量的40.0%～80.0%，乙二醇二甲基丙烯酸酯的质量为聚苯乙烯种子液质量的40.0%～80.0%，无水乙醇的质量为聚苯乙烯种子液质量的150%～250%，过氧化苯甲酰的质量为聚苯乙烯种子液质量的5.0%～12.0%；
[0013] 将混合液三与十二烷基苯磺酸钠C、体积百分比浓度为2%～5%的聚乙烯醇混合，先在20～30℃下溶胀8～16小时，然后在68～75℃下聚合反应12～32小时，得粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球；其中：十二烷基苯磺酸钠C的体积为甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、无水乙醇和过氧化苯甲酰总体积的40%～75%，聚乙烯醇的体积为甲基丙烯酸环氧丙酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、无水乙醇和过氧化苯甲酰总体积的8%～25%；
[0014] 所述十二烷基苯磺酸钠A、十二烷基苯磺酸钠B和十二烷基苯磺酸钠C均为质量百分比浓度是1%～5%的十二烷基苯磺酸钠。
[0015] 所述制备聚苯乙烯种子液包括：苯乙烯、过氧化苯甲酰、聚乙烯吡咯烷酮在无水乙醇中于68～75℃下进行反应得到粒径小于1μm的聚苯乙烯种子，其中：以该步骤所有反应物质的质量百分比之和为100%计，苯乙烯7.0%～15.0%、过氧化苯甲酰0.4%～0.8%、聚乙烯吡咯烷酮0.5%～1.0%、无水乙醇75.0%～90.0%，其他组分为去离子水。
[0016] 针对现有技术的缺陷或不足，本发明还提供另外一种色谱饼填料。
[0017] 为此，另外一种色谱饼填料为改性后的粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球，该改性后的粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球的制备方法如下：
[0018] 经酸水解后的粒径小于等于2μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球与带有功能配基的化合物进行反应；所述的功能配基为苯基、羟基或羧基。
[0019] 所述酸水解的条件为：pH＜2.0，温度25～40℃，水解时间4～8小时；所述反应条件为：PH=10、50～65℃、反应时间8～16小时。
[0020] 所述的甲基丙烯酸环氧丙酯微球与带有功能配基的化合物的质量比为（1.5～2.5）:1。
[0021] 与现有设计相比，本发明的色谱饼填料具有以下优点：
[0022] 本发明的色谱饼填料颗粒均匀。改性后的色谱饼填料键合密度大、负载量高。
[0023] 针对现有技术的缺点或不足，本发明的又一目的在于提供关于上述改性的粒径小于等于2μm的无孔交联甲基丙烯酸环氧丙酯微球的应用。
[0024] 为此，所提供的应用是将其用于分离分子量大于5000的多肽和蛋白质类生物大分子。
[0025] 所述分离条件包括：色谱饼尺寸为：内径5～50cm，厚度1～2cm；柱压＜3.0Mp。
[0026] 与现有设计相比，本发明的应用效果如下：
[0027] 将本发明亚2μm聚合物色谱固定相装入色谱饼中实现了小颗粒聚合物色谱填料对蛋白质的高效、快速和低压分离。在流速为2.0mL/min条件下系统压力小于3.0Mpa，并且能够在2.5min时间内实现对多种蛋白的快速分离。
附图说明
[0028] 图1为实施例1合成的线性聚苯乙烯种子以及甲基丙烯酸环氧丙酯微球的显微镜照片；图1（a）为0.5μm线性聚苯乙烯种子放大10000的显微镜照片，图1（b）为溶胀后的1.8μm甲基丙烯酸环氧丙酯微球经放大5000倍的显微镜照片；
[0029] 图2实施例3改性后的亚2微米聚合物填料在色谱饼中对5种标准蛋白的快速分离图，该图中的1、2、3、4、5分别代表肌红蛋白、核糖核酸酶、细胞色素C、α-糜蛋白酶和溶菌酶。
具体实施方式
[0030] 本发明的色谱填料可用作反相、疏水及离子交换填料。
[0031] 本发明所述的亚2微米指的是小于等于2微米。
[0032] 以下是发明人提供的具体实施例，以对本发明作进一步解释说明。
[0033] 实施例1：
[0034] 该实施例为亚2微米甲基丙烯酸环氧丙酯微球的合成。具体方法如下：
[0035] 引发剂过氧化苯甲酰0.5g和稳定剂聚乙烯吡咯烷酮1.0g于250mL反应瓶中，取80mL无水乙醇和15mL去离子水加入到反应瓶中，然后进行超声溶解，待引发剂和稳定剂完全溶解后加入15mL苯乙烯，搅拌均匀后于70℃加热24h，搅拌速度为120r/min。最后得到的聚苯乙烯种子的粒径为0.5μm，分散系数为0.018，附图1（a）为苯乙烯种子在显微镜下放大10000倍形貌图片。
[0036] 将上述得到的苯乙烯种子在不经分离的条件下，直接用移液管移取苯乙烯种子液12mL于500mL三颈烧瓶中，同时加入40mL0.2%的SDS。
[0037] 另外再取5.0mL的邻苯二甲酸二丁酯与100mL0.2%的SDS混合，在细胞破碎仪上超声乳化10min后加入到三颈烧瓶中与苯乙烯种子混合，在搅拌速度为120r/min，温度为30℃条件下活化6h。
[0038] 将8.0mL甲基丙烯酸环氧丙酯、8.0mL乙二醇二甲基丙烯酸酯、25.0mL无水乙醇以及1.5g的过氧化苯甲酰混合，通过搅拌使引发剂溶解，然后再加入200mL0.2%SDS和75mL5%聚乙烯醇，待超声乳化至液面无油相后加入到种子活化液中进行室温溶胀12h，然后再升温到72℃进行聚合，搅拌速度为120r/min，反应时间为24h。待反应结束后离心除去上清液，并用热水和丙酮反复洗涤2～3次，60℃真空干燥4h即得到粒径为1.8μm、分散系数为0.025的甲基丙烯酸环氧丙酯微球。附图1（b）为1.8μm的甲基丙烯酸环氧丙酯微球在显微镜下放大10000倍形貌图片。
[0039] 实施例2：
[0040] 该实施例为甲基丙烯酸环氧丙酯微球的改性，具体方法如下：
[0041] 称取甲基丙烯酸环氧丙酯微球10.0g于250mL烧瓶中，然后加入1.0M的稀硫酸（也可用稀盐酸）120mL，水浴加热50℃，搅拌反应6h即可制得水解的微球；用0.5M氢氧化钠溶液调节PH=10，然后加入5.0mL的氯乙酸，60℃恒温反应12h，即可制得改性的弱阳离子交换填料。产物经蒸馏水和丙酮反复洗涤2～3次，然后60℃真空干燥4h。
[0042] 红外光谱证实该填料在1645cm-处的强吸收峰是-COOH的特征吸收峰，经测定树脂表面羧基含量为0.75mmol/g。
[0043] 实施例3：
[0044] 该实施例为实施例2制备的亚2μm弱阳离子交换填料的应用，具体方法如下：
[0045] 称取5.0g亚2μm弱阳离子交换填料于100mL烧杯中，加入50mL甲醇进行超声分散，然后用装柱机在2.5Mpa压力下装入到直径为5厘米、厚度为2厘米的色谱饼中。装完后将色谱饼连接到高效液相色谱仪上，在1.0mL/min的流速下，用蒸馏水冲洗30min。
[0046] 采用离子交换色谱流动相平衡色谱系统，流动相组成：A液，20mmol/LKH2PO4，pH=6.5；B液，20mmol/L KH2PO4+1.0mol/L NaCl，pH=6.5；流速为2.0mL/min；待仪器平衡后，分别将5mg/mL的细胞色谱C（Cyt-C）、核糖核酸酶（RNase）、肌红蛋白（Myo）、4,α-糜蛋白酶（α-Chy）以及溶菌酶（Lys）各10μL混合后进样到色谱系统中进行实验，色谱条件为：流速2.0mL/min；梯度100%A～100%B，2.0min，延长1min；检测波长为215nm。这5种蛋白的色谱分离图见附图2。
[0047] 从图2中可以看出，首先亚2μm聚合物填料能够在色谱饼中以较低的压力运行，在流速为2.0mL/min时系统压力不超过2.0Mpa；其次这5种标准蛋白在色谱饼中达到了基线分离，表明合成的弱阳离子交换聚合物色谱填料具有很高的分辨率，5种标准蛋白在2.0min种时间内实现了高效、快速分离，大大降低了分离时间。
