水稻种子耐盐萌发主效QTL位点qGR2的分子标记及其应用

摘要

本发明公开了本发明属于种子科学与技术应用领域，涉及水稻种子耐盐萌发主效QTL位点qGR2的分子标记及其应用。利用本发明SSR标记的引物中的一对或多对对水稻基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着控制水稻种子耐盐萌发的主效QTL qGR2增效等位基因的存在。通过本发明的与种子耐盐萌发基因qGR2共分离和紧密连锁的分子标记方法，可预测水稻萌发期耐盐性水平，能快速筛选出水稻种子萌发期耐盐性品种。

权利要求

1.水稻种子耐盐萌发主效QTL位点qGR2的分子标记，其特征在于所述的分子标记上游引物为P8L：SEQ ID NO.5，下游引物为P8R：SEQ ID NO.6，扩增产物大小为252bp。

2.权利要求1所述的分子标记在水稻种子萌发期耐盐性分子筛选中的应用。

3.权利要求1所述的水稻种子耐盐萌发主效QTL位点qGR2的分子标记引物，其特征在于上游引物为P8L：SEQ ID NO.5，下游引物为P8R：SEQ ID NO.6，扩增产物大小为252bp。

4.权利要求3所述的分子标记引物在水稻种子萌发期耐盐性分子筛选中的应用。

5.水稻种子萌发期耐盐性分子筛选方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）取水稻叶片，提取基因组DNA；

（2） 利用权利要求3所述的分子标记引物对所述的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着耐盐基因qGR2增效等位基因的存在。

6.根据权利要求5所述的水稻种子萌发期耐盐性分子筛选方法，其特征在于所述的PCR反应：体积为25微升，其中10×buffer 2.5微升，25mM MgCl2 1.5微升，4pmol/微升引物对

2.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，5单位/微升 Taq酶 0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升；反应程序为 DNA 95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环

35次；最后72℃延伸 10min。

说明书

水稻种子耐盐萌发主效QTL位点qGR2的分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于种子科学与技术应用领域，涉及水稻种子耐盐萌发主效QTL位点qGR2的分子标记及其应用。

背景技术

[0002] 水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一。由于灌溉和施肥不当往往导致土壤中盐分积累，全球约有30％的水稻耕地受到盐害的影响。盐害已成为影响水稻生产的重要因素之一。

[0003] 水稻在萌发期、苗期、分蘖期、孕穗期和成熟期等各个生长发育阶段都会发生不同程度的盐害，其中萌发期盐害容易发生在水稻直播田和秧田。尤其，随着经济的发展，水稻直播变得越来越普遍，水稻萌发期耐盐性显得尤为重要。

[0004] 目前，对水稻耐盐性的QTL定位研究主要集中在苗期和成熟期，对种子萌发期研究尚少。多位学者利用不同RILs、DH、F2:3等水稻作图群体，已定位了多个贡献率大于20％水稻盐胁迫相关主效QTLs。迄今为止，仅有一个苗期主效QTL SKC1是基于图位克隆方法被克隆。

[0005] 在种子萌发期，盐分对种子萌发的影响一般归结为渗透效应和离子效应。渗透效应引起溶液渗透势降低而使种子吸水受阻，从而影响种子萌发；离子效应一方面造成直接毒害而抑制种子萌发，另一方面渗入种子，降低种子渗透势，加速吸水而促进萌发。可见，在盐逆境胁迫下，种子萌发性状是一个非常复杂的综合性状。种子萌发性状往往表现在发芽率、苗长、根长、鲜重、干重等诸多方面，是由多基因的控制的数量性状。随着分子标记技术及数量性状基因位点（QTL）分析技术的快速发展，控制种子萌发的QTL在染色体上的位置以及各位点对表型的相对贡献率都能被确定。目前，种子萌发数量性状基因位点分析已在拟南芥、水稻、大豆、莴苣等少数作物上有报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供水稻种子萌发期耐盐性筛选的分子标记方法。通过检测与水稻种子耐盐萌发基因位点连锁的分子标记，可以快速筛选出耐盐水稻品种，提高水稻种子萌发期耐盐性筛选的可靠性、有效性；可以确定有无控制种子萌发期耐盐基因导入到育种品系中，提高水稻耐盐性状的选择效率、加快育种进程。

[0007] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：

[0008] 水稻种子耐盐萌发主效QTL位点qGR2的分子标记，所述的分子标记选自RM13441、P8、RM13443中的任意一种；所述的分子标记RM13441上游引物为RM13441L：SEQ ID NO.1，下游引物为RM13441R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为87bp；所述的分子标记P8上游引物为P8L：SEQ ID NO.3，下游引物为P8R：SEQ ID NO.4，扩增产物大小为252bp；所述的分子标记RM13443上游引物为RM13443L：SEQ ID NO.5，下游引物为RM13443R：SEQ ID NO.6，扩增产物大小为182bp。

[0009] 本发明所述的分子标记在水稻种子萌发期耐盐性分子筛选中的应用。

[0010] 本发明所述的水稻种子萌发期耐盐萌发主效QTL位点qGR2的分子标记引物，所述的分子标记RM13441上游引物为RM13441L：SEQ ID NO.1，下游引物为RM13441R：SEQ ID NO.2，扩增产物大小为87bp；所述的分子标记P8上游引物为P8L：SEQ ID NO.3，下游引物为P8R：SEQ ID NO.4，扩增产物大小为252bp；所述的分子标记RM13443上游引物为RM13443L：SEQ ID NO.5，下游引物为RM13443R：SEQ ID NO.6，扩增产物大小为182bp。

[0011] 本发明所述的分子标记在水稻种子萌发期耐盐性分子筛选中的应用。

[0012] 水稻种子萌发期耐盐性分子筛选方法，步骤如下：

[0013] （1）取水稻叶片，提取基因组DNA。

[0014] （2）利用表1中的任意1对或1对以上分子标记引物对所述的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺胶上进行电泳检测，如果扩增出对应大小的DNA片段，标志着qGR2增效等位基因存在。

[0015] 表1

[0016]

[0017] 其中，所述的PCR反应体系：体积为25微升，其中10×buffer2.5微升，25mM MgCl21.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。

[0018] 用SSR分子标记RM13441的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻的杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出87bp的扩增片段，则标志着qGR2的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出82bp，则表明增效等位基因没有导入。在2105个BC2F2分离群体中，用交换配子数计算，此标记与耐盐主效基因qGR2共分离的，单标记选择效率达98%。

[0019] 用SSR分子标记RM13443的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻的杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出182bp的扩增片段，则标志着qGR2的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出223bp，则表明增效等位基因没有导入。在2105个BC2F2分离群体中，用交换配子数计算，此标记与耐盐主效基因qGR2共分离的，单标记选择效率达99.8%。

[0020] 用SSR分子标记P8的上下游引物扩增水稻品种韭菜青或者韭菜青与籼稻的杂交后代的基因组DNA，如果能够扩增出252bp的扩增片段，则标志着qGR2的韭菜青增效等位基因存在，否则扩增出263bp，则表明增效等位基因没有导入。在2105个BC2F2分离群体中，用交换配子数计算，此标记与耐盐主效基因qGR2共分离的，单标记选择效率达100%。

[0021] 上述3个分子标记对qGR2的选择效率在98%以上，其中SSR标记P8与qGR2共分离，选择准确率高，达100%。上述3个标记可以择一使用，也可以任意选择2对或2个以上标记联合使用。3个标记中任意2个分子标记组合选择，选择效率也达到100%。

[0022] 有益效果

[0023] 本发明所提供的水稻种子萌发期耐盐性筛选的分子标记方法，具有以下优点：

[0024] （1）通过本发明开发的分子标记在国际上首次定位了位于2号染色体长臂上的来自太湖流域粳稻品种韭菜青的控制种子耐盐萌发主效QTL新位点qGR2，并获得了共分离或高度紧密连锁的SSR标记RM13441、P8和RM13443。

[0025] （2）通过本发明分子标记定位的水稻种子耐盐萌发主效QTL qGR2的位置明确、精细，鉴定方法快速简便，选择效率高。只需要检测这些标记的扩增条带特征，就可以判断耐盐基因qGR2是否存在，以此预测水稻种子萌发期的耐盐水平，可以快速、有目的性的筛选耐盐性强的品种或品系，用于改良水稻耐盐性。这些标记与耐盐基因qGR2共分离或高度紧密连锁，单标记选择效率达98%-100%，任意双标记选择率达100%。

[0026] （3）辅助育种选择目标明确，节约成本，不受环境影响。在传统育种方法中，首先要收集耐盐亲本与骨干亲本进行一系列杂交，回交，而且要等到收获种子破休眠后，对后代进行耐盐表型鉴定从而选择单株。传统育种方法受环境影响大，可靠性低。通过本发明的与种子耐盐萌发基因qGR2共分离和紧密连锁的分子标记方法，可预测水稻萌发期耐盐性水平，可以在萌发期就鉴定出耐盐的单株，淘汰其它植株，可以有效控制育种规模，提高育种效率，能快速筛选出水稻种子萌发期耐盐性品种；同时，在水稻耐盐育种群体构建时，可以快速鉴定出具有耐盐基因qGR2的单株，可以快速导入水稻耐盐基因，大大提高选择效率，缩短育种年限，为水稻耐盐品种改良和育种服务。

附图说明

[0027] 图1：两亲本韭菜青和IR26在不同盐浓度胁迫下表型

[0028] 图2：qGR2在2号染色体上精细定位

[0029] 图3：新开发的与qGR2紧密连锁的分子标记多态性电泳条带

具体实施方式

[0030] 实施例1

[0031] （一）材料与方法：

[0032] 1.材料：强耐盐品种韭菜青与IR26杂交（图1），通过单籽粒传法获取150个RIL家系F2:9，进行初定位，再选择含有qGR2位点背景似IR26的家系进行回交，自交，获取分离BC2F2分离群体，进行精细定位，确定连锁标记。

[0033] 2.用SDS法提取个体DNA。

[0034] 3.多态标记筛选：选择900对SSR引物对，以韭菜青与IR26为模板，进行PCR扩增，筛选多态性标记。

[0035] 4.PCR反应体系：体积为25微升，其中10×buffer2.5微升，25mM MgCl21.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。在biometre扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺胶（含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉双丙烯酰胺）上进行电泳分离。在1000对SSR引物中游135对引物扩增产物在亲本间存在多态，用于连锁图谱构建和QTL检测。

[0036] 5.萌发期耐盐性QTL初位点：利用单籽粒传法获得的150个RIL家系全部种植与江浦，取样并收获成熟的种子，去杂，42℃烘干去休眠，再保存于-20℃冰箱，以备长期使用；同时，使用上述筛选的标记利用RIL群体构建水稻遗传图谱，鉴定每个RIL家系在种子萌发期的耐盐力，结合软件分析获取水稻种子萌发期耐盐性QTL初步位点。

[0037] 6.软件运算：所用软件为QTL IciMapping Version3.2，最小LOD值设为3，步伐为1，获取连锁图谱，并进行QTLs定位分析。

[0038] 7.连锁标记验证与区间确定：对含有qGR2位点背景与IR26相似的家系进行回交、自交获得BC2F2分离群体每个单株的后代，进行耐盐性状鉴定，并结合其基因型构建水稻遗传图谱，验证连锁的分子标记，从而有效确定缩小定位区间。

[0039] （二）结果与分析

[0040] 利用单籽粒传法获得的150个RIL家系全部种植与江浦，取样，提前DNA，利用具有多态性标记135个构建遗传图谱；同时，收获成熟的种子，去杂，42℃烘干去休眠，进行鉴定每个RIL家系在种子萌发期的耐盐能力；结合表型和遗传图谱，利用软件分析发现16个QTL水稻种子萌发期耐盐性位点，4个主效QTL位点，其中位于RM8254与RM5804标记之间的qGR2位点效应最大。

[0041] 对含有qGR2位点背景与IR26相似的家系进行回交、自交获得BC2F2分离群体每个单株的后代，进行种子萌发期盐胁迫表型鉴定，并结合其基因型构建水稻遗传图谱，将水稻种子萌发期耐盐基因qGR2位点区间缩小与RM13441与RM13443标记之间（图2）。

[0042] 对BC2F2分离群体2105株分离个体表型鉴定与标记分析，在分子标记RM13441和RM13443间获得43个交换株。标记P8与qGR2共分离，没有交换株，说明单标记对qGR2的选择效率达100%；标记RM13441和RM13443与qGR2交换率在2%以下，单标记对qGR2的选择效率达98%以上。

[0043] 通过检测与水稻种子耐盐基因位点连锁的分子标记，可以预测水稻种子萌发期耐盐性水平，可以确定有无控制水稻种子耐盐基因导入育种品系中，提高水稻耐盐性育种选择效率，加快育种进度。利用与qGR2共分离或紧密连锁的P8、RM13441和RM13443进行单标记选择，选择效率可达到98%-100%，任何双标记组合选择效率均达到100%，可用于分子标记辅助选择育种。

[0044] 实施例2

[0045] （一）材料与方法：

[0046] 1.材料：水稻品种韭菜青与IR26。

[0047] 2.用SDS法提取个体DNA。

[0048] 3.标记：RM13441、P8、RM13443。

[0049] 4.PCR反应体系：体积为25微升，其中10×buffer2.5微升，25mM MgCl21.5微升，4pmol/微升引物对2.5微升，2.5mM dNTPs2微升，5单位/微升Taq酶0.2微升，模板DNA20纳克，加水至25微升。反应程序为DNA95℃预变性5min；95℃预变性30s，50℃退火30s，72℃延伸展30s，循环35次；最后72℃延伸10min。在biometre扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺胶（含100ml聚丙烯酰胺溶液中有7.6g丙烯酰胺和0.4g甲叉双丙烯酰胺）上进行电泳分离。

[0050] （二）结果与分析

[0051] 用SSR分子标记RM13441的上下游引物分别对水稻品种韭菜青和IR26的基因组DNA进行扩增，韭菜青基因组DNA能够扩增出87bp的扩增片段，标志着qGR2的韭菜青增效等位基因存在，而IR26的基因组DNA扩增出82bp，表明IR26的基因组不含qGR2的韭菜青增效等位基因。用SSR分子标记RM13443的上下游引物分别对水稻品种韭菜青和IR26的基因组DNA进行扩增，韭菜青基因组DNA能够扩增出182bp的扩增片段，标志着qGR2的韭菜青增效等位基因存在，而IR26的基因组DNA扩增出223bp，表明IR26的基因组不含qGR2的韭菜青增效等位基因。用SSR分子标记P8的上下游引物分别对水稻品种韭菜青和IR26的基因组DNA进行扩增，韭菜青基因组DNA能够扩增出252bp的扩增片段，标志着qGR2的韭菜青增效等位基因存在，而IR26的基因组DNA扩增出263bp，表明IR26的基因组不含qGR2的韭菜青增效等位基因（图3）。