一种用于检测B族链球菌特有序列的引物、探针及试剂盒

摘要

本发明采用聚合酶链式反应（PCR）及分子信标荧光探针技术对B族链球菌中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断B族链球菌的存在。提供了一种可替代的优化的检测B族链球菌的引物、短柄圆环探针序列、以及对应的试剂盒，对B族链球菌的PCR荧光法检测技术起到推动作用。样品检测最快可以在2-3小时内完成，具有检测速度快、检测成本低的特点。

权利要求

1.一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，所述引物为以下的一对序列：上游引物：5’-AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3’；

下游引物： 5’-ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’。

2.一种用于检测根据权利要求1所述的引物扩增的B族链球菌 的短柄圆环探针，所述短柄圆环探针包括两个序列，一个为圆环序列，一个为短柄序列，所述圆环序列为：5’- CCCCCCACGATACT -3’，所述短柄序列由位于所述短柄圆环探针两端的六对互补碱基构成。

3.根据权利要求2所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述圆环探针的5’端标记FAM的荧光素，而所述圆环探针的3’端标记DABCYL淬灭剂。

4.根据权利要求2或3所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述短柄序列为：与所述圆环序列的5’端C相连的3’-GCCGCC -5’序列，和与所述圆环序列的3’端T相连的5’-CGGCGG -3’序列。

5.根据权利要求2或3所述的短柄圆环探针，其特征在于，所述短柄圆环探针用于荧光检测，所述圆环序列与靶序列是完全互补的序列。

6.一种用于检测B族链球菌的试剂盒，其特征在于，包括：2-5ml运输液，0.5-1ml拭子洗脱液，Tris和5%-10%EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；

核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、dNTP、内参照引物和探针、一对序列为5’-AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3’和 5’-ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’的引物、以及根据权利要求2-5所述的用于B族链球菌的短柄圆环探针；以及0.02-0.05ml自备试剂。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述内参照引物取自拟南芥基因，所述内参照引物为：Suc-F:5’- CGTCGCTGGAGCTGGTTTAG-3’，Suc-R:5’- CGGCGGTTTGCTAAGCTGAT-3’；

所述内参照探针为：5’-AATCCGGTGGTGAT -3’。

8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括阳性对照液、阴性对照液 。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述运输液为经处理的高纯水、Tris-HCl、Triton X-100或NaCl。

10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述自备试剂为石蜡油。

说明书

一种用于检测B族链球菌特有序列的引物、探针及试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种用于检测细菌的装置和方法，尤其涉及一种用 于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、以及试剂盒。

背景技术

[0002] B族链球菌(GBS)学名为无乳链球菌(S.agalactiae)，是一种有荚膜的细菌，能够引起牛乳房炎，危害畜牧业非常严重，所以早为畜医界注目。后来发现该细菌能够感染人类，尤其是新生儿。该细菌所引起的败血病、脑膜炎、肺炎等疾病的死亡率极高，并且通常伴有神经系统后遗症，由此又被医学界所重视。

[0003] B族链球菌感染也称作乙型链球菌感染，是新生儿败血症和脑膜炎、以及母亲感染的重要原因。1990年以来，美国由于分娩前采取预防性筛查，使早发的B 族链球菌感染降低了70％。根据分娩前得到筛查结果，患者可在住院后立即得到静脉注射抗生素治疗。

[0004] 目前，通常采用标准细菌培养方法来检测B族链球菌的存在，该方法从阴道和肛门取材，由于需要进行细菌培养，需要在35-37周孕期取材，大约需要18-48小时得到检测结果，比较费时，不能够有效、快速地检测出B族链球菌的存在。如果检测结果为阳性，需要给孕妇使用抗生素以预防她将细菌传染给婴儿。

[0005] 专利号为200410049736.4，名称为“用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、试剂盒及方法”的发明专利是一种用PCR扩增法检测B族链球菌的存在，该发明最快可以在2-3小时内完成，具有检测速度快、检测成本低的优点，但其引物和探针序列可以进一步改进、优化，以增进其检测的灵敏性、特异性、以及稳定性。

发明内容

[0006] 因此，针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种替代现有技术的、优化的用于检测B族链球菌特有序列的引物、短柄圆环探针、以及试剂盒，以供实验室、临床研究使用，并能够应用于普查和预防工作，寻找可能的动物来源及从动物到人的转移与进化。

[0007] 本发明采用聚合酶链式反应（PCR）及分子信标荧光探针技术对B族链球菌中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断B族链球菌的存在。

[0008] 为了实现上述目的，针对B族链球菌的特点，首先选择相应的靶序列，然后针对所选择的特定靶序列设计特异性的引物，特异性地扩增出目的DNA片段。因此，根据待测基因两端的DNA顺序的引物设定是本发明的要点。

[0009] 本发明提供了一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，其中该引物序列为：上游引物5’-AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3’，即SEQ ID NO：1；下游引物5’- ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’，即SEQ ID NO：2；且该靶序列选定在111-211之间。

[0010] 本发明还提供了一种为了检测该特定靶序列而设计的探针。首 先选定用于识别和检测B族链球菌的靶序列，将该靶基因片段选定 在111-211之间。将该短柄圆环探针序列设计成两部分，该短柄圆环探针序列包括两个序列，一个为圆环序列，为5’-CCCCCCACGATACT-3’，即SEQ ID NO：3；一个为短柄序列，由位于该短柄圆环探针两端的另外六对互补碱基构成。因此，根据靶基因序列的探针设定也是本发明的要点。

[0011] 优选地，该圆环序列与选定的靶基因片段互补。

[0012] 优选地，所述短柄圆环探针的5’端标记FAM的荧光素，而3’端标记DABCYL淬灭剂。

[0013] 优选地，位于所述短柄圆环探针两端的另外六对互补碱基分别为：与所述圆环序列的5’端C相连的3’-GCCGCC- 5’，即SEQ ID NO：4；与所述圆环序列的3’端T相连的5’-CGGCGG -3’，即SEQ ID NO：5。

[0014] 优选地，所述短柄圆环探针用于荧光检测。

[0015] 另外，本发明还提供了一种用于检测B族链球菌的试剂盒，该试剂盒每人份包括：2-5ml运输液，0.5-1ml拭子洗脱液，Tris和5%-10%EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、dNTP、内参照引物和探针、一对引物、和用于B族链球菌的短柄圆环探针；以及
0.02-0.05ml自备试剂。

[0016] 所述引物是为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物：上游引物碱基序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物碱基序列如SEQ ID NO：2所示；所述用于B族链球菌的短柄圆环探针是这样的一个探针序列：该短柄圆环探针序列包括两个序列，一个为圆环序列，碱基序列如SEQ ID NO：3所示，一个为短柄序列，两端分别为：与所述圆环序列的5’端C相连的SEQ ID NO：4碱基序列；与所述圆环序列的3’端T相连的SEQ ID NO：5碱基序列。所述内参照引物取自拟南芥基因，所述内参照引物为：Suc-F:5’- CGTCGCTGGAGCTGGTTTAG-3’，即SEQ ID NO：6；Suc-R:5’- CGGCGGTTTGCTAAGCTGAT-3’，即SEQ ID NO：7；所述内参照探针为：5′-AATCCGGTGGTGAT -3′，即SEQ ID NO：8；内控引物Suc-F的特异结合区位于拟南芥基因的231～250位，共20个碱基，内控引物Suc-R的特异结合区位于拟南芥基因的1008～1027位，共20个碱基。

[0017] 优选地，所述运输液为经处理的高纯水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl。

[0018] 优选地，所述运输液为3%-5%氯化钠，15%-20%牛肉粉，和6%-12%蛋白胨。所述氯化钠、牛肉粉和蛋白胨均可来源于市购。

[0019] 优选地，所述拭子洗脱液为2%-5%EDTA。

[0020] 优选地，所述玻璃珠直径为0.1-0.25mm。

[0021] 优选地，试剂盒进一步包括 0.02-0.05ml自备试剂；

[0022] 优选地，所述自备试剂为石蜡油。

[0023] 优选地，试剂盒进一步包括阳性对照液及阴性对照液。阳性对照液制备由ATCC购得阳性菌株培养灭活所得，阴性对照液由医院获得阴性样本培养灭活所得。

[0024] 本发明与现有技术相比，具有以下特点和优点：

[0025] 1.本发明对比专利号为“200410049736.4”的发明专利，针对的靶序列不相同，提供了一种可替代的优化的检测B族链球菌的引物、短柄圆环探针序列、以及对应的试剂盒，对B族链球菌的PCR荧光法检测技术起到推动作用。样品检测最快可以在2-3小时内完成，具有检测速度快、检测成本低的特点。

[0026] 2.根据本发明用于检测B族链球菌的试剂盒，具有灵敏性和特异性高、以及稳定性好的优点，有着广阔的市场应用前景；以及

[0027] 3.根据本发明用于检测B族链球菌的试剂盒，可以供实验室和临床研究使用，并应用于普查和预防工作。

附图说明

[0028] 图1是灵敏度参比品检测结果图；

[0029] 图2是精密度参比品检测结果图；

[0030] 图3是阳性准确性Z1-Z5参比品检测结果图；

[0031] 图4是Z6-Z10阴性准确性参比品检测结果图；

[0032] 图5是特异性T1-T10参比品检测结果图；

[0033] 图6是试剂盒中阳性对照、临界阳性对照、阴性对照参比品检测结果图。

具体实施方式

[0034] 如图1所示，本发明用于检测生物样本中B族链球菌的方法包 括以下步骤：

[0035] 1.本发明根据国际上报道的B族链球菌序列来选择靶点；

[0036] 2.针对选定靶点设计引物和探针序列；

[0037] 3.提取患者的DNA样本；以及

[0038] 4.进行核酸扩增和杂交检测DNA样本中是否存在B族链球菌。

[0039] 通过以下对上述各个步骤的详细描述，本领域技术人员可以进 一步了解本发明的目的和优点。

[0040] 步骤1：选择靶点

[0041] 以下为国际上报道的B族链球菌序列，结合于此作为参考，该序列是本发明选择靶点的依据，即SEQ ID NO：9所示。

[0042] CTTTCAACTCAAGAAATTGGCATGCTCTAATAGATCTTCCCCCTCGTTGACAAACAAGATAATATCCTTATTTTATCTAACTGTTCAAACTTATGACTGAGTTGACTCAAAGGAAGATTTATCGCACCTGAAATATGCCCCCCACGATACTCATGCTCTTCACGAACGTCTATCAAATGGATATTATTATGCTGGGCAATCAATGTTTCTAATGCTACAACAGTTATCTTTTTAGTCATAATCTTTATTTCCTTTGATACTTGGCAAATTTAGTCAAATGACTAATCACTTTATTATTTAAAATGGTGACATCGTTCTACTATTATGACTATTATCGTAAACCTTTTAATCATAAAAACCATGGTAGTACAAAATCACGAAGTCGACAGCATCACACGAAAAATACAAATATTATTTTAATGCTGTTTGAAGTGCTGCTTGTAATGTTACAATCTCTTGATCAACTTGTTGTACCGTAACATTTGGATTCAACTGAACTCCAACAGCATGTGTGATTGCTTTATTTAAAGTATTGTAAACTTTAAATTCTTTGACGTTAAGTACTTTTTTATCTCTAGTAAAGCGTGTATTCCAGATTTCCTTATCAAGTTTTTGATTTTGTATAGATTGTAGCTCTATCAGTTGGTTTTAAATCAGGATAAGTTAAAACCTTTTGTTCTAATGCCTTTACATCGTTAACTTGAGCTTTAATTGAATCAACTGAAGCAAATGGATCTAAAATGCGAATAACCAGCTTAGTTATCCCAAATCCCATATCAATATTTGCTTGACTAACCTTATTTGCTAAATGTTGAGTTGAAAAAGTGATTGCTTCAATCACATCTGTTAAGGCTTCTACACGACTACCAATAGAATTCAAATCATAAACTGTCTCAGGGTTGGCACGCAATGAAGTCTTTAATTTTTCAACACTAGTAATAGCCTCATTAACCGTTTTTTCATAATCTGTTCCCTGAACATTATCTTTGATATTTCTCAACTGAATGCTATCTTGATCAAGCTTTTGAGCCATTTGCTGGGCTTGATTATTACTGTTTACATGATTTACCACTTGTGGAGTTGTCACTTGATCAGCATGTACTTCTAATACAGCTGGTGAAAATAACAATGCACCAGCCACTAGAGTTCCAGATAGATACATCATATGTTTAACGTTCATAATGAATTTCCTCCTTTAAACTAAAATCACTTTTACTGCAGTATTTTTAATTTACAGGGCCCATGTTTGTATCTTACTACTTGTCCAAAAGGTCGTCAAGCGCTTTCTTTTCCCCTATATTTTACATTATTACAAATAAACTGCATTTTTTTCATAAAACTAATATTATCATTTTGCTATAATATACTTGCGCCTATCCTTTTGTTAATTTCTGATAATTTAATTTATATTTTCATGTAAAAAACCATAACGATAATTTACCACCTTATATAAATCTAAATATTTTAGAAAATTTCTACTTATCACTATTTTTATCAAATAGATTAGCCTAATGTTTTTCTTAAAAAATAAATTTAATAAGAAGCGTACTATTTTAGATAAAATCGTTCCATTATGCCCAAAAACCATACTAAAACTCATTATTTTTACTTTCTGTTTAGAAATTCATACTAGACCAAGTATTTTAGACACTTAAAAAGCCTTAAACATAATAAGTTCAAGACTTTTTTACTTAGTATTTTAAACTGTGAGTTTGTTTGGCAGTTCCCTCCGATGATTTTTACCCCAATTTTTTGAACCAAAAGTTAACAATATCGTCAGCCATAGTATTGATATCTAGATTACATTTACTGGTAACTATGTTACCATGTGTATGGATAACTTATATCAAAAATATATAATCTAAAAAAGTGAATAACCCTTATAAAATAAGTAAATCCTAAGTACAGCATTAACTTCAAGTAAACAATTTAACGGAGGTAGTATATGAAAATAGCAATAATCGGATATAGTGGGTCGGGTAAGTCCACTTTAGCAAGAAAATTGGGAAATTACTATAATTGCAATGTATTACATCTTGATAGTATTCACTTCGCCCCAAATTGGGAAGAGAGAAAATATGATGACATGATTGACG

[0043] 靶点选择是本发明的引物设计的基础，要求所选的靶点稳定，没有突变区，长度在100-150bp之间。由于临床采样中细菌数量少，需要针对选定的靶序列进行扩增(即扩增靶序列的拷贝数量)，从而提高检测方法的灵敏度。

[0044] 根据本发明所选择的靶点与迄今收集到的国际报道已知序列比较，其稳定、无突变、且适合应用于基因检测。

[0045] 步骤2：针对选定靶点设计引物和探针序列

[0046] 评价PCR扩增是否成功，关键在于针对靶序列的引物设计，并且靶序列的选择更是PCR扩增成功的关键。本发明通过精确地计算和设计以及实验和筛选，确定了理想的靶序列及引物，以获得理想的靶序列扩增结果，从而为应用各种分子检测技术进行靶序列检测提供了基础。

[0047] 杂交方法是一种分子生物学的标准技术，用于检测DNA或RNA分子的特定序列(靶序列)。杂交方法有很多种，最常见的可以采用DNA或RNA先转移并固定到硝酸纤维素或尼龙膜上，与其互补的单链DNA或RNA探针可用放射性或非放射性标记。如图2 所示，在膜上杂交时，探针通过氢键与其互补的靶序列结合，洗去未结合的游离探针后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的探针。

[0048] 最近发展起来的短柄圆环探针技术，也称分子信标技术，也是一种杂交检测的方法，其具有快速灵敏的特点。在探针5’和3’端之间可形成一个具有20个碱基左右的圆环结构，当溶液中有模板序列时，探针的圆环序列与模板杂交，探针的发夹结构被破坏而线性展开；此时，荧光分子与淬灭分子分开并发出荧光，通过荧光的强度就可检测靶序列。现有技术已有将其应用于结核杆菌的耐药基因检测等。

[0049] 对于应用核酸杂交检测，核酸杂交是提高基因诊断特异性的关 键。短柄圆环探针体系特别值得推荐，这是因为其具有高特异性结合的特点。当采用DNA结合染料(如SYBR Green)进行的荧光即时检测系统时，需要知道SYBR Green与所有双链DNA结合的情况才能够进行检测。然而，短柄圆环探针的特殊性就在于仅与互补靶基因片段结合，只报告互补的靶序列或扩增产物。短柄圆环探针系统与其它线形探针比较，还具有可检测出单碱基对错配的功能。短柄圆环探针遇到有错配的单碱基对时，会很不稳定且不牢固，在这点上与一般线形探针有所不同，可应用于发现位点突变。与线形溶解探针比较，标记在短柄圆环探针上的荧光素与淬灭剂相邻，直接能量转换易于淬灭。因此，淬灭剂和荧光素的选择比较容易。

[0050] 应用短柄圆环探针体系检测B族链球菌，关键在于确定合适的 靶序列，需要其具有特异性和稳定性。进一步地，所选靶序列应当符合探针序列的设计要求，要考虑能够保持圆环结构而不发生自身序列的杂交，以及特异性杂交产生的力能够克服短柄序列之间的结合力等等，这些都是解决检测问题的要点。

[0051] 目前，通常采用PCR产物电泳的方法检测PCR扩增是否成功， 而采用这种方法会增加额外时间，增加实验室设备和试剂的污染危 险。在检测操作中，必须将所有试管打开进行取样。另外，同样的引物-模板系统重复进行检测，前一次实验的扩增产物可作为随后实验导致污染的模板，从而产生假阳性。而应用短柄圆环探针可以减少电泳步骤，因而减少污染机会，反应和结果分析在密封的一个试管中进行，从而提高了检测的准确性。

[0052] 本发明采用了核酸扩增技术，而扩增能否成功的关键是针对选 定靶点的引物设计，该引物的设计是本发明所解决关键技术。选择每个引物的长度在18-25bp之间，同时设计引物要求避免其自身杂交，因而还要进一步考虑其TM值等设计参数。

[0053] 本发明是根据世界上各研究机构公开发表的B族链球菌序列基础上，分析确定B族链球菌的特异性、稳定的序列。为利用PCR技术，经过计算、设计、及筛选，提供了一对优选的针对B族链球菌设计的特异性引物。

[0054] 此外，本发明还设计了短柄圆环探针，能够检测实验室及临床的生物样本，通过以下对实施例的详细描述，本领域技术人员可以进一步了解本发明的目的和优点。

[0055] 本发明提供了一种为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物，其中该引物序列为：上游引物5’-AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3’；以及下游引物 5’ -ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’，且该靶序列选定在111-211之间。

[0056] 本发明还提供了一种用于检测B族链球菌的短柄圆环探针，将 该短柄圆环探序列设计成：5’-CCCCCCACGATACT-3’，其中短柄是由该序列两端互补的六对碱基构成的寡核苷酸，圆环序列与选定的靶基因片段互补。短柄圆环探针的5’端标记荧光素，3’端标记DABCYL淬灭剂，可以应用荧光检测技术检测杂交，报告靶基因序列。

[0057] 优选地，将PCR技术与短柄圆环探针体系结合，用于检测B 族链球菌的存在。

[0058] 步骤3：提取DNA样本

[0059] 提取DNA样本，即制备DNA模板，包括以下步骤：

[0060] (1)将拭子样本放置在2.5ml运输液中，震荡15-40秒，室温放置12-24小时；

[0061] (2)取500ul运输液，13000rpm离心，弃上清液，加清洗液清洗后再次离心5min，去上清；

[0062] (3) 将40-80μl沉淀稀释液加入裂解液管，高速震荡5-10分钟；瞬时离心 2-5秒；

[0063] (4)在95℃下孵育2-10分钟，立即冰浴；以及

[0064] (5)瞬时离心2-5秒。

[0065] 步骤4：核酸扩增和杂交检测DNA样本

[0066] 根据本发明的用于确定在生物样品中B族链球菌是否存在的方法，包括以下步骤：

[0067] a)采集生物样品，并且进行预处理；

[0068] b)制备DNA模板；

[0069] c)将步骤b)得到的DNA模板进行PCR扩增处理，其中所用的一对引物序列为5’-AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3’；以及 5’ -ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’；

[0070] d)将步骤c)得到的扩增靶序列进行检测。

[0071] 根据本发明的基因诊断方法，优选地，对扩增的靶序列检测采用短柄圆环探针荧光检测，本领域技术人员也可以采用其它杂交技术来检测该扩增靶序列。

[0072] 此外，根据本发明的用于检测B族链球菌的-试剂盒，该试剂盒每人份包括：2-5ml运输液，0.5-1ml拭子洗脱液，Tris和5%-10%EDTA缓冲液，pH值在6-8之间；裂解液管，内装0.05-0.1ml玻璃珠；核酸扩增和杂交反应管，内装0.02-0.04ml的核酸扩增混和液、dNTP、内参照引物和探针、一对引物、和用于B族链球菌的短柄圆环探针；以及0.02-0.05ml自备试剂。

[0073] 所述引物是为进行PCR扩增B族链球菌选定的靶序列而设计的引物：上游引物：5’-AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3’，下游引物： 5’-ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’；所述用于B族链球菌的短柄圆环探针是这样的一个探针序列：该短柄圆环探针序列包括两个序列，一个为圆环序列，为5’-CCCCCCACGATACT-3’，一个为短柄序列，两端分别为：与所述圆环序列的5’端C相连的3’-GCCGCC- 5’，与所述圆环序列的3’端T相连的5’-CGGCGG -3’。所述内参照引物取自拟南芥基因，所述内参照引物为：Suc-F:5’- CGTCGCTGGAGCTGGTTTAG-3’和Suc-R:5’- CGGCGGTTTGCTAAGCTGAT-3’；

[0074] 所述内参照探针为：5’-AATCCGGTGGTGAT -3’。内控引物Suc-F的特异结合区位于拟南芥基因的231～250位，共20个碱基，内控引物Suc-R的特异结合区位于拟南芥基因的1008～1027位，共20个碱基；优选地，所述运输液为经处理的高纯水、Tris-HCl、Triton X-100、或NaCl；优选地，所述运输液为3%-5%氯化钠，15%-20%牛肉粉，和6%-12%蛋白胨。优选地，所述拭子洗脱液为2%-5%EDTA。优选地，所述玻璃珠直径为0.1-0.25mm。优选地，试剂盒进一步包括 0.02-0.05ml自备试剂；优选地，所述自备试剂为石蜡油。优选地，试剂盒进一步包括阳性对照液及阴性对照液。

[0075] 根据本发明提供的试剂盒及基因诊断方法，通过包括对患者的 病变部位的分泌物和组织、血样、以及尿样的检查作为B族链球菌早期诊断参考依据，同时也可以实现更大范围采样检测，以检测和发现B族链球菌。目前，已从临床送检病变部位的分泌物和组织、以及血样中，检测出B族链球菌的特有基因序列。

[0076] 下面结合实施例，对本发明进行进一步阐述，并且不会因此限制本发明的保护范围。

[0077] 实施例1

[0078] 用于PCR引物的制备

[0079] 根据本发明的一对引物序列为5’-AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3’；以及 5’ ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’，该序列可以有效地避免自身杂交，退火温度在50-60℃之间。仪器规格为ABI 391 DNA合成仪，产地美国，该合成仪可从美国应用生物系中国公司购买，原料ABI合成柱A、T、C、和G，ABI合成碱基A、T、C、和G。

[0080] 短柄圆环探针的制备

[0081] 根据本发明的短柄圆环探针序列为：5’-CCCCCCACGATACT- 3’，其中短柄是该序列两端互补的六对碱基构成的寡核苷酸。采用ABI 391 DNA合成仪，产地美国，该合成仪可从美国应用生物系中国公司购买，原料为ABI合成柱A、T、C、和G，ABI合成碱基A、T、C、和G，其中5’端标记FAM的荧光素，而3’端标记DABCYL淬灭剂。

[0082] 短柄圆环探针荧光检测B族链球菌

[0083] 短柄圆环探针体系与核酸扩增在同一试管中进行，无需开盖，可以有效地避免污染，从而提高检测准确率。

[0084] 每人份(25μl)核酸扩增体系设计如下：

[0085] 体系组成 终浓度

[0086] 缓冲液 1x

[0087] MgCl2 2.0mM

[0088] dNTP 0.08mM

[0089] Taq酶 2.5单位

[0090] 短柄圆环探针 0.5mM

[0091] 引物 0.5mM

[0092] DNA模板 5μl

[0093] H2O 补充至25μl

[0094] 即时PCR程序设置：

[0095] 95℃ 2分钟 1个循环

[0096] 94℃ 15秒

[0097] 55℃ 50秒 }40个循环

[0098] 72℃ 10秒

[0099] 实施例2

[0100] 根据本发明的用于确定在生物样品中B族链球菌是否存在的方法，包括以下步骤：

[0101] 1.样本采集：对于被检测者阴道和直肠的样本需用涤纶拭子，首先擦去被检测者阴道内过多的分泌物，将拭子小心地插入被检测者的阴道，采取阴道低位1/3处粘膜分泌物样本，再将拭子小心地插入被检测者的肛门，在肛门括约肌以上约2-5厘米处轻轻旋转取得样本，按照医院样本输送程序送至实验室，注意防止运送中的过热温度(一般不超过30℃)；

[0102] 2.样本检测：将步骤1采集到的样本在室温下保存，24小时内检测，原则上样本在5-25℃可保存6天。如果不能在24小时内处理，应该置于冰箱(4℃)保存，荧光PCR法检测目的是找到特有序列，检测结果应该在分娩前4小时报告，此检测结果对于决定选用抗生素治疗，进行分娩前预防，是及时而有必要的；

[0103] 3.制备DNA模板，包括以下步骤：(1)将拭子样本放置在1xTE液中，静置10分钟，震荡25秒；(2)将拭子上清液60μl加入裂解液管，高速震荡10分钟；(3)瞬时离心5秒；(4)在95 ℃下孵育5分钟，立即冰浴；以及(5)瞬时离心4秒；

[0104] 4.进行核酸扩增处理，包括以下步骤：(1)取DNA模板液2μl；(2)加入混合反应液23μl；(3)循环时间与温度设置：

[0105] 95℃ 2分钟 1次循环；

[0106] 94℃ 15秒

[0107] 55℃ 50秒 }40次循环；以及

[0108] 72℃ 10秒

[0109] 5.检验结果报告：即时荧光法检测目的是找到特有序列，检测结果在分娩前4小时报告，此检测结果对于决定选用抗生素治疗，进行分娩前预防，是及时而有必要的。

[0110] 实施例3

[0111] B族链球菌检测试剂盒及其使用方法

[0112] 每人份用于检测B族链球菌的试剂盒包括：

[0113] 0.8ml拭子洗脱液，包括1xTris、EDTA缓冲液，pH值为7.2；

[0114] 裂解液管，内装0.08ml玻璃珠；

[0115] 核酸扩增和杂交反应管，内装0.025ml的0.001％核酸扩增混和 液、0.002％一对特异引物、0.05％dNTP、0.001％B族链球菌探针、 0.001％内参照引物和探针，其中特异引物序列为：5’-AGGAAGATTTATCGCACCTGAAAT-3’；以及5’- ATGCTGGGCAATCAATGTTTCT-3’；

[0116] 0.07ml运输液，为经处理的高纯水；

[0117] 0.03ml石蜡油；以及

[0118] 0.01ml阳性对照液，为B族链球菌特有序列。

[0119] 采用根据本发明的试剂盒检测B族链球菌的方法，包括以下步 骤：

[0120] 1)吸取1ml拭子洗脱液放置于1.5ml离心管中；

[0121] 2)将拭子放置于装有洗脱液的离心管中，使拭子浸湿，然后稍微向上提起，剪断高于离心管的拭子柄部分，盖好盖子，室温静置5分钟，高速震荡5分钟，稍离心以便甩去离心管盖子上的液体；

[0122] 3)从洗脱液中吸取50μl液体放置在裂解液管中，高速震荡5-15分钟，其中震荡时间根据所用仪器的震荡强度而定；

[0123] 4)在95℃孵育2分钟，取出并立即置于冰浴中；

[0124] 5)向反应管中加入23μl溶解液，用吸头轻吹打溶解并将试剂混合均匀；以及[0125] 6)再向反应管中加入10μl的石蜡油，取1.5μl裂解液管中的模板加到反应管中石蜡油的液面下，在石蜡油液面下，用吸头轻吹打4次，将试剂与模板混合均匀，按下列程序设置进行核酸扩增和杂交(即时核酸扩增)：

[0126] 95℃ 2分钟 1个循环

[0127] 94℃ 15秒

[0128] 55℃ 50秒 }40个循环

[0129] 72℃ 10秒

[0130] 实施例4

[0131] 试剂盒性能评估

[0132] 阳性参比品制备：由ATCC购得阳性菌株培养灭活所得。阴性参比品制备：由医院获得阴性样本培养灭活所得。

[0133] 参比品制备的实验条件：

[0134] Step1：37度2分钟，94度2分钟，

[0135] Step2: 94度15秒，

[0136] Step3：55度45秒，收集荧光。

[0137] Step2、step3循环40次。

[0138] 图1是灵敏度参比品检测结果图；

[0139] 参比品来源于含目的基因的质粒。选取106 copies/mL灵敏度参比品，标定方法为紫外分光光度计对高浓度的质粒悬液进行定量。用DNA稀释液将上述样本梯度稀释为：6 5 4 3 2
S1：10copies/mL、S2：10copies/mL、S3：10copies/mL、S4：10copies/mL、S5：10copies/mL。每个梯度浓度做重复3次，增加阴性对照。由图1可知，能稳定检测GBS-DNA的最低检测量为：S5：102copies/mL。

[0140] 图2是精密度参比品检测结果图；

[0141] 检测企业内控参比品S1-S3，即P1: 106copies/mL、P2：105copies/mL、P3：4
10copies/Ml;如图2，精密度做三批次对照（图2a、图2b、图2c、），每个批次重复10次，P1、P2、P3分别是三个批次,同时做总精密度试验（图2d），计算批内差和批间均CV值≤10%。

[0142] 图3是阳性准确性Z1-Z5参比品检测结果图；

[0143] 参考品来源于灭活临床阳性样本的分离菌株。准确性参比品Z1-Z5为由临床“金标准”检测确定为阳性的，已灭活的临床临床样本分离菌株。如图3，阳性对照为从左到右第5根蓝绿色曲线，阴性对照为最下面的一根曲线。由图可知，阴阳性符合率为100%。

[0144] 图4是Z6-Z10阴性准确性参比品检测结果图；

[0145] 参考品来源于灭活临床阳性样本的分离菌株。准确性参比品Z6-Z10为由临床“金标准”检测确定为阴性的，已灭活的临床临床样本分离菌株。如图3，阳性对照为图中蓝绿色S曲线，阴性内参均有明显扩增曲线，阴阳性符合率为100%。

[0146] 图5是特异性T1-T10参比品检测结果图；

[0147] 参考品购自ATCC 和CMCC。选取10个特异性参比品进行检测，增加2个阳性对照（一个强阳性对照、一个弱阳性对照），从左到右的扩增曲线依次为强阳、弱阳曲线，阴性对照与特异性曲线一起在最底部。由图5可知，所有特异性参比品检测结果全部为阴性，没有出现假阳性。T1-T10及阴对内参均良好，且一致性较高，阳性与弱阳性内参均不理想，与阳模竞争性抑制有关。

[0148] 图6是试剂盒中阳性对照、临界阳性对照、阴性对照参比品检测结果图；

[0149] 图中从左到右依次是阳性对照、临界阳性对照、阴性对照参比品扩增曲线。

[0150] 此外，本发明用于检测B族链球菌的试剂盒可批量生产、操作简单、简便快捷、特异性好、灵敏性高、并且符合率高，具有良好的市场应用前景。

[0151] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。