一种多功能新型小肽、包含该肽的组合物及其应用

摘要

本发明涉及一种具有Syntaxin1A H3结构域类似功能的小肽、含有该小肽的组合物及其应用，所述小肽选自：（a）Glu-Glu-Lys-Ala-Asp（b）Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro；或（c）Glu-Glu-Lys-Ala-Asn所示的氨基酸序列组成的小肽。该小肽能与GABA转运蛋白GAT-1结合，降低其对GABA的摄取功能，还能与Syntaxin1A竞争性结合SNAP-25，最终造成兴奋性神经递质的传递抑制，从而为预防或治疗因为神经信号传递活跃引起的疾病或状态提供了一种新的有效途径，可以应用于促进荷尔蒙分泌、治疗高血压药物以及减缓紧张、减少脂肪、减少皱纹和改善睡眠的保健品或化妆品。本发明的小肽对天然抑制通路进行调节，具有更安全高效的有利条件，还具有序列简单、合成方便等优势。

权利要求

1.一种具有Syntaxin 1A H3结构域类似功能的小肽，其中所述小肽为：Glu-Glu-Lys-Ala-Asp所示的序列组成的小肽。

2.一种用于预防或治疗由于Syntaxin 1A与SNAP-25或GAT-1结合效率而引起的疾病或状态的组合物，所述组合物包含如权利要求1所述的具有Syntaxin 1AH3结构域类似功能的小肽作为活性成分。

3.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含:(a)药用有效量的如权利要求1所述的具有Syntaxin 1A H3结构域类似功能的小肽；

和

(b)可药用载体的药物组合物。

4.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物包含:(a)美容有效量的的如权利要求1所述的具有Syntaxin 1A H3结构域类似功能的小肽；和(b)化妆品可用载体的化妆品组合物。

5.如权利要求2或4所述的组合物在制备改善皱纹的化妆品中的应用。

6.一种编码如权利要求1所述的小肽的多核苷酸。

说明书

一种多功能新型小肽、包含该肽的组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种多功能新型小肽，具体地涉及一种具有Syntaxin1A H3结构域类似功能的小肽，还涉及含有该小肽的组合物以及该小肽或组合物在制备治疗或预防高血压、减少脂肪、改善皱纹、改善睡眠的药物、保健品或化妆品中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

[0002] 神经递质是指神经元在进行化学突触传递过程中，起信息传递的化学物质，神经递质在神经元细胞中合成，存储于神经末梢的突触小泡中，在外界刺激的作用下，一种称为N-乙基马来酰胺敏感因子附着蛋白受体（Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor proteins，SNARE）的蛋白刺激突触小泡，使其释放出神经递质，并经突触缝隙到达突触后膜，产生突触去极化电位或超极化电位，导致突触后神经兴奋性升高或降低。

[0003] SNARE是一类位于细胞器及膜泡膜上的跨膜蛋白家族，介导膜泡与靶膜的准确识别。SNARE复合体(SNARE complex)由两个位于细胞质膜上的定向SNARE蛋白（target-SNARE)Syntaxin1A、SNAP-25以及一个位于囊泡膜上的囊泡SNARE蛋白(vesicle-SNARE)VAMP-2三者组成。在参与神经递质传递过程中，Syntaxin1A和SNAP-25首先形成一个中间复合体，即定向SNARE复合体(target-SNARE complex)，再与VAMP-2结合，形成SNARE复合体。

[0004] 从生理上来讲，皱纹的产生与面部肌肉纤维的紧张收缩有关。在外界作用下，SNARE受体刺激突触小泡，使其释放出乙酰胆碱、儿茶酚胺等兴奋性神经递质，促使肌肉发生收缩。而通过直接减少肌肉运动收缩或减弱神经递质对肌肉收缩的作用可以减少皱纹的产生或者消除已经生成的皱纹。

[0005] 当前已有部分开发的产品及其相关发明涉及通过阻断乙酰胆碱在神经-肌肉接头处的释放和抑制SNARE受体的合成，引起脸部肌肉组织的松弛，释放皱纹。如A型肉毒毒素（Botox）结合到神经元细胞膜，通过钙和pH依赖易位过程进入细胞，并以温度和锌离子依赖方式阻断SNARE位点，从而抑制了钙依赖性神经元的细胞释放神经递质，使得肌肉因没有接受到信息而不产生收缩。

[0006] 目前，Botox获美国食品和药品监督管理局(FDA)批准的适应症有：慢性偏头痛、腋下严重出汗（多汗症）、眼睑痉挛和斜视（眼肌异常症）、颈肌异常症、成人肢体痉挛、眉间皱纹和改善鱼尾纹线外观。其中用于治疗眉间皱纹和改善鱼尾纹线外观的Botox Cosmetic是FDA批准的唯一治疗药物。检索美国专利数据库，Allergan公司已为Botox的90多种潜在适应症申请了专利。

[0007] 虽然Botox除皱效果优异，但因其毒性强，只能在医嘱条件下谨慎使用，难以普及。因此另有公司试图合成与SNAP-25类似的小肽，以期达到与Botox相似的功效，如西班牙LipoTec公司的Agriline和法国Kappa Biotech公司开发的LETTICELINE。该小肽是一种已肽物（Ac-EEMQRR-NH2），模仿了SNAP-25的末端链，可与SNAP-25竞争占有SNARE中的位置，从而抑制了钙依赖性儿茶酚胺从亲铬细胞中释放出来。虽然这类小肽效果较Botox弱，但临床研究证明连续使用30天10%浓度小肽可减轻皱纹30%左右。另一种生物活性肽来源自蜂毒、蛇毒、蟾毒等生物神经毒素，可迫使体内信号通路阻断，例如来自蝮蛇（Wagler）的Waglerin-1毒液是一个22-氨基酸肽选择性结合乙酰胆碱受体（nAChPs）。瑞士Pentapharm公司合成的三肽模拟Waglerin–1的功能，已经以SYN-AKE上市，SYN-AKE作用于突触后膜，通过结合到nAChP的小亚单位达到阻止乙酰胆碱与受体结合的目的，从而抑制肌肉收缩，减少皱纹生成。

[0008] 预计在未来数年中将会有更多的神经递质抑制剂被开发和应用。但是，目前已开发和申请专利的抑制剂主要是通过强烈阻断完整的神经细胞信号通路达到目的，因此可能会引起正常细胞的信号通路紊乱。而在机体中还存在着另一种天然的神经信号抑制通路，利用此通路，既可以达到抑制神经兴奋，阻止肌肉收缩的效果，又可以避免外在强制阻断信号通路的弊端。因此，开发天然神经信号抑制通路激活剂比开发兴奋神经递质抑制剂更为重要和安全。

[0009] 主要的神经递质包括乙酰胆碱、儿茶酚胺、谷基酸、多巴胺（DA）、5-羟色胺（5-HT）、γ-氨基丁酸（GABA）、P物质、和一氧化氮等。其中GABA和谷氨酸为抑制性神经递质，其他均为兴奋性神经递质。

[0010] GABA是一种天然存在的非蛋白质氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经传递物质，约50%的中枢神经突触部位以GABA为递质。GABA可以快速穿透皮肤，抑制神经传递，释放皱纹，淡化细纹，增强肌肉本身的放松机能，从而具有减压美容的效果。

[0011] 另外，GABA作为一种抑制性神经递质，可抑制中枢神经系统过度兴奋，具有安定、促进放松和消除神经紧张的作用。

[0012] 当GABA作用于血管运动中枢时，可促进动脉血管扩张，进而有效降低血压。进入体内的GABA还能有效抑制血液中谷氨酸的脱羧作用，促进血氨转化为尿素排出体外，进而预防高血压。

[0013] GABA作用于中枢神经时，能促进脂肪分解代谢，减少合成代谢，有效降低肝脏及血液中的甘油三酸酯（TG）含量，对降低体重及预防动脉硬化有效。

[0014] 但是，体内GABA的作用会受到机体自身终止途径的干扰，降低GABA的效果或者缩短GABA的有效作用时间。因此发展一种能可逆抑制GABA失效机制的物质并且适当增强GABA有效浓度对高效利用天然抑制途径具有重要意义。

[0015] 神经递质的作用可通过两个途径中止：一是再回收抑制，即通过突触前载体的作用将突触间隙中多余的神经递质回收至突触前神经元并贮存于囊泡；另一途径是酶解，如以多巴胺（DA）为例，它经由位于线粒体的单胺氧化酶（MAO）和位于细胞质的儿茶酚胺邻位甲基转移酶（COMT）的作用被代谢和失活。GABA的作用通过第一种途径中止。

[0016] GABA转运蛋白(GABA transporter)会重摄取突触间隙中的GABA以终止突触的信号传递。Syntaxin1A及SNAP-25/Syntaxin1A复合体（即定向SNARE复合体）可以与位于神经元上的GABA转运蛋白GAT-1(GABAtransporter-1)亚型直接结合，从而抑制它的重摄取功能。SNAP-25与Syntaxin1A结合Syntaxin1A与GAT-1的相互作用，从而显著增强了Syntaxin1A介导的对GAT-1重摄取功能的抑制。例如，一氧化氮(NO)促进的Syntaxin1A与SNAP-25结合以及SNARE复合体形成能够加强Syntaxin1A与GAT-1的相互作用，从而抑制GAT-1对GABA的重摄取。

发明内容

[0017] 为了克服现有技术中的神经递质抑制剂毒性强的缺点，本发明人对抑制性神经递质GABA的信号通路进行了深入研究，最终设计出了一种具有Syntaxin1A H3结构域类似功能的小肽，实现了对GABA的再回收抑制。

[0018] 因此，本发明的目的在于提供一种具有Syntaxin1A H3结构域类似功能的小肽。

[0019] 本发明的另一目的在于提供一种用于预防或治疗由于Syntaxin1A与SNAP-25或GAT-1结合效率而引起的疾病或状态的组合物。

[0020] 本发明的另一目的在于提供一种用于预防或治疗由于Syntaxin1A与SNAP-25或GAT-1结合效率而引起的疾病或状态的组合物的应用。

[0021] 本发明的另一目的在于提供一种编码具有Syntaxin1A H3结构域类似功能的小肽的多核苷酸。

[0022] 一方面，在本发明的一个实施方案中，本发明人进行了深入研究以制备和筛选出多种具有Syntaxin1A结构域类似功能的小肽，并且己经选择出一种显现出较高活性和稳定性的小肽，所述小肽由5个氨基酸组成，氨基酸序列为Glu-Glu-Lys-Ala-Asp（SEQ ID NO:1），在本发明中称为JKB-A小肽，其测序结果如图3所示。本发明人将JKB-A小肽在UniProt数据库中进行对比搜索，未发现有功能相同的同类小肽。本发明人利用分析程序，按照本领域技术的默认参数对JKB-A小肽与Syntaxin1A的同源性进行序列比对分析，结果得出这五个氨基酸与Syntaxin1A H3结构域的结构和功能类似，而Syntaxin1A H3结构域已被鉴定为结合SNAP-25和GAT-1的位点（Fan,et al.,SNAP-25/syntaxin1A complex functionally modulates neurotransmitter gamma-aminobutyric acid reuptake.J Biol Chem.2006;281(38):28174-84）。

[0023] 因此，本发明的肽包含与Syntaxin1A H3结构域类似功的SEQ ID NO：1氨基酸序列。优选地，所述肽主要由SEQ ID NO:1氨基酸序列组成。最优选地，所述肽由SEQ ID NO:1氨基酸序列组成。

[0024] 本发明中所用术语“肽”是指通过肽键连接氨基酸残基而形成的直链分子。

[0025] 本发明的JKB-A小肽能够直接与SNAP-25和GAT-1结合，增强了对GAT-1的重摄功能的抑制，从而延长GABA的抑制作用，提高局部GABA的有效作用浓度。同时，本发明人通过实验还证实JKB-A小肽在体外能够与Syntaxin1A竞争性结合SNAP-25，导致SNARE复合体的结合效率降低甚至解聚。因为JKB-A小肽和SNAP-25形成的中间复合体，不能再与VAMP-2结合形成SNARE复合体，进一步阻止了皮肤神经细胞中的乙酰胆碱、儿茶酚胺等兴奋性神经递质经SNARE的激活作用，从而抑制了神经传递，减轻了肌肉收缩和面部皱纹。

[0026] 由于本发明SEQ ID NO:1所示的序列为仅有5个氨基酸序列的小肽，所以本领域的普通技术人员可以很容易对SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行本领域常规的改变而不改变其功能，所述改变例如进行常规取代、缺失或添加等操作，尤其是进行非极性氨基酸间或是极性氨基酸间(特别是不带电荷的极性氨基酸间或带相同电荷(带正电荷或负电荷)的极性氨基酸间)的取代。在本发明的一个具体实施方案中，本发明的小肽可以为Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro（SEQ ID NO:2）所示的序列组成的小肽（在本文中称JKB-A1）或Glu-Glu-Lys-Ala-Asn（SEQ ID NO:3）所示的序列组成的小肽（在本文中称JKB-A2），JKB-A1和JKB-A2小肽的结构和功能与Syntaxin1A H3结构域的结构和功能类似。

[0027] 本发明的小肽可以按本领域技术人员已知的常规固相合成方法合成。例如本发明小肽可以用Applied Biosystem合成仪或PioneerTM肽合成仪按固相化学技术合成。一般，这些方法包括向成长的肽链上依次添加一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸。一般，第一个氨基酸的氨基或羧基用适当的保护基保护，然后将保护的氨基酸连在惰性固相载体上，随后在适于形成酰胺键的条件下加入相应氨基或羧基被适当保护的序列中的下一个氨基酸。然后从新加入的氨基酸残基上除去保护基，再加入必要时适当保护的下一个氨基酸，如此重复操作。当所有氨基酸以正确的顺序连接后，相继或同时除去任何剩余的保护基和固相支持物，得到最终的多肽。通过简单修改此一般程序，可能一次向成长链添加一个以上的氨基酸。

[0028] 在本技术领域中，为了增强肽的稳定性通常会对肽进行一定的修饰，例如，可以在氨基酸残基的N-末端或C-末端加上保护基团保护本发明的小肽在体内免遭蛋白酶的降解。

[0029] 第二方面，本发明的一个实施方案中，提供了一种用于预防或治疗由于Syntaxin1A与SNAP-25或GAT-1结合效率而引起的疾病或状态的组合物，所述组合物包含具有Syntaxin1A H3结构域类似功能的小肽作为活性成分。在本发明中，术语“Syntaxin1A与SNAP-25或GAT-1结合效率而引起的疾病或状态”是指由于Syntaxin1A与SNAP-25或GAT-1的结合效率不同（包括结合增强或减弱）引起的相关的神经信号通路的改变而导致的生理反应。优选地，可以将本发明的肽或组合物着重预防或治疗功效的活性描述为:改善皮肤状态、降低血压、改善睡眠、减少脂肪。

[0030] 更优选地，本发明的组合物显现出改善皮肤状态的功效。尤其是，由于其低分子量，在本发明的组合物中用作活性成分的小肽显示出优异的皮肤渗透性。因此，当本发明的组合物局部施用于皮肤时，皮肤状态显著改善，最优选为改善皱纹或皮肤弹性、预防皮肤老化。

[0031] 本发明的组合物可以作为药物、保健品或化妆品组合物制备。

[0032] 根据优选的实施方案，所述组合物为包含(a)药用有效量的包含SEQID NO:1、NO:2或NO:3氨基酸序列的小肽；和(b)可药用载体的药物组合物。

[0033] 本文所用术语“药用有效量”是指足以显示出并实现本发明的肽的效能和活性的量。

[0034] 本发明的药物组合物内含有的可药用载体，其通常用在制药配方中，但不限于此，包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉等。根据本发明所述的药物组合物可以另外包含润滑剂、湿润剂、增甜剂、增香剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂等物质。根据本领域技术人员已知的常规技术，可以与如上所述的可药用载体和/或赋形剂一起配制，根据本发明所述的药物组合物，最终提供几种形式的单剂量型和多剂量型。

[0035] 根据优选的实施方案，所述组合物为包含(a)美容有效量的含有SEQID NO:1、NO:2或NO:3氨基酸序列的小肽；和(b)化妆品可用载体的化妆品组合物。

[0036] 本文所用术语“美容有效量”是指足以实现以上所述的改善皮肤状态的功效的量。

[0037] 可以将本发明的化妆品组合物制成很多种形式，例如，包括溶液、混悬液、乳状液、膏、油膏、凝胶、霜、洗剂、粉、肥皂、含表面活性剂的清洁剂、油、粉底、乳状液粉底、蜡状粉底和喷雾剂。具体而言，可以将本发明的化妆品组合物制成以下形式:营养液、营养霜、按摩霜、精华素、眼霜等。

[0038] 第三方面，本发明提供了上述小肽和组合物的具体应用，包括：

[0039] （1）在制备治疗高血压的药物或保健品中的应用，其作用机理如前所述，即本发明的小肽或组合物能够促进GABA作用于血管运动中枢，从而促进动脉血管扩张，有效降低血压。同时还能够有效抑制血液中谷氨酸的脱羧作用，促进血氨转化为尿素排出体外，进而预防高血压。

[0040] （2）在制备减少脂肪的药物或保健品中的应用，其作用机理如前所述，即本发明的小肽或组合物能够协同作用于中枢神经时，能促进脂肪分解代谢，减少合成代谢，从而有效降低肝脏及血液中的甘油三酸酯（TG）含量，达到降低体重及预防动脉硬化的目的。

[0041] （3）在制备改善皱纹的化妆品或保健品中的应用，其作用机理如前所述，即本发明的小肽或组合物能够抑制GAT-1对GABA的再回收，从而延长GABA的抑制作用，抑制神经传递引起的面部肌肉纤维的紧张收缩，达到改善皱纹的目的。

[0042] （4）在制备改善睡眠的药物或保健品中的应用，其作用机理如前所述，即本发明的小肽或组合物能够抑制GAT-1对GABA的再回收。GABA作为一种抑制性神经递质，可抑制中枢神经系统过度兴奋，具有安定、促进放松和消除神经紧张的作用，因而可用于改善睡眠。

[0043] 第四方面，本发明提供了一种编码本发明所述的小肽的多核苷酸。本领域普通技术人员已知，可以根据不同氨基酸对应的密码子，确定编码如SEQ ID NO:1所示小肽的多肽的多核苷酸。由于密码子的简并性，所述的多核苷酸可以有不同的形式，优选根据不同生物密码子的使用频率，选择相应的密码子。本发明的多肽的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA，DNA可以是双链或是单链形式，单链DNA可以是编码链或是非编码链(反义链)。由于本发明的小肽氨基酸序列很短，本领域技术人员可以很容易确定编码其小肽的多核苷酸序列。

[0044] 本发明提供一类全新的小肽，结构简单、合成方便，可以快速的进行突变改造。经实验证明，此类小肽具有Syntaxin1A H3结构域结构相似特性，能与GABA转运蛋白GAT-1结合，降低其对GABA的摄取功能，还能与Syntaxin1A竞争性结合SNAP-25，最终造成兴奋性神经递质的传递抑制，从而为预防或治疗因为神经信号传递活跃引起的疾病或状态提供了一种新的有效途径。主要表现为减弱肌肉纤维的收缩，松弛面部皱纹，从而达到减轻甚至消除皱纹的功效；改善因神经递质兴奋引起的失眠，提高睡眠质量；降低因神经紧张引起的高血压；减少脂肪。本发明的小肽对天然抑制通路进行调节，具有更安全高效的有利条件。

附图说明

[0045] 图1显示JKB-A与GAT-1的结合。

[0046] 图2显示JKB-A与Syntaxin1A竞争性结合SNAP-25。

[0047] 图3显示JKB-A的GC-MS检测峰。

[0048] 图4显示眼周连续30天使用有效浓度0.01%（W/V）JKB-A与0.01%（W/V）GABA溶液后皱纹变化。

具体实施方式

[0049] 现在将通过实施例更详细地描述本发明。对于本领域技术人员显而言，这些实施例是为了更具体地说明，而如所附权利要求所述的本发明的范围并不限于这些实施例也不受这些实施例的限制。

[0050] 实施例1：JKB-A的制备

[0051] 1.利用单通道Liberty全自动流动微波多肽合成系统合成其全序列，通过HPLC反相C18柱脱盐、纯化。

[0052] 2.利用高效液相（HPLC）分离检测（C18柱），鉴定其纯度。

[0053] 3.采用快原子轰击质谱法（FAB-MS）测定其分子量，其中以甘油：间硝基苄醇：二+甲亚砜（体积比1:1:1）为底物，Cs作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25kV。

[0054] 4.用自动氨基酸测序仪测定合成小肽序列的氨基酸序列结构。

[0055] 经测定，JKB-A的氨基酸序列为SEQ ID NO：1：Glu-Glu-Lys-Ala-Asp，其分子量590Da，等电点5.52，序列分析显示其具有与Syntaxin1A H3结构域结构相似特性。

[0056] 实施例2：JKB-A突变体及衍生序列的制备

[0057] 1.在JKB-A序列基础上进行残基替换及末端残基增加，获得衍生体库。

[0058] 2.经改造的小肽的合成及分离纯化同实施例1中JKB-A方法一样。

[0059] 3.获得的产物与Syntaxin1A H3结构域特异性抗体孵育，进行标准Western Blot实验，检查突变序列功能特性。

[0060] 最终获得两个具有与Syntaxin1A H3结构域特异性抗体结合能力的小肽序列，分别为：

[0061] SEQ ID NO:2：Gla-Glu-Glu-Lys-Ala-Asp-Pro

[0062] SEQ ID NO:3：Glu-Glu-Lys-Ala-Asn

[0063] 实施例3：:JKB-A的药理实验

[0064] 1、JKB-A与GAT-1结合的检测

[0065] 亲铬细胞培养物取自于牛肾上腺，并经胶原酶消化，通过离心法去除了红血球，使细胞密度为652000个/cm2。检测实验分别在细胞培养后3天和6天进行，所有实验均在37℃下进行。取新鲜亲铬细胞，裂解细胞，细胞裂解液在37℃条件下与JKB-A共孵育10小时（每隔三小时换液一次），然后在100V电压，0.5A条件下进行12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，使跑胶产物与GAT-1单克隆抗体孵育，牛奶封闭，洗脱后再次孵育荧光标记二抗。震荡孵育4小时后进行显影照相。

[0066] 从附图1可以看出，JKB-A能够与GAT-1相结合，并且随着JKB-A浓度的增加结合强度增大。说明JKB-A具有GAT-1结合能力，并且是浓度依赖的。

[0067] 2、JKB-A与Syntaxin1A竞争性结合SNAP-25的验证

[0068] 在等摩尔的VAMP-2和Syntaxin1A存在的条件下，40℃下培养2h。接着加入SNAP-25与JKB-A或SNAP-25与JKB-A1混合液，其中在第一组实验中，JKB-A、JKB-A1的浓度为5mg/L,SNAP-25与JKB-A、JKB-A1摩尔比为1:2；第二组实验中，JKB-A、JKB-A1的浓度为10mg/L,SNAP-25与JKB-A、JKB-A1摩尔比为1:2，40℃下反应3h。最后所得到的组合物用12%SDS-PAGE凝胶中分析，用Kodak X-O-mat AR X射线测试实验结果。

[0069] 从图2中可以看出，随着JKB-A加入的增多，形成的完整三元SNARE复合物的数量在降低，说明JKB-A可以竞争性结合SNAP-25。

[0070] 实施例四：JKB-A的去皱实验

[0071] 1、JKB-A溶液皮肤渗透性实验

[0072] 将JKB-A溶液均匀涂抹在固定的人角质层细胞上，2h后检测细胞表面残留JKB-A含量。使用少量溶剂洗脱培养细胞表面残留JKB-A，通过HPLC检测洗脱下的JKB-A总量，比较JKB-A在细胞表面含量的的变化，测定具体的渗透率。

[0073] 表1:不同浓度JKB-A溶液皮肤渗透率

[0074]JKB-A浓度 2小时细胞渗透率
0.005%（W/V） 99%
0.010%（W/V） 81%
0.015%（W/V） 85%
0.020%（W/V） 63%

[0075] 从上表可知，JKB-A溶液的皮肤渗透性良好。

[0076] 2、JKB-A抗皱性能测试

[0077] 用含0.01%（W/V）JKB-A溶液与0.01%（W/V）GABA或含有这两种成分的眼霜（试验组），分别对8名志愿者的眼部一侧进行试验，另一侧使用清水或不含有JKB-A与GABA的眼霜作为安慰剂（对照组）。在实验进行的0天、15天和30天后（每天使用2次），用激光扫描显微镜（DMIRB）观察皱纹变化情况。试验前，使眼部的皮肤保持干净，在皱纹中无任何裂缝。观察后，用三维图来表示皱纹部位的变化情况，三维图中，X、Y、Z范围分别为1500μm、1500μm、和500μm，整个三维图是由201个观察点组成的，每一个的间距为2.5μm。所有的参数值都是用UNE EN ISO4207标准化方法计算的，每位志愿者的不同值用Pa方法（等同于DIN4768）递减百分比来处理的。

[0078] 三维图的制作：每位志愿者的眼部皱纹变化最终通过2个观察图确定：①皮肤地形图（深度图）：这是对观察到的皮肤皱纹表面结构的真实描述；②三维图像：它是从以上的皮肤地形图而得的，给出了它们表面的三维图像的描绘。

[0079] 表2：试验组与对照组30天涂抹眼周皱纹变化统计

[0080]

[0081] *为通过图像分析处理统计包含皱纹的眼部范围（总表面积约125-150cm2）[0082] #为通过图像分析处理统计眼部范围内最大皱纹深度

[0083] 由对照组和试验组的统计结果可以看出，本发明的肽对于改善皮肤皱纹表现显著功效。

[0084] 由图4可以看出，与安慰剂相比，一名志愿者眼周在连续30天使用有效浓度0.01%（W/V）JKB-A与0.01%（W/V）GABA溶液后，皱纹明显细化。