一种盐地碱蓬蛋白及其编码基因和应用

摘要

本发明公开了一种盐地碱蓬蛋白及其编码基因和应用，所述盐地碱蓬蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码基因的碱基序列如SEQ IDNo.2所示。所述应用包括：提取盐地碱蓬总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用引物扩增所述盐地碱蓬基因；利用该盐地碱蓬基因构建重组载体，并将该重组载体通过农杆菌介导法导入目标植物中，获得转化植物；从转化植物中筛选获得耐逆性植物。在目标植物中高表达该盐地碱蓬蛋白，能显著提高目标植物的耐逆性。

权利要求

1.一种盐地碱蓬蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述盐地碱蓬蛋白的编码基因，其特征在于，碱基序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有如权利要求2所述编码基因的表达单元或重组质粒。

4.如权利要求2所述盐地碱蓬基因在提高植物耐逆性中的应用，其特征在于，所述耐逆性为耐盐性和耐旱性中至少一种。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的植物为双子叶植物。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括：(1)提取盐地碱蓬总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用引物扩增所述盐地碱蓬基因；

(2)利用该盐地碱蓬基因构建重组载体，并将该重组载体通过农杆菌介导法导入目标植物中，获得转化植物；

(3)从转化植物中筛选获得耐逆性植物；

所述引物的碱基序列为：

上游引物：5’-TCTAGAATGGTGAGAGAAAAGATTAA-3’；

下游引物：5’-GGTACCTTAATATATCCCCCTGTTTC-3’。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述重组载体的原始载体为Super1300或pCAMBIA1300。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，将转化植物的T1代种子播种于含潮霉素B的筛选平板中，取阳性植株多代繁殖，获得稳定遗传的耐逆性植物。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述筛选平板中潮霉素B的浓度为80～

100μg/mL。

说明书

一种盐地碱蓬蛋白及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明属于功能基因组学领域，具体涉及一种盐地碱蓬蛋白及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 土壤盐渍化对农业的威胁是一个全球性的问题。全世界共有10亿公顷的盐碱地，约占世界陆地面积7.6%，我国盐碱地近1亿多公顷，农业耕地因盐渍化引起的减产、弃耕地就近333.5万公顷。近年来，我国设施农业的快速发展，特别是蔬菜和花卉大棚生产面积不断扩大，据统计，2005年全国蔬菜、花卉、瓜果等作物设施栽培面积达210万公顷。设施农业的发展为农业生产结构调整和提高农业生产效益发挥了重要作用，但是随着设施栽培时间延长，土壤次生盐渍化的问题日益加剧，严重影响了设施栽培作物的产量和品质，效益也随之下降，从而影响设施农业的健康发展。

[0003] 解决设施栽培土壤盐渍化一般采取以下两种措施：一是用石膏和硫磺等化学方法或用排水和灌溉洗盐等物理方法改良土壤；二是通过常规育种或生物技术手段培育耐盐作物品种，而前者投入成本高。通过培育适宜在盐碱地区栽培和设施栽培的农作物抗盐新品种将不仅能有效解决设施栽培土壤盐渍化问题，而且还能通过有效利用部分盐渍化土地而大大地缓解我国土地资源匮乏的问题。

[0004] 近年来，随着模式植物拟南芥和水稻基因组测序完成，植物基因组学研究已转入到功能基因组学。目前一些研究功能基因组学的新方法和实验技术体系如cDNA微阵列、基因芯片、基因表达系统分析（serial analysis of gene expression，SAGE）、基因敲除（gene knock out）和RNAi分析均能有效分析大量基因的表达和功能模式，并在耐盐性相关功能基因资源发掘上取得了一定进展。一些与渗透调节相关基因已从不同植物种类中被成功克隆并转化应用，如脯氨酸合成相关基因P5CS（KishorPBK,Hong Z,Miao G H,Hu CAA,Verma DPS.Overexpression of P5CSincreases proline production and confers osmotolerance in transgenic plants.Plant Physiol,1995,108:1387-1394）和甜菜碱脱氢酶BADH基因（肖岗，张耕耘，刘凤华等，山菠菜甜菜碱醛脱氢酶基因研究，科学通报，1995，40(8)：741-745）。

[0005] 植物体内Na+离子平衡是植物自身耐盐调节的重要机制。朱健康研究小组发现拟+南芥SOS基因系列的调控信号是植物自身调节Na离子平衡的重要途径之一。2005年，林鸿宣研究小组与美国栾升教授合作，成功克隆了水稻耐盐相关的数量性状基因SKC1。该基因能控制水稻植株地上部钠离子和钾离子的含量，维持钠和钾离子平衡，使过量钠离子不在茎叶等部位积累，并使钠离子回流到根部，减轻钠离子毒害，同时增加营养元素钾离子，从而增加水稻耐盐性。

[0006] 盐地碱蓬（Suaeda salsa(L.)Pall.）是一年生藜科碱蓬属草本植物，是一种生长于盐碱地和海滨沙滩的真盐生植物。目前，盐地碱蓬基因组未被测序，虽有一些基因如SsAPX、SsGST、SsNPS、SsPSI等被克隆，但是大部分基因的序列及功能未知。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种盐地碱蓬蛋白，在目标植物中高表达该盐地碱蓬蛋白，能显著提高目标植物的耐逆性。

[0008] 一种盐地碱蓬蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0009] 该盐地碱蓬蛋白能够上调超氧物歧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶等抗氧化酶活性，清除因高盐或低温胁迫产生过多的活性氧（超氧离子或过氧化氢），维持细胞体内活性氧水平在正常范围内，保护幼苗、植株免遭因高盐或低温引发的氧化损伤，提高植物抗逆能力。

[0010] 本发明还提供了所述盐地碱蓬蛋白的编码基因，及含有所述编码基因的表达单元、重组质粒或转化子；所述编码基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示。

[0011] 本发明还提供了所述盐地碱蓬基因在提高植物耐逆性中的应用。

[0012] 基于该盐地碱蓬蛋白的性能，本发明中所述植物耐逆性为耐高盐性、和耐旱性中至少一种；所述的植物为双子叶植物，如拟南芥、草莓、辣椒、茄子、番茄等。本发明以双子叶模式植物拟南芥为例对该盐地碱蓬基因在提高植物耐逆性中的作用进行了检验，表明该盐地碱蓬蛋白确实能显著提高植物耐高盐性及耐旱性。

[0013] 具体地，所述盐地碱蓬基因在提高植物耐逆性中的应用，包括：

[0014] （1）提取盐地碱蓬总RNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，利用引物扩增所述盐地碱蓬基因；

[0015] 所述引物的碱基序列为：

[0016] 上游引物：5’-TCTAGAATGGTGAGAGAAAAGATTAA-3’；

[0017] 下游引物：5’-GGTACCTTAATATATCCCCCTGTTTC-3’；

[0018] （2）利用该盐地碱蓬基因构建重组载体，并将该重组载体通过农杆菌介导法导入目标植物中，获得转化植物；

[0019] 所述重组载体的原始载体可选用Super1300或pCAMBIA1300；

[0020] （3）从转化植物中筛选获得耐逆性植物；

[0021] 将转化植物的T1代种子播种于潮霉素B筛选平板，取阳性植株多代繁殖，获得稳定遗传的耐逆性植物；优选地，所述筛选平板中潮霉素B的浓度为80～100μg/mL。

[0022] 与野生拟南芥相比，本发明获得的T3代稳定株系拟南芥能在含200mM氯化钠的MS固体培养基中正常生长，而野生拟南芥则全部白化死亡；对两种植株进行失水-复水试验时，本发明获得的T3代稳定株系复水能恢复正常生长，而野生拟南芥复水后无法恢复正常生长，且不久后即死亡。

[0023] 与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

[0024] 本发明发现SEQ ID No.1所示的盐地碱蓬蛋白是使盐地碱蓬具有耐高盐性的功能蛋白，并将编码该盐地碱蓬蛋白的基因（SEQ ID No.2）转化拟南芥，显著提高了拟南芥的耐高盐性和耐旱性；将该盐地碱蓬基因转化如其他双子叶植物中，一方面可以增加作物在盐碱地上的产量，实现对我国滨海地区盐碱地的有效利用；另一方面可以克服设施条件下蔬菜、花卉等植物因土壤返盐和季节变化降温（冬季和早春）引起的生育障碍，提高其产量和品质，增加农民收入。

具体实施方式

[0025] 一种盐地碱蓬基因在提高植物耐逆性中的应用，包括：

[0026] 1目标基因获取

[0027] （1）样品准备

[0028] 以3周的盐地碱蓬幼苗为材料，在25℃下水培1周，然后在含400mMNaCl水培液处理24h，收集盐地碱蓬幼苗的叶片。

[0029] （2）蛋白提取

[0030] 用冷丙酮/三氯乙酸沉淀法（参见：Salekdeh G H,Siopongco J,Wade L J,Ghareyazie B,Bennett J.A proteomic approach to analyzing drought-and salt-responsiveness in rice.Field Crop Res,2002,76（2-3）:199-219）快速提取叶总蛋白，具体操作如下：

[0031] ①取1g洁净的盐地碱蓬叶片用液氮研磨成细粉，分装入1.5mL离心管中，加入1mL蛋白提取液I（含10%三氯乙酸和0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液）在-20℃沉淀粗蛋白1h，在4℃、13000r/min下离心20min，取沉淀，弃上清；

[0032] ②往沉淀中加入1mL蛋白提取液Ⅱ（含0.07%β-巯基乙醇的丙酮溶液），在-20℃悬浮粗蛋白1h，在4℃、13000r/min下离心20min，取沉淀，弃上清，再重复用蛋白提取液Ⅱ，在相同条件下悬浮提取3次后，真空抽干沉淀；

[0033] ③用裂解液（含7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%Chaps（Ameresco公司，美国）、50mmol/L DTT（Promega公司，美国）和0.5%pH3-10的40%两性电解质）溶解沉淀，裂解液用量为25μL裂解液/mg沉淀，然后在室温下放置1h，裂解期间不断涡旋5-6次；

[0034] ④根据Bradford法（参见：Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.Anal Biochem,1976,72:248-54）用考马斯亮兰G-250（Sigma公司）测定上述裂解液中的蛋白含量，上述裂解液中的蛋白用shotgun proteomics方法鉴定；

[0035] （3）蛋白分析

[0036] ①酶解及肽段提取：用1μg/μL胰酶（Trypsin）对提取的叶总蛋白进行酶解，酶解时间20h，于40℃下用50%ACN提取上述酶切肽段1小时（第一次），再用相同体积的50%ACN和2.5%TFA（Merk公司，德国）溶液于30℃提取1小时（第二次），最后用25μl ACN（Fischer公司，美国）超声提取5min（第三次），合并3次提取液冻干后，加入0.1%甲酸溶液10μL，混匀溶解，转移至自动进样瓶中，备用；②色谱分析：对步骤①制备的样品进行高效液相色谱分析，其中，A液为含0.1%甲酸的水溶液，B液为含0.1%甲酸的乙腈水溶液（乙腈为80%）；色谱柱以95%的A液平衡后，样品由自动进样器上样（上样量5μL）；洗脱液为：
0～15分钟，95%A液；15～45分钟，B液线性梯度从5%到60%；45分钟～50分钟，B液线性梯度从60%到100%；50～55分钟，B液维持在100%；55～60分钟，B液线性梯度从100%到5%；

[0037] ③质谱分析：对步骤①制备的样品进行质谱分析，多肽和多肽的碎片的质量2
电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集十个碎片图谱（MS scan），得到的原始文件（raw file）用BIOWORKERS软件搜索相应的库，过滤参数为：Xcorr（1+≥1.9,2+≥2.2,3+≥3.75）并且DelCn（≥0.1）；

[0038] 根据质谱数据比对到盐地碱蓬SsMBTF1蛋白，匹配序列占总氨基酸序列30%。根据SsMBTF1蛋白氨基酸序列（SEQ ID No.1），通过基因克隆获得编码基因（详见步骤（3）“目标基因获取”，碱基序列如SEQ ID No.2）。该基因的开放阅读框（ORF）为399bp，mRNA长度为1192bp（碱基序列如SEQ ID No.3）。

[0039] （3）目标基因获取

[0040] 以盐地碱蓬幼苗（播后3周）总RNA（用Trizol试剂提取）为模板，利用RT-PCR法扩增SsMBTF1基因，具体操作如下：

[0041] ①将mRNA反转录成第一链cDNA，所用反转录试剂盒为TaKaRa公司的High TMFidelity PrimerScript RT-PCR Kit；反应体系为20μL：依次加入1μL20M随机引物（Random6mers）、1μL10mM dNTP、2μL总RNA和DEPC水至10μL；在65℃变性5分钟，迅速在冰上冷却2分钟，稍微离心，然后依次加入4μL5×PrimerScript RT buffer、0.5μL RNase inhibitor、0.5μL PrimerScript RTase和5μL DEPC水；轻微混合均匀，30℃反应
10分钟，42℃反应30分钟，95℃5分钟使酶失活；

[0042] ②为了去掉与cDNA互补的RNA链，加入1μL RNase H在37℃温育20min，-20℃保存；

[0043] ③然后以第一链cDNA为摸板扩增目的基因SsMBTF1，所用引物为：

[0044] SsMBTF1-F：5’-TCTAGAATGGTGAGAGAAAAGATTAA-3’；

[0045] SsMBTF1-R：5’-GGTACCTTAATATATCCCCCTGTTTC-3’；

[0046] PCR反应体系为50μL：依次加入2×PCR buffer25μL、2.5mM dNTPs4μL、反转录产物2μL、20μM正向引物（SsMBTF1-F）1μL、20μM反向引物（SsMBTF1-R）1μL、2.5U/μL Tag DNA聚合酶0.5μL，最后加水至50μL；

[0047] PCR反应条件：预变性94℃3min，变性98℃10s，退火55℃15s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存；

[0048] ④扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并对目标片段进行回收纯化；

[0049] ⑤将回收纯化的DNA片段与pMD19-T载体（购自TakaRa公司）进行连接反应，连接体系为10μL，包括：0.5μL pMD19-T载体、4.5μL DNA片段、5μL Solution I；在14℃-16℃下连接8-12小时，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，送测序；

[0050] ⑥经测序正确，用Xba I和Kpn I（购自TakaRa公司）进行双酶切，酶切体系为40μL，包括4μL10×buffer、8μL连接产物、1μL Xba I、1μLKpn I）和26μL水，在37℃水浴中温育6h；

[0051] ⑦用Agarose Gel Extraction Kit（购自TakaRa公司）回收基因片段，操作如下：上述混合DNA经凝胶电泳以后，从凝胶上切下所需DNA片段，放在1.5mL的Eppendorf管中；加入3倍体积的Buffer QG-A，55℃水浴5-10min，期间轻摇Eppendorf管几次使胶完全溶化，加入2/3回收胶体积的Buffer QG-B；在空的DNA纯化柱中加入250μL Buffer BL，
10000g离心1min，倒掉残液；将溶解后的DNA胶液倒入DNA纯化柱，10000g离心1min，倒掉残液；在纯化柱中加入500μL Buffer W2，10000g离心1min，倒掉残液；再在纯化柱中加入
700μL Buffer W2，100g离心1min，倒掉残液；将空的纯化柱在15000g下离心2min使其干燥后加入10-15μL70℃预热的无菌水溶解DNA，10000g离心1min，所得的溶液即为纯化的基因SsMBTF1。

[0052] 2构建重组载体

[0053] 将基因SsMBTF1连入Super1300载体中，连接体系10μL，包括：2μLSuper1300载体、6μL纯化的基因SsMBTF、1μL10×T4连接酶buffer和1μL T4连接酶，在4-10℃下连接12h，然后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒进行鉴定，经鉴定为阳性的质粒，备用。

[0054] 3转化农杆菌

[0055] ①取200μl农杆菌感受态细胞，加入5-10μl重组阳性质粒，30℃冰浴30min，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1mL YEB培养基（1升YEB培养基含1g酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗糖和0.5g MgSO4·7H2O，pH7.0），28℃培养4h；

[0056] ②10000g离心30s，弃上清，加入0.1mL YEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100μg/mL卡那霉素和125μg/mL利福平的YEB平板（1升YEB培养基含1g酵母提取物、5g牛肉浸膏、5g蛋白胨、5g蔗糖、0.5g MgSO4·7H2O和12g琼脂，pH7.0）上，28℃培养约48h；

[0057] ③挑取阳性克隆作为模板，用菌落PCR方法进行鉴定；

[0058] ④经鉴定正确后，将含有目的质粒的农杆菌菌落于10mL YEB培养基（含0.1%酵母提取物、0.5%牛肉浸膏、0.5%蛋白胨、0.5%蔗糖、0.05%MgSO4·7H2O、1.2%琼脂、100μg/mL卡那霉素和125μg/mL利福平）中，28℃、200r/min震荡培养过夜；

[0059] ⑤转化前一天按1:50接种于200mL含相同抗生素的YEB培养液中扩大培养至OD600为0.6-0.8；取菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的YEB液体培养基中，6小时后，菌液OD600为0.2～0.5时即可用于转化植物。

[0060] 4转化植物

[0061] 通过农杆菌介导浸花法转化模式植物拟南芥，操作如下：

[0062] ①取200mL步骤3获得的OD600为0.2～0.5的农杆菌菌液，10000g离心3min，取沉淀用200mL渗透缓冲液重悬；转化所用渗透缓冲液含有：0.5×MS大量元素、0.5×MS微量元素、0.5mg/L VB5、5%蔗糖、44nM6-BA（Sigma公司，美国）和0.03%Silwet L-77（LEHLE SEEDS公司，美国）；

[0063] ②将200mL含目的农杆菌的渗透缓冲液置于一容器中，翻转种有拟南芥的花盆，使植株浸入含有待转化农杆菌的渗透缓冲液中，浸5分钟，缓慢取出花盆，侧放于托盘中，盖上黑塑料布避光24小时，第二天取下塑料布，直立放置花盆；

[0064] ③制备MS筛选平板（MS培养基外加80μg/mL潮霉素和50μg/mL氨苄青霉素），转化收获的T1代种子经消毒后播种于MS筛选平板，每个直径15cm的平板上可以播种100μg左右的拟南芥种子；

[0065] ④将MS筛选平板置于4℃春化3天后，平放在生长箱中培养（22℃恒温，24h光照），7-10天后挑选在MS筛选平板上根系和地上部生长正常的阳性植株，移入正常MS培养基缓苗3-5天后移植入土壤，单株收获T2代种子；繁种并鉴定至T3代，获得纯合的48个转基因株系。

[0066] 5功能鉴定

[0067] （1）耐盐功能鉴定

[0068] 取T3代转基因株系和野生型（ecotype Columbia）拟南芥种子分别用1%次氯酸钠消毒，在4℃冰箱中春化3天，然后置于温度22℃、湿度50%、连续24h光照的培养箱中培养；7d后，观察幼苗生长情况；

[0069] 待幼苗子叶完全展开后，将转基因株系和野生型幼苗移入含200mMNaCl和正常的MS固体培养基（含1×大量元素、1×微量元素、1×铁盐、3%蔗糖和0.8%琼脂）上，然后置于相同光温条件（22℃、湿度50%、连续24h光照）的培养箱中培养；培养12-15d后，观察转基因株系与野生型幼苗在高盐胁迫下的表型。

[0070] 结果发现在200mM NaCl下，野生型幼苗全部白化死亡，转基因株系幼苗叶片仍保持绿色，说明SsMBTF1基因超量表达可以缓解拟南芥盐害，显著提高拟南芥的耐高盐性。

[0071] （2）耐旱功能鉴定

[0072] 从培养皿中挑取播后8-10天的T3代转基因株系和野生型的正常幼苗栽种在预先装有80-100g花卉土（土与蛭石的比例1:1）的小盆中，每小盆种4颗苗；

[0073] 然后将小盆置于长方形的浅盘中，每个浅盘放12个小盆，在浅盘中加入一定量的清水，再在12个小盆上盖上透明塑料薄膜，置于温度20℃、光照16h/黑暗8h的温室中培养；

[0074] 5-6天后揭膜，根据土壤干湿情况适当补水；以后每天观察幼苗生长及病虫害发生情况，并进行适当补水和打药防止土壤过干和病虫害的流行；

[0075] 生长3-4周后，此时拟南芥植株尚未抽苔开花，停止浇水，让其土壤自然失水，一周后拟南芥植株叶片开始出现萎蔫失水，然后3天后复水，让其恢复生长。

[0076] 结果发现野生型植株叶片萎蔫失水严重，复水后不能恢复直至死亡，而转SsMBTF1基因株系叶片表现出暂时失水，复水后能够恢复正常生长，说明SsMBTF1基因超量表达可以提高拟南芥耐旱能力。