检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒，采用环介导等温扩增（LAMP）技术，并根据根据禽白血病病毒POL基因序列设计了两对特异性引物（内引物FIP和BIP、外引物F3和B3）。应用本发明及其建立的检测方法，利用ＬＡＭＰ实时浊度仪对ＡＬＶＬＡＭＰ反应引物、反应体系及反应进程进行实时、定量、全程密闭监控分析，实现了高效、特异性扩增ＡＬＶ的ＬＡＭＰ引物。本发明具有特异性强、灵敏度高、迅速得出结果、不造成污染、可实时检测产物等优点，只需按建立的体系加样即可实时检测出禽白血病病毒，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测禽白血病病毒带来便利。

权利要求

1.一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒，主要亚型禽白血病病毒为禽白血病病毒A亚型、B亚型、E亚型、J亚型，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：2×反应缓冲液、引物、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、禽白血病病毒阳性模板和超纯水；所述引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，内引物FIP的序列为CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG，内引物BIP的序列为TCAAGATGGGACAGGAGGGAGTTTTGGCTTAACGCATCCTCT；

外引物F3的序列为TGATTTGGGGGCAAGTGTAC；

外引物B3的序列为ATGACTCCGCACGTGGAG。

说明书

检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒

技术领域

[0001] 本发明属于禽白血病病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒。

背景技术

[0002] 禽白血病病毒（ALV）根据其宿主范围、不同亚型的干扰情况及其囊膜中和抗原特性，可将其分为A到J10个亚型，鸡群中常见为A、B、J和E亚型。禽白血病自在中国出现并流行以来，一直受到临床兽医、养殖业者以及科研人员的高度关注，在现实生产中急需该病的普查及净化的技术手段。虽然目前有检测ALV的多种方法报道，如酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、免疫组化等，检测核酸的有定量竞争ＰＣＲ、原位ＰＣＲ、ＲＴ-ＰＣＲ等，然而传统PCR检测需要经过变性—退火—延伸，加上DNA提取整个过程大概需要2-4小时才能得出结果。这些方法在成本、灵敏度、操作方便性上存有缺陷，一定程度上限制了它们在生产中的实际应用。ＬＡＭＰ作为一种新的核酸扩增技术，较其它分子生物学检测方法而言具有试验条件低、灵敏度高和特异性强等优势，在医学微生物的检测中受到亲睐并推广应用。尽管如此，以往技术中所用的LAMP方法检测仍需要1小时后加入染料才能判断结果，反应中加入的荧光染料syber-green，需采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像，存在开盖跑电泳观察造成的气溶胶污染，缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素，不能对检测结果做出准确的判定。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、简便快速的检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒，以便于基层实时、快速、准确地检测禽白血病病毒。

[0004] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：检测主要亚型禽白血病病毒的LAMP试剂盒，该试剂盒含有以下试剂：2×反应缓冲液、引物、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、禽白血病病毒阳性模板和超纯水；引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3，[0005] 内引物FIP的序列为CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG，[0006] 内引物BIP的序列为TCAAGATGGGACAGGAGGGAGTTTTGGCTTAACGCATCCTCT；

[0007] 外引物F3的序列为TGATTTGGGGGCAAGTGTAC；

[0008] 外引物B3的序列为ATGACTCCGCACGTGGAG。

[0009] 该试剂盒每剂含有2×反应缓冲液12.5μl、引物FIP和BIP各40pmol、引物F3和B3各5pmol、Bst DNA聚合酶1μl、荧光目视检测试剂0.2μl和禽白血病病毒阳性模板2μl。

[0010] 2×反应缓冲液来自loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒；荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光染料，来自loopamp荧光目视检测试剂盒。

[0011] 本发明采用环介导等温扩增（LAMP）技术，并根据禽白血病病毒POL基因序列设计了两对特异性引物（内引物FIP和BIP、外引物F3和B3），由此发明了检测主要亚型禽白血病病毒（禽白血病病毒ALV的主要亚型A、B、E、J）的LAMP试剂盒。本发明提供的LAMP试剂盒及其检测方法，利用ＬＡＭＰ实时浊度仪对ＡＬＶＬＡＭＰ反应引物、反应体系及反应进程进行实时、定量、全程密闭监控分析，实现了高效、特异性扩增ＡＬＶ的ＬＡＭＰ引物，建立了可视化的检测禽白血病的ＬＡＭＰ方法，它只能从禽白血病阳性样本中进行核酸的特异性扩增，不与其它常见家禽病原发生非特异性反应。应用本发明只需按建立的体系加样即可实时检测出禽白血病病毒，快速准确的获得检测结果，为简便、快速地检测禽白血病病毒带来便利。

[0012] 与传统检测手段相比，本发明具有以下优点：

[0013] <1>特异性强——所检测的阴性对照株均无阳性结果出来，与PCR检测结果一致。

[0014] <2>灵敏度高——普通PCR检测方法的灵敏度为103copies/μL数量级，而本发明检测限约为20copies/μL，是普通PCR的100倍左右。

[0015] <3>迅速得出结果——普通PCR整个过程在2-4小时左右才能得出结果，一般LAMP方法也要1小时，本发明提供的检测方法反应在25-35min间即出现扩增。

[0016] <4>不造成污染——用于观察的荧光染料为反应前加入，加入的商用染料钙黄绿素（来自loopamp荧光目视检测试剂盒，非syber-green），且检测过程无需开盖。

[0017] <5>可实时检测产物——利用Tubidimeter real-time LA-320浊度仪可实时分析LAMP反应的结果，达到实时监测判断产物的目的。

附图说明

[0018] 图1是本发明LAMP检测方法的特异性检测结果，图中：1ALV-A，2ALV-B，3ALV-E，4ALV-J，5MDV，6REV，7AILT。

[0019] 图2是本发明LAMP检测方法的敏感性检测结果，图中：12×100copies/μL，22×101copies/μL，32×102copies/μL，42×103copies/μL，52×104copies/μL，62×105copies/μL，72×106copies/μL，82×107copies/μL。

[0020] 图3是本发明LAMP检测方法的荧光可视化检测结果，图中：左管为以禽白血病病毒为模板的反应情况，右管为阴性对照。

具体实施方式

[0021] 1、材料的准备

[0022] 禽白血病病毒A亚型、B亚型、E亚型、J亚型均为为广西大学禽病室保存。LAMP法DNA扩增试剂盒（loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒）购自北京蓝谱生物科技有限公司。

[0023] 2、LAMP引物的设计与合成

[0024] 根据GenBank中禽白血病病毒POL基因序列，利用LAMP法引物辅助设计软件PrimerExplorer V4软件设计得一套LAMP引物，其中F3/B3为外引物，FIP/BIP为内引物，具体如下：

[0025] 内引物FIP的序列为CTACATTAGTGGGCGCTGTCGGAACAACTGGAAGCACGCG（见序列表SEQ.ID.No.1），

[0026] 内引物BIP的序列为TCAAGATGGGACAGGAGGGAGTTTTGGCTTAACGCATCCTCT（见序列表SEQ.ID.No.2）；

[0027] 外引物F3的序列为TGATTTGGGGGCAAGTGTAC（见序列表SEQ.ID.No.3）；

[0028] 外引物B3的序列为ATGACTCCGCACGTGGAG（见序列表SEQ.ID.No.4）。

[0029] 3、病毒的DNA提取

[0030] 取待检病毒液或研磨好的病料，12000rpm离心2min，吸取上清100μL后，按基因组DNA提取试剂盒（购自生工生物工程（上海）股份有限公司，Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒）说明书提取模板DNA。

[0031] 4、LAMP反应体系建立及具体操作步骤

[0032] 参考DNA扩增试剂盒说明书，按25μl体系配置：

[0033]

[0034] 其中，2×反应缓冲液来自loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒；所述荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光染料，来自loopamp荧光目视检测试剂盒。

[0035] LAMP反应在实时浊度仪(LA-320C，日本荣研公司)进行密闭全程监控，浊度仪时间监测扩增情况，反应温度以DNA扩增试剂盒推荐的63℃做为反应温度。

[0036] 5、LAMP检测方法

[0037] 1）特异性检测

[0038] 分别提取A亚型、B亚型、E亚型、J亚型禽白血病病毒、马立克病毒（MDV）、禽网状内皮增生病毒（REV）、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）进行LAMP扩增，检验LAMP方法的特异性，实时监测试验进程进行结果判定。

[0039] 结果如图1所示，A亚型、B亚型、E亚型、J亚型禽白血病病毒在25分钟左右出现浊度的上升曲线，为阳性结果，3株阴性对照反应管曲线均无扩增情况出现，LAMP呈阴性结果。

[0040] 2）敏感性检测

[0041] 测定敏感度时，将经过测序验证后作为ALV-J LAMP的质粒标准品，命名为ALV-JPOL。测序验证后的质粒用紫外分光光度计测其OD260，按公式换算成摩尔浓度后，-20℃保存，用前10倍稀释，梯度浓度分别为2×107copies/μL（原始毒株浓度）、2×106copies/μL、2×105copies/μL、2×104copies/μL、2×103copies/μL、2×102copies/μL、2×101copies/μL、2×100copies/μL，用基因组DNA试剂盒分别提取DNA后，进行扩增。

[0042] 结果如图2所示，LAMP法细菌纯培养物检测限约为2×101copies/μL[0043] 3）荧光可视化检测

[0044] 根据浊度仪监控优化的条件，加入荧光染料，荧光染料在反应前加入，加入的染料为钙黄绿素商用染料，63℃下反应25-30分钟后，在紫外灯下观察。

[0045] 图3为观察结果，左管为以禽白血病病毒为模板的反应情况，右管为阴性对照，表明上述建立的方法可以方便基层使用，只需使用商品化试剂配合本发明设计的LAMP引物，加入样品后，用低廉的水浴锅来操作，即可快速观察结果，且无需开盖，避免了污染。

[0046] 6、LAMP试剂盒的组装

[0047] 根据上述研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。该试剂盒含有以下试剂：2×反应缓冲液、引物、Bst DNA聚合酶、荧光目视检测试剂、禽白血病病毒阳性模板和超纯水；引物包括内引物FIP和BIP、外引物F3和B3。

[0048] LAMP反应体系按25μl配置，该试剂盒每剂含有2×反应缓冲液12.5μl、引物FIP和BIP各40pmol、引物F3和B3各5pmol、Bst DNA聚合酶1μl、荧光目视检测试剂0.2μl、待测样品模板（或禽白血病病毒阳性模板）2μl，余量用超纯水补足。

[0049] 其中，2×反应缓冲液来自loopamp脱氧核糖核酸扩增试剂盒；荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光染料，来自loopamp荧光目视检测试剂盒。