一种花生慢生根瘤菌及其用途

摘要

本发明涉及一种慢生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）WD-1，它的培养方法及其用途。该培养方法包括斜面培养、种子培养与发酵培养，得到的发酵培养物含有100亿/ml慢生根瘤菌WD-1。与对照相比，本发明的花生根瘤菌WD-1的花生结瘤数提高925.6%，植株干重提高63.6%，植株全氮提高18.1%，并且花生产量可提高57.9%。与现有生产使用的花生根瘤菌144相比，单株结瘤数提高27.4%，单株干重提高8.7%，单株全氮含量提高6.5%，单株产量提高30.45%。因此本发明在花生种植业上有广阔的应用前景。

权利要求

1.一种慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)WD-1，该菌株已于2013年10月23日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.8386。

2.根据权利要求1所述的慢生根瘤菌WD-1的培养方法，其特征在于该方法的步骤如下：A、斜面培养

使用接种环将慢生根瘤菌WD-1接种于装在试管中的斜面培养基的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度28～30℃的条件下斜面培养5～7d，得到斜面培养物；

B、种子培养

使用接种环将一环步骤A得到的斜面培养物接种到液体种子培养基中，然后置于恒温培养箱中，在温度28～30℃与转速180rpm的条件下培养4～5d，得到种子培养物；

C、发酵培养

按照以发酵培养基体积计3％～5％接种量，将步骤B得到的种子培养物转接至液体发酵培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度28～30℃与转速180rpm的条件下培养4～5d，发酵结束所得到的发酵培养物含有100亿/ml慢生根瘤菌WD-1。

3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述斜面培养基的制备方法如下：将10～20克甘露醇、0.1～1.0克氯化钠、0.1～1.0克硫酸镁、0.1～1.0克硫酸钙、

0.1～1.0克磷酸氢二钾、1～10克酵母膏与18～20克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加1～10ml以重量计1％钼酸钠水溶液与1～10ml以重量计1％硼酸水溶液，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至6.8～7.0。

4.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述发酵培养基的制备方法如下：将1～10克酵母膏、5～20克甘油、0.1～2克硝酸钾、0.1～2克磷酸氢二铵、0.1～

1克硫酸锰、0.1～1克三氯化铁、0.1～2克磷酸氢二钾、0.1～2克磷酸二氢钾与0.1～

1克氯化钠溶于水中，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至6.8～7.0。

5.根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于所述的无机酸选自硫酸或盐酸；

所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。

6.根据权利要求3或4所述的培养方法，其特征在于所述无机酸或无机碱水溶液的浓度是5-6M。

7.一种花生慢生根瘤菌剂，所述菌剂是根据权利要求2所述的培养方法得到的。

8.根据权利要求7所述的花生慢生根瘤菌剂在花生种植中用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于在花生种植期，所述的花生慢生根瘤菌剂，按140～160ml/亩地的用量与花生种子进行混匀拌种，然后播种。

说明书

一种花生慢生根瘤菌及其用途

【技术领域】

[0001] 本发明属于生物技术领域。更具体地，本发明涉及一种慢生根瘤菌WD-1，还涉及所述慢生根瘤菌WD-1的用途。【背景技术】

[0002] 自然界中有些原核微生物能合成固氮酶，在常温常压下，将空气中的N2还原成NH3。由固氮微生物固定的氮素约占地表化合态氮的65%～70%，其中以根瘤菌与豆科植物共生体系固氮能力最强，占生物固氮量的65%以上。利用根瘤菌与豆科植物共生固氮提高土壤肥力和农作物产量是世界农业的经典经验。

[0003] 花生是一年生豆科植物，具有丰富的营养价值，富含维生素、蛋白质和脂肪，是世界上种植面积最大的油料作物，在我国各地均有种植。花生根瘤菌能与花生形成共生根瘤来固定空气中的氮气，为植物生长提供营养，提高花生的产量和品质，可使花生在贫瘠的土壤中生长，因此，研究花生根瘤菌具有重要的实际意义和应用前景。【发明内容】

[0004] [要解决的技术问题]

[0005] 本发明的目的是提供一种慢生根瘤菌WD-1。

[0006] 本发明的另一个目的是提供所述慢生根瘤菌WD-1的用途。

[0007] [技术方案]

[0008] 本发明是通过下述技术方案实现的。

[0009] 本发明涉及一种慢生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）CGMCC No.8386，该菌株已于2013年10月23日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.8386。

[0010] 本发明还涉及所述的慢生根瘤菌WD-1的培养方法。

[0011] 该培养方法的步骤如下：

[0012] A、斜面培养

[0013] 使用接种环将慢生根瘤菌WD-1接种于装在试管中的斜面培养基的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度28～30℃的条件下斜面培养5～7d，得到斜面培养物；

[0014] B、种子培养

[0015] 使用接种环取一环步骤A得到的斜面培养物接种到液体种子培养基中，然后置于恒温培养箱中，在温度28～30℃与转速180rpm的条件下培养4～5d，得到种子培养物；

[0016] C、发酵培养

[0017] 按照以发酵培养基体积计3%～5%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接至液体发酵培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度28～30℃与转速180rpm的条件下培养4～5d，发酵结束所得到的发酵液含有100亿/ml慢生根瘤菌WD-1。发酵液即为慢生根瘤菌剂。

[0018] 根据本发明的一种优选实施方式，所述斜面培养基（固体培养基）的制备方法如下：

[0019] 将10～20克甘露醇、0.1～1.0克氯化钠、0.1～1.0克硫酸镁、0.1～1.0克硫酸钙、0.1～1.0克磷酸氢二钾、1～10克酵母膏与18～20克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加1～10ml以重量计1%钼酸钠水溶液与1～10ml以重量计1%硼酸水溶液，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至6.8～7.0。

[0020] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述种子培养基的制备方法如下：

[0021] 将10～20克甘露醇、0.1～1克氯化钠、0.1～1克硫酸镁、0.1～1克硫酸钙、0.1～1克磷酸氢二钾、1～10克酵母膏与18～20克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加1～10ml以重量计1%钼酸钠与1～10ml以重量计1%硼酸，接着用水补充达到总体积
1000ml；最后，使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至6.8～7.0。

[0022] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述发酵培养基的制备方法如下：

[0023] 将1～10克酵母膏、5～20克甘油、0.1～2克硝酸钾、0.1～2克磷酸氢二铵、0.1～1克硫酸锰、0.1～1克三氯化铁、0.1～2克磷酸氢二钾、0.1～2克磷酸二氢钾与
0.1～1克氯化钠溶于水中，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至6.8～7.0。

[0024] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述的无机酸选自硫酸或盐酸；所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。

[0025] 根据本发明的另一种优选实施方式，所述无机酸或无机碱的水溶液浓度是5-6M。

[0026] 本发明涉及一种采用所述培养方法所得到的慢生根瘤菌剂。

[0027] 本发明还涉及所述的慢生根瘤菌剂在花生种植中用途。

[0028] 根据本发明的另一种优选实施方式，在花生种植期，所述的慢生根瘤菌剂，按140～160ml/亩地的用量与花生种子进行混匀拌种，然后播种。

[0029] 下面将更详细地描述本发明。

[0030] 本发明涉及一种慢生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）WD-1，该菌株已于2013年10月23日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.8386。

[0031] 本发明人通过从山东、河北、河南、辽宁四个花生种植地区的20个土样中分离出20株野生型花生根瘤菌，初筛后，其中九株与花生有较好的结瘤效果，经过16s测序、生物学鉴定、回接实验，验证了这九个菌株均为花生慢生型根瘤菌，又经过多次盆栽实验和田间实验复筛，最终筛选出了一株高效固氮的慢生根瘤菌。

[0032] A、花生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）的分离、初筛。从山东、河北、河南、辽宁四个地区搜集了20个花生种植地的土样，对这20个土样进行根瘤菌的捕捉实验。

[0033] 捕捉实验方法如下：将10g土壤样与90g无菌水加到三角瓶中，震荡摇匀，得到-1 -210 稀释度的土壤悬液，然后取10ml土壤悬液，然后加90ml无菌水，震荡摇匀，得到10 稀-3 -4 -5
释度的土壤悬液，按照同样方式制备得到10 、10 、10 稀释度的土壤悬液。这些土壤悬液都分别进行了捕捉实验。

[0034] 将1ml上述土壤悬液接种到预先表面消毒及萌芽的花生种子中，在花盆中以蛭石作为培养介质对花生种子进行培养，定期浇灌常规低氮培养液（蛭石和低氮培养液均经过灭菌处理，所述低氮培养液是按照常规方法配制的）。在培养1个月后，收获的植物均有根瘤，将这种根瘤在固体培养基中进行多次分离纯化，于是获得20株野生型菌株。

[0035] 将获得的20株野生型菌株在花生上进行常规的回接实验，以确定该菌种与宿主是否有良好的结瘤效果，在实验中使用的蛭石、花盆、浇灌用水、花生种子均进行了常规灭菌处理。

[0036] 经过2个月的培养观察，发现其中9个菌株与宿主花生有较好的结瘤效果，不同程度的促进了植物生长，而其它11个菌株结瘤效果较差，促生长效果不明显，有些还会使作物根部变成褐色。因此，上述9个菌株作了保藏，以便进行后续实验。

[0037] B、对初筛的9个菌株进行了下述的分子生物学鉴定，进一步确定所选菌株为花生根瘤菌。

[0038] （1）16S rDNA序列测定：

[0039] 样品总DNA的制备：按常规的细菌DNA提取方法进行。

[0040] PCR引物：正向引物27F，反向引物1492R

[0041] PCR反应体系：反应体系20μL体积，反应液组成：1μL DNA模板，10μL2×MastarMix，0.4μL 27F，0.4μL 1492R，超纯水补足至20μL。

[0042] PCR扩增 程序：95℃2min；30个循 环（84℃ 1min，52℃1min，65℃ 8min）；65℃18min。

[0043] 扩增产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送北京三博远志公司测序。将测到的DNA序列进行人工矫正后，使用NCBI中的BIAST软件在线比对，经过比对，所鉴定的9个菌株与大豆根瘤菌的相似度为99%，所以断定这9个菌株均为根瘤菌属，在回接实验中与花生有较好的结瘤效果，于是可以确定它们为花生根瘤菌。

[0044] （2）生理生化鉴定

[0045] (i)、牛肉膏-蛋白胨反应：将9个菌株分别接种在牛肉膏-蛋白胨培养基中在温度28℃下培养5天。如果培养液澄清，菌体未见生长，与未接种菌株的对照相同，这表明该菌株不能在牛肉膏-蛋白胨培养基上生长。

[0046] 牛肉膏-蛋白胨培养基组成如下：3g牛肉膏、10g蛋白胨、5g酵母膏、5g氯化钠、1000ml蒸馏水，pH7.2。

[0047] (ii)、BTB反应：将9个菌株分别在BTB平板上在温度28℃下培养7天。如果平板颜色变蓝，说明该菌株在BTB平板上产碱，属于慢生型菌株。

[0048] BTB反应培养基组成如下：10g甘露醇、0.8g酵母浸膏粉、0.25g磷酸氢二钾、0.25g磷酸二氢钾、0.2g硫酸镁、0.1g氯化钠、15-20g琼脂、1000ml蒸馏水，1ml以重量计0.25%溴麝香草酚蓝，pH6.8-7.0。

[0049] (iii)、石蕊牛奶反应：将9个菌株分别在石蕊牛奶培养基中在温度28℃下培养7天，培养基颜色变蓝，并形成乳清环，表明该菌株产碱，属于慢生型。

[0050] 石蕊牛奶培养基组成如下：100ml脱脂牛奶，4ml2.5%石蕊溶液，低压灭菌。

[0051] (iv)、3-酮基乳糖反应：反应呈阴性，菌落周围未出现黄褐色沉淀，表明该菌株为非土壤杆菌。

[0052] 3-酮基乳糖培养基组成如下：10g乳糖、1g酵母浸膏粉、1000ml蒸馏水、15-20g琼脂，pH7.2。

[0053] 通过上述方法鉴定，判定所筛选的9个菌株均为花生慢生型根瘤菌。

[0054] C、盆栽筛选

[0055] 初筛得到的9个菌株按采集地区分别命名为ZMW、LX、XCW、XWW、YS、YSW、ZW、DMW、WD-1，另取本公司公开销售的一株花生根瘤菌株144加入设计实验，将上述10个菌株进行盆栽比较实验。

[0056] 实验方法如下：

[0057] ⑴、按照本申请说明书前面描述的培养方法，对上述10个菌株分别进行活化和发酵培养，培养得到的慢生根瘤菌剂备用。

[0058] ⑵、采用种子常规消毒方法（例如，用95%的酒精浸泡5min）对花生种子表面进行消毒，然后把消毒花生种子放在浸透无菌水的湿纱布上，再将其整体转移到培养皿中，在温度28℃培养箱中催芽7-10天。选取花生芽长相同的花生种子，分别浸泡于在步骤1中制备的10个菌株的发酵液中，浸泡10min，然后栽植至装有蛭石的13×15cm花盆中，每个花盆栽一株，每个菌株设计为一组，每组8个平行，另加一组清水浸种作为对照，共计11组。

[0059] 吸取相应的发酵液接种于种子周围，根据测定菌液的OD值（λ=600nm），接种时保9
证每颗种苗接种量达到1.0×10个以上。根据培养温室光照、温度与湿度情况按照花生栽培方法进行常规管理，其中包括浇水。

[0060] ⑶、按照常规的调查方法（例如数瘤数、称干重、消煮法测全氮），待花生植株生长到花期时，开始调查结瘤数、干重、全氮，培养约4个月时调查产量，调查结果如下表1至表4。

[0061] 表1： 花生根瘤菌盆栽实验结瘤调查

[0062]

[0063] 表2： 花生根瘤菌盆栽实验干重调查

[0064]

[0065] 表3： 花生根瘤菌盆栽实验全氮调查

[0066]

[0067] 表4： 花生根瘤菌实验产量调查

[0068]

[0069] 由上述表1至表4的实验结果可以看出，花生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）WD-1具有明显的促生长作用，跟其它菌株相比优势明显，且优于现有菌株。

[0070] 通过比较，施用过花生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）WD-1菌液的花生植株跟对照相比，单株结瘤数提高925.6%，单株干重提高63.6%，单株全氮含量提高18.1%，单株产量提高57.9%。

[0071] 与现有生产使用的花生根瘤菌144相比，单株结瘤数提高27.4%，单株干重提高8.7%，单株全氮含量提高6.5%，单株产量提高30.45%。

[0072] 经过生物学鉴定、回接实验，验证了这九个菌株均为花生慢生型根瘤菌，又经过多次盆栽实验和田间实验复筛，最终筛选出了一株高效固氮的花生根瘤菌株，即慢生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）WD-1。

[0073] 通过显微镜和平板菌落观测，慢生根瘤菌WD-1属阴性杆菌，周生鞭毛或端生鞭毛，能运动，无芽孢。菌体大小为（0.5-0.9）×（1.0-3.0）微米，在不同生长环境和不同生长阶段形态各异，在液体培养条件下，该菌成细小杆状，菌体着色不均匀。在固体培养平板条件下，培养5-7天时，菌落成圆形突起，直径0.5-1毫米，边缘整奇，菌落成乳白色半透明状，表面湿润。

[0074] 该慢生根瘤菌WD-1的16S rDNA全序列见附录1。

[0075] 本发明还涉及所述的慢生根瘤菌WD-1的培养方法。

[0076] 该培养方法的步骤如下：

[0077] A、斜面培养

[0078] 使用接种环将慢生根瘤菌WD-1接种于装在试管中的斜面培养基的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度28～30℃的条件下斜面培养5～7d，得到斜面培养物。

[0079] 所述斜面培养基的制备方法如下：

[0080] 将10～20克甘露醇、0.1～1.0克氯化钠、0.1～1.0克硫酸镁、0.1～1.0克硫酸钙、0.1～1.0克磷酸氢二钾、1～10克酵母膏与18～20克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加1～10ml以重量计1%钼酸钠水溶液与1～10ml以重量计1%硼酸水溶液，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至6.8～7.0。

[0081] 在这个步骤以及后续步骤中，使用的恒温培养箱都是目前市场上销售的产品。

[0082] 在这个步骤以及后续步骤中，所述的无机酸选自硫酸或盐酸；所述的无机碱选自氢氧化钠或氢氧化钾。

[0083] 使用的无机酸是无机酸水溶液，无机碱是无机碱水溶液。所述水溶液的浓度通常是5-6M。

[0084] B、种子培养

[0085] 使用接种环将一环步骤A得到的斜面培养物接种到液体种子培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度28～30℃与转速180rpm的条件下培养4～5d，得到种子培养物。

[0086] 所述种子培养基的制备方法如下：

[0087] 将10～20克甘露醇、0.1～1克氯化钠、0.1～1克硫酸镁、0.1～1克硫酸钙、0.1～1克磷酸氢二钾、1～10克酵母膏与18～20克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加1～10ml以重量计1%钼酸钠与1～10ml以重量计1%硼酸，接着用水补充达到总体积
1000ml；最后，使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至6.8～7.0。

[0088] C、发酵培养

[0089] 按照以发酵培养基体积计3%～5%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接至液体发酵培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度28～30℃与转速180rpm的条件下培养4～5d，发酵结束所得到的发酵培养物含有100亿/ml慢生根瘤菌WD-1。

[0090] 所述发酵培养基的制备方法如下：

[0091] 将1～10克酵母膏、5～20克甘油、0.1～2克硝酸钾、0.1～2克磷酸氢二铵、0.1～1克硫酸锰、0.1～1克三氯化铁、0.1～2克磷酸氢二钾、0.1～2克磷酸二氢钾与
0.1～1克氯化钠溶于水中，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用无机酸或无机碱将溶液的pH值调节至6.8～7.0。

[0092] 所得到发酵液的慢生根瘤菌WD-1含量的计数方法是采用本技术领域里常规的活菌平板计数的方法。

[0093] 本发明涉及一种慢生根瘤菌剂。该菌剂为采用上述方法制备得到的、含有100亿/ml活慢生根瘤菌WD-1的发酵液。

[0094] 本发明还涉及所述的慢生根瘤菌剂在花生种植中用途。

[0095] 所述的慢生根瘤菌剂使用方法如下：

[0096] 在花生种植期，按照上述慢生根瘤菌剂发酵制备方法获得的慢生根瘤菌剂，按140～160ml/亩地的用量与花生种子进行混匀拌种，然后播种。

[0097] [有益效果]

[0098] 本发明的有益效果是：本发明提供了一株花生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）WD-1。实验证明花生植株施用过该菌株制成的菌剂的生长旺盛，与对照相比，使用本发明花生根瘤菌WD-1的花生结瘤数提高925.6%，植株干重提高63.6%，植株全氮提高18.1%，并且花生产量可提高57.9%。与现有生产使用的花生根瘤菌144相比，单株结瘤数提高27.4%，单株干重提高8.7%，单株全氮含量提高6.5%，单株产量提高30.45%。因此本发明在花生种植业上有广阔的应用前景。

[0099] 慢生根瘤菌（Bradyrhizobium sp.）WD-1，该菌株已于2013年10月23日在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号为CGMCC No.8386。【附图说明】
【具体实施方式】

[0100] 通过下述实施例将能够更好地理解本发明。

[0101] 在下面实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0102] 在下述实施例中所使用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径购买得到。

[0103] 实施例1：花生根瘤菌WD-1培养与应用

[0104] 该实施例的实施步骤如下：

[0105] A、斜面培养

[0106] 首先，制备斜面培养基：

[0107] 将10克甘露醇、0.1克氯化钠、0.6克硫酸镁、0.1克硫酸钙、0.3克磷酸氢二钾、10克酵母膏与18克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加8ml以重量计1%钼酸钠水溶液与1ml以重量计1%硼酸水溶液，接着用水补充达到总体积1000ml；得到的水溶液最后使用5M氢氧化钠或6M硫酸水溶液将其pH值调节至6.8。

[0108] 然后，使用接种环将慢生根瘤菌WD-1接种于装在试管中所述斜面培养基的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度30℃的条件下斜面培养5d，得到斜面培养物；

[0109] B、种子培养

[0110] 首先，制备种子培养基：

[0111] 将14克甘露醇、0.3克氯化钠、0.1克硫酸镁、0.6克硫酸钙、0.1克磷酸氢二钾、8克酵母膏与19克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加4ml以重量计1%钼酸钠与1ml以重量计1%硼酸，接着用水补充达到总体积1000ml；得到的水溶液使用5M氢氧化钠或6M硫酸水溶液将其pH值调节至6.9。

[0112] 然后，使用接种环将一环步骤A得到的斜面培养物接种到液体种子培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度28℃与转速180rpm的条件下培养4d，得到种子培养物；

[0113] C、发酵培养

[0114] 首先，制备发酵培养基：

[0115] 将3克酵母膏、20克甘油、0.8克硝酸钾、1.4克磷酸氢二铵、0.1克硫酸锰、0.6克三氯化铁、0.8克磷酸氢二钾、0.8克磷酸二氢钾与0.3克氯化钠溶于水中，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用5M氢氧化钠或6M硫酸水溶液将溶液的pH值调节至6.8。

[0116] 然后，按照以发酵培养基体积计4%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接至液体发酵培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度28℃与转速180rpm的条件下培养4d，发酵结束所得到的发酵培养物为慢生根瘤菌剂。

[0117] 采用活菌平板计数的方法鉴定，所述的慢生根瘤菌剂含有105亿/ml活慢生根瘤菌WD-1。

[0118] 使用本实施例制备的慢生根瘤菌剂，采用本说明书描述的方法进行了花生栽种试验，测定单株结瘤数396个、单株干重4.33克、单株全氮含量以重量计2.81%，单株花生产量26个/株。

[0119] 实施例2：花生根瘤菌WD-1培养与应用

[0120] 该实施例的实施步骤如下：

[0121] A、斜面培养

[0122] 首先，制备斜面培养基：

[0123] 将14克甘露醇、0.3克氯化钠、1.0克硫酸镁、1.0克硫酸钙、0.6克磷酸氢二钾、1克酵母膏与19克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加10ml以重量计1%钼酸钠水溶液与4ml以重量计1%硼酸水溶液，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用6M氢氧化钠或
5M硫酸水溶液将溶液的pH值调节至6.9。

[0124] 然后，使用接种环将慢生根瘤菌WD-1接种于装在试管中的斜面培养基的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度28℃的条件下斜面培养6d，得到斜面培养物；

[0125] B、种子培养

[0126] 首先，制备种子培养基：

[0127] 将16克甘露醇、0.6克氯化钠、1.0克硫酸镁、1.0克硫酸钙、0.3克磷酸氢二钾、10克酵母膏与18克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加1ml以重量计1%钼酸钠与4ml以重量计1%硼酸，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用6M氢氧化钾或5M硫酸水溶液将溶液的pH值调节至6.8。

[0128] 然后，使用接种环将一环步骤A得到的斜面培养物接种到液体种子培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度28℃与转速180rpm的条件下培养5d，得到种子培养物；

[0129] C、发酵培养

[0130] 首先，制备发酵培养基：

[0131] 将8克酵母膏、5克甘油、0.1克硝酸钾、0.6克磷酸氢二铵、0.3克硫酸锰、1.0克三氯化铁、0.1克磷酸氢二钾、0.1克磷酸二氢钾与0.6克氯化钠溶于水中，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用6M氢氧化钾或5M硫酸水溶液将溶液的pH值调节至6.9。

[0132] 然后，按照以发酵培养基体积计3%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接至液体发酵培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度28℃与转速180rpm的条件下培养5d，发酵结束所得到的发酵培养物为慢生根瘤菌剂。

[0133] 采用活菌平板计数的方法鉴定，所述的慢生根瘤菌剂含有98亿/ml活慢生根瘤菌WD-1。

[0134] 使用本实施例制备的慢生根瘤菌剂，采用本说明书描述的方法进行了花生栽种试验，测定单株结瘤数354个、单株干重4.32克、单株全氮含量以重量计2.66%与单株花生产量28个/株。

[0135] 实施例3：花生根瘤菌WD-1培养与应用

[0136] 该实施例的实施步骤如下：

[0137] A、斜面培养

[0138] 首先，制备斜面培养基：

[0139] 将16克甘露醇、0.6克氯化钠、1.0克硫酸镁、1.0克硫酸钙、0.6克磷酸氢二钾、3克酵母膏与20克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加1ml以重量计1%钼酸钠水溶液与8ml以重量计1%硼酸水溶液，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用5.5M氢氧化钠或6M盐酸水溶液将溶液的pH值调节至7.0。

[0140] 然后，使用接种环将慢生根瘤菌WD-1接种于装在试管中的斜面培养基的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度29℃的条件下斜面培养7d，得到斜面培养物；

[0141] B、种子培养

[0142] 首先，制备种子培养基：

[0143] 将10克甘露醇、0.1克氯化钠、0.3克硫酸镁、0.1克硫酸钙、0.6克磷酸氢二钾、1克酵母膏与20克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加6ml以重量计1%钼酸钠与8ml以重量计1%硼酸，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用5.5M氢氧化钾或6M硫酸水溶液将溶液的pH值调节至6.9。

[0144] 然后，使用接种环将一环步骤A得到的斜面培养物接种到液体种子培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度29℃与转速180rpm的条件下培养4d，得到种子培养物；

[0145] C、发酵培养

[0146] 首先，制备发酵培养基：

[0147] 将10克酵母膏、10克甘油、1.4克硝酸钾、0.1克磷酸氢二铵、0.6克硫酸锰、0.1克三氯化铁、1.4克磷酸氢二钾、1.4克磷酸二氢钾与0.1克氯化钠溶于水中，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用5.5M氢氧化钠或6M盐酸水溶液将溶液的pH值调节至7.0。

[0148] 然后，按照以发酵培养基体积计4%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接至液体发酵培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度29℃与转速180rpm的条件下培养4d，发酵结束所得到的发酵培养物为慢生根瘤菌剂。

[0149] 采用活菌平板计数方法鉴定，所述的慢生根瘤菌剂含有102.5亿/ml活慢生根瘤菌WD-1。

[0150] 使用本实施例制备的慢生根瘤菌剂，采用本说明书描述的方法进行了花生栽种试验，测定单株结瘤数412个、单株干重4.42克、单株全氮含量以重量计2.79%，单株花生产量33个/株。

[0151] 实施例4：花生根瘤菌WD-1培养与应用

[0152] 该实施例的实施步骤如下：

[0153] A、斜面培养

[0154] 首先，制备斜面培养基：

[0155] 将20克甘露醇、1.0克氯化钠、0.3克硫酸镁、0.6克硫酸钙、1.0克磷酸氢二钾、8克酵母膏与19克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加4ml以重量计1%钼酸钠水溶液与10ml以重量计1%硼酸水溶液，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用5M氢氧化钠或
6M硫酸水溶液将溶液的pH值调节至6.8。

[0156] 然后，使用接种环将慢生根瘤菌WD-1接种于装在试管中的斜面培养基的斜面上，然后置于恒温培养箱中在温度29℃的条件下斜面培养6d，得到斜面培养物；

[0157] B、种子培养

[0158] 首先，制备种子培养基：

[0159] 将20克甘露醇、1.0克氯化钠、0.6克硫酸镁、0.3克硫酸钙、1.0克磷酸氢二钾、3克酵母膏与19克琼脂溶于水中，再往得到的溶液中添加10ml以重量计1%钼酸钠与10ml以重量计1%硼酸，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用5M氢氧化钠或6M硫酸水溶液将溶液的pH值调节至7.0。

[0160] 然后，使用接种环将一环步骤A得到的斜面培养物接种到液体种子培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度30℃与转速180rpm的条件下培养5d，得到种子培养物；

[0161] C、发酵培养

[0162] 首先，制备发酵培养基：

[0163] 将1克酵母膏、15克甘油、2克硝酸钾、2克磷酸氢二铵、1.0克硫酸锰、0.3克三氯化铁、2克磷酸氢二钾、2克磷酸二氢钾与1.0克氯化钠溶于水中，接着用水补充达到总体积1000ml；最后，使用5M氢氧化钠或5M硫酸水溶液将溶液的pH值调节至6.8。

[0164] 然后，按照以发酵培养基体积计5%接种量，将步骤B得到的种子培养物转接至液体发酵培养基中，然后置于恒温培养箱中在温度30℃与转速180rpm的条件下培养5d，发酵结束所得到的发酵培养物为慢生根瘤菌剂。

[0165] 采用活菌平板计数方法鉴定，所述的慢生根瘤菌剂含有103亿/ml活慢生根瘤菌WD-1。

[0166] 使用本实施例制备的慢生根瘤菌剂，采用本说明书描述的方法进行了花生栽种试验，测定单株结瘤数389个、单株干重4.22克、单株全氮含量以重量计2.57%与单株花生产量29个/株。