聚酮类化合物及其制备方法和用途转让专利
申请号 : CN201310729537.7
文献号 : CN103641810B
文献日 : 2015-03-25
发明人 : 张应烙 , 李帅
申请人 : 浙江师范大学
摘要 :
本发明公开了一种聚酮类化合物，其化学结构式为：本发明还公开了上述聚酮类化合物的制备方法：将保藏号为CCTCC NO:M2013257的镰刀菌ZS07（Fusarium proliferatum ZS07）进行发酵培养；所得发酵液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥，得粗浸膏；将粗浸膏进行硅胶柱层析分段，用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱；将洗脱部分F2浓缩后重结晶，得到聚酮类化合物。该聚酮类化合物能作为除草剂，具体为能抑制反枝苋幼根的生长。
权利要求 :
1.聚酮类化合物，其特征是化学结构式为：
2.层 出 镰 刀 菌 ZS07(Fusarium proliferatum ZS07)，其 保 藏 号 为：CCTCC NO:M2013257。
3.如权利要求1所述的聚酮类化合物的制备方法，其特征是包括如下步骤：
1)、将保藏号为CCTCC NO:M2013257的层出镰刀菌ZS07(Fusarium proliferatum ZS07)接种于ME培养基上，于摇床上，在160～200rpm、27.5～28.5℃培养2～3天，得种子液；
2)、将种子液接种于ME培养基中，在160～200rpm、27.5～28.5℃发酵6.5～7.5天；
得发酵液；
3)、将步骤2)所得发酵液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，真空浓缩干燥，得粗浸膏；
4)、将步骤3)所得粗浸膏进行硅胶柱层析分段，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32；从而分别得到7个洗脱部分F1～F7；
5)、将洗脱部分F2浓缩后重结晶，得到聚酮类化合物。
4.根据权利要求3所述的聚酮类化合物的制备方法，其特征是：所述ME培养基为：麦芽提取物20g、蔗糖20g、蛋白胨1g，蒸馏水定容至1L。
5.如权利要求1所述的聚酮类化合物的用途，其特征是：作为除草剂。
6.根据权利要求5所述的聚酮类化合物的用途，其特征是：抑制反枝苋幼根的生长。
说明书 :
聚酮类化合物及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及螽斯肠道共生菌菌株及其新活性代谢产物的制备和除草应用。
背景技术
[0002] 反枝苋(Amaranthus retroflexus L)是我国典型的恶性入侵杂草，严重危害旱田农作物，影响作物产量。化学除草剂曾是防治反枝苋危害的主要措施，但化学除草剂的长期使用造成了环境污染，生态失衡等诸多负面影响。在人类渴求安全有效、无污染的新型除草剂的背景下，高效、环保微生物除草剂的研究越来越受到世界范围内专家和学者的重视。
[0003] 昆虫共生菌是一类研究较少的特殊环境微生物。相对于陆生土壤来源微生物，它具有广泛的来源和丰富的多样性，同时共生菌在与寄主的长期共同进化过程中形成了独特的生理特性和代谢途径，是新活性代谢物的理想来源。
[0004] 一种现有的化合物，其结构式如式1所示；在文献Ma S M,Zhan J,Xie X,et al.Redirecting the cyclization steps of fungal polyketide synthase[J].Journal of the American Chemical Society,2008,130(1):38-39中有相应告知，但是未见有除草活性及其他任何用途报道。
[0005]
[0006] 菌株F.Proliferatum(FJ 648201)在农业生产中是一种作物致病菌，能引起玉米穗腐病(卢维宏、黄思良、司胜娟,等；中国植物病理学会2010年学术年会论文集)，F.Proliferatum能产生伏马毒素，对畜禽和实验动物可引起各种具有种属特异性的毒理(Molecular biodiversity of mycotoxigenic fungi that threaten food safety.Int.J.Food microbiol.2013,167,57-66)。
[0007] 公开号为101928672A的专利告知了：层出镰刀菌能诱导龙血树产生血竭。
[0008] 公开号为103271022A的专利告知了：肿腿蜂携带层出镰刀菌能用于防治杨十斑吉丁虫幼虫；
[0009] 西北农林科技大学的姬志勤发表的文章告知了：苦皮藤内生真菌层出镰刀菌的代谢产物对多种农业病原真菌有明显的杀菌活性。
发明内容
[0010] 本发明要解决的技术问题是提供一种聚酮类化合物及其用途。
[0011] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种聚酮类化合物，其化学结构式为：
[0012]
[0013] 本发明还同时提供了一种层出镰刀菌ZS07(Fusarium proliferatum ZS07)，其保藏号为：CCTCC NO:M2013257。
[0014] 本发明还同时提供了上述聚酮类化合物的制备方法，包括如下步骤：
[0015] 1)、将保藏号为CCTCC NO:M2013257的层出镰刀菌ZS07(Fusarium proliferatum ZS07)接种于ME培养基上，于摇床上，在160～200rpm(较佳为180rpm)、27.5～28.5℃(较佳为28℃)培养2～3天，得种子液；
[0016] 2)、将种子液接种于ME培养基中(一般而言，将10ml的种子液接种于350～450ml的ME培养基)，在160～200rpm(较佳为180rpm)、27.5～28.5℃(较佳为28℃)发酵6.5～7.5天(较佳为7天)；得发酵液；
[0017] 3)、将步骤2)所得发酵液过滤，滤液用乙酸乙酯(为等体积的乙酸乙酯)萃取，真空浓缩干燥(于0.1个负压的真空度，45℃干燥30-50分钟)，得粗浸膏；
[0018] 4)、将步骤3)所得粗浸膏进行硅胶柱层析分段，采用二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，所述二氯甲烷与甲醇的体积比依次为100:0、100:1、100:2、100:4、100:8、100:16、100:32；从而分别得到7个洗脱部分F1～F7；
[0019] 5)、将洗脱部分F2浓缩(蒸馏浓缩)后重结晶，得到聚酮类化合物。
[0020] 作为本发明的聚酮类化合物的制备方法的改进：ME培养基为：麦芽提取物20g、蔗糖20g、蛋白胨1g，蒸馏水定容至1L。
[0021] 本发明还同时提供了上述聚酮类化合物的用途：作为除草剂。
[0022] 作为本发明的聚酮类化合物的用途的改进：抑制反枝苋幼根的生长。
[0023] 本发明采用培养皿-滤纸片法测定新化合物对反枝苋种子幼根的抑制作用。
[0024] 本发明涉及一种螽斯肠道共生菌新活性代谢产物的制备和除草应用。从健康螽斯肠道中分离得到共生真菌菌株Fusarium proliferatum ZS07，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2013257。所述化合物为新结构化合物，之前未见报道。所述用途体现在该新结构化合物能抑制入侵杂草反枝苋幼根生长。本发明菌株发酵培养条件简单，新化合物提取工艺明确，抑制反枝苋幼根生长效果明显。可作为农用除草剂。
[0025] 本发明的聚酮类化合物作为除草剂时的用法和用量：稀释至0.05～0.1g/L进行喷洒；每公顷的用量(有效量)约为50～100g。
附图说明
[0026] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0027] 图1为螽斯肠道共生菌(F.Proliferatum ZS07)菌株的培养特征及孢子形态特征图；
[0028] 左图为螽斯肠道共生菌(F.Proliferatum ZS07)菌株的培养特征图；
[0029] 右图为螽斯肠道共生菌(F.Proliferatum ZS07)菌株孢子形态特征图。
[0030] 图2是聚酮类化合物和2,4-D的除草活性对比图。
具体实施方式
[0031] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明即为常规方法。
[0032] 所述试剂均可从商业途径获得。
[0033] 实施例1、菌株筛选：
[0034] 2012年11月从金华郊区捕捉健康螽斯样本，样本尽快带回实验室进行处理。
[0035] 培养基为MEA培养基：麦芽提取物20g、蔗糖20g、琼脂20g、蛋白胨1g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0。1.1个大气压，121℃下灭菌20min(为常规灭菌)。
[0036] 方法：健康螽斯昆虫饥饿24h后在无菌条件下用75％(体积％)酒精表面消毒2min，无菌水漂洗3次后解剖，取肠道加少量无菌水在研钵中研磨获得混悬液，用无菌水分
1 2 3
别梯度稀释10、10、10倍，取各梯度稀释液0.2mL涂布于MEA培养基平板上，28℃恒温箱中培养2-3天。待菌落长出后，挑取少量菌丝转接于新MEA培养基平板纯化得到单菌落，将该菌落---共生菌ZS07接种到MEA斜面试管保存备用。
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别梯度稀释10、10、10倍，取各梯度稀释液0.2mL涂布于MEA培养基平板上，28℃恒温箱中培养2-3天。待菌落长出后，挑取少量菌丝转接于新MEA培养基平板纯化得到单菌落，将该菌落---共生菌ZS07接种到MEA斜面试管保存备用。
[0037] 实施例2、菌株鉴定
[0038] ITS rDNA分析：
[0039] 按照BioTeke新型快速植物基因组DNA提取试剂盒说明书，提取上述实施例1所得的共生菌ZS07基因组DNA，采用ITS通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’正向)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，反向)扩增rDNA ITS区基因序列并纯化。
[0040] 测序结果通过BLAST程序进行相似度比较；分析结果表明，共生真菌ZS07与菌株F.Proliferatum(FJ 648201)具有较高相似度，相似度为99.5％。结合该菌形态学特征，鉴定该菌为F.Proliferatum。
[0041] 将该菌进行了保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏名称为：镰刀菌ZS07(Fusarium proliferatum ZS07)，保藏地址：中国武汉武汉大学；保藏日期：2013.06.13；保藏号为：CCTCC NO:M2013257。
[0042] 实施例3、聚酮化合物的制备
[0043] 将新鲜的镰刀菌ZS07(Fusarium proliferatum ZS07)的菌丝体块(0.5×0.5cm2，约0.5g)接种到每瓶含有150mL ME培养基的250mL锥形瓶中，接种5～6瓶，180rpm、28℃条件下培养2～3天作为种子液。
[0044] 备注说明：镰刀菌ZS07经常规的麦芽固体培养基(MEA培养基)活化后，即可得新鲜的镰刀菌ZS07。
[0045] 将10mL种子液接种于装有400mL的ME培养基的1000mL锥形瓶中，180rpm、28℃条件下发酵7天。
[0046] 发酵液用两层纱布过滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取，萃取次数为3次，真空浓缩干燥(于0.1个负压的真空度，45℃干燥30-50分钟)，得粗浸膏40.5g。
[0047] 上述ME培养基为：麦芽提取物20g、蔗糖20g、蛋白胨1g，蒸馏水定容至1L，自然PH，然后1.1个大气压，121℃下灭菌20min(为常规灭菌)。
[0048] 对该40.5g粗浸膏进行硅胶柱层析分段(所述硅胶柱选用200～300目的硅胶，重量为150g)，采用二氯甲烷/甲醇梯度洗脱，二氯甲烷/甲醇的体积比依次为100:0,100:1,100:2,100:4,100:8,100:16,100:32，每种洗脱液的用量分别为约1500ml、约1200ml、约
1000ml、约1000ml、约800ml、约800ml、约800ml；从而分别得到7个洗脱部分F1-F7。将所得的第2种洗脱部分F2进行蒸馏浓缩(于45℃干燥40-55分钟)后于甲醇中进行重结晶，所得的淡黄色晶体为聚酮类化合物。
1000ml、约1000ml、约800ml、约800ml、约800ml；从而分别得到7个洗脱部分F1-F7。将所得的第2种洗脱部分F2进行蒸馏浓缩(于45℃干燥40-55分钟)后于甲醇中进行重结晶，所得的淡黄色晶体为聚酮类化合物。
[0049] 实施例4、聚酮化合物的结构鉴定
[0050] 实施例3所得的聚酮类化合物为淡黄色晶体，ESI-MS得出化合物分子量为m/z + 1 13357[M+H]，分子式为C19H16O7。H-NMR, C-NMR结合2D-NMR谱图分析确定该化合物结构。
[0051] 其化学结构式为：
[0052]
[0053] 光谱学数据为：1H NMR(Acetone-d6)δ:2.43(3H,s,H-18),4.25(2H,s,H-10),6.30(1H,d,J ＝ 2.3Hz,H-8),6.32(1H,d,J ＝ 2.3Hz,H-16),6.51(1H,d,J ＝
2.3Hz,H-14),6.59(1H,d,J＝ 2.3Hz,H-4),6.62(1H,s,H-6),11.14(1H,s,3-OH),3.93(3H,
13
s,OCH3). C NMR(Acetone-d6)δ:21.5(C-18),47.8(C-10),55.4(5-OCH3),100.1(C-2),100.4(C-14),101.3(C-4),102.9(C-6),107.0(C-8),111.0(C-16),118.9(C-12),139.5(C-7),
141.2(C-17),152.4(C-9),156.4(C-13),160.8(C-15),163.4(C-3),166.9(C-5),167.1(C-
1),198.9(C-11)。
2.3Hz,H-14),6.59(1H,d,J＝ 2.3Hz,H-4),6.62(1H,s,H-6),11.14(1H,s,3-OH),3.93(3H,
13
s,OCH3). C NMR(Acetone-d6)δ:21.5(C-18),47.8(C-10),55.4(5-OCH3),100.1(C-2),100.4(C-14),101.3(C-4),102.9(C-6),107.0(C-8),111.0(C-16),118.9(C-12),139.5(C-7),
141.2(C-17),152.4(C-9),156.4(C-13),160.8(C-15),163.4(C-3),166.9(C-5),167.1(C-
1),198.9(C-11)。
[0054] 实施例5、实施例3所得的聚酮类化合物对反枝苋幼根的抑制作用[0055] 取适量丙酮将该化合物溶解配制成10μg/mL，1μg/mL稀释液，加5ml稀释液于铺有滤纸的培养皿中使滤纸与药液充分饱和，待丙酮挥发后加入5ml无菌水。空白对照用丙酮作同样处理。同浓度(即，10μg/mL，1μg/mL)2,4-D作为阳性对照。选取刚刚露白的反枝苋种子150粒(每皿10粒)置于上述处理过的滤纸上，27℃、80％相对湿度、定时光照(12h光照，12h黑暗)条件的人工气候培养箱培养4d。测量幼根长度，以平均根生长抑制率表示结果，每个处理重复3皿。
[0056] 平均生长抑制率(％)＝[对照平均根长-处理平均根长]/对照平均根长×100％。
[0057] 实验结果如图2所示，结果表明该聚酮类化合物对反枝苋生长有抑制作用。在浓度为1μg/mL时，新化合物对反枝苋幼根生长的抑制率为42.1％，略高于同等浓度的阳性对照2,4-D(40.1％)。当浓度增高至10μg/mL时，新化合物和阳性药都表现出较强的反枝苋幼根生长抑制活性，其中该化合物对反枝苋幼根抑制率为67.1％，相同条件下阳性药2,4-D抑制率为72.7％。
[0058] 以上结果提示，该聚酮类化合物对反枝苋幼根生长具有抑制活性，能作为除草剂。
[0059] 对比例1、将背景技术中告知的式1所述的化合物按照实施例5所述方法进行检测，无论是在浓度为1μg/mL时，还是在浓度为10μg/mL时，式1所述的化合物对反枝苋幼根的抑制率均为0％。即，式1所述的化合物对反枝苋幼根生长不具有抑制活性，不能作为除草剂。
[0060] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。