一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用转让专利
申请号 : CN201310642325.5
文献号 : CN103642838B
文献日 : 2015-08-26
发明人 : 张俊河 , 王天云 , 董卫华 , 王芳 , 赵春澎 , 柴树洁 , 王小引 , 王俐 , 杨瑞 , 李琴
申请人 : 新乡医学院
摘要 :
本发明提供了一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用，所述表达载体的核苷酸序列如Seq ID No.1或Seq ID No.2所示，其是以pCAT3-control作为出发载体构建的一种表达载体，本发明的表达载体能够显著提高所携带目的基因的表达水平，同等条件下，比含MAR且不含EGFP的表达载体可显著提高目的基因的表达。
权利要求 :
1.一种人类及哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.1或Seq ID No.2所示；所述表达载体是以pCAT3-control为骨架载体，含有β-珠蛋白MAR序列及EGFP序列；在SV40启动子的上游插入β-珠蛋白MAR序列；在MAR序列与SV40启动子序列之间插入一段不同长度的EGFP序列片段，所插入的DNA片段大小分别为350、750bp。
2.权利要求1所述表达载体在高效表达外源基因中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将外源基因插入到所述表达载体的SV40启动子下游，然后将携带有所述外源基因的重组载体转化人类或哺乳动物细胞中，随宿主细胞高效表达。
说明书 :
一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用。
背景技术
[0002] 基因工程（gene engineering），也称重组DNA技术，是根据科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA，然后将重组DNA与载体重新组合，再将其引入到不含该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。按照目的基因的克隆和表达系统，分为原核生物基因工程、植物基因工程、动物基因工程和酵母基因工程。基因工程为工农业生产和医药卫生事业开辟了新的应用途径，也为遗传病的诊断和治疗提供了有效方法，具有广泛的应用价值。此外，基因工程还可应用于基因的结构、功能与作用机制的研究，有助于对生命起源和生物进化等重大问题的探讨。
[0003] 目前，随着转基因技术的广泛应用，转基因沉默(Transgene silencing)和基因表达水平低下已成为转基因动植物急需解决的关键问题。研究发现通过Southern blot、RT-PCR等证实转基因已整合到宿主的基因组中，且保留完整的拷贝，但是却不能稳定表达或表达水平低下，有时甚至完全被抑制。这种外源基因在宿主细胞中表达受到抑制的现象称之为转基因沉默。为了获得稳定表达的转基因株，研究人员在克服转基因沉默方面进行了许多有益的尝试，比如在构建表达载体时选用强启动子、使用增强子、在转基因操作时进行去甲基化处理等。而利用核基质结合区（matrix attachment region,MAR）来提高转基因表达是近年来发展起来的克服外源基因沉默的一种有效方法。
[0004] MAR序列，亦称核骨架结合区（scaffold attachment region,SAR）序列，是真核生物细胞内染色质上可与细胞核基质结合的一段特殊DNA序列，主要特征是富含AT碱基对，位于基因两侧的非编码区。作为真核生物的一种新的顺式作用元件，目前关于MAR能提高外源基因表达水平，降低转基因沉默的报道已有很多（Buceta M,GalbeteJL,Kostic C,et al.Use of human MAR elements to improve retroviral vector production[J].Gene Ther,2011,18(1):7-13.Ley D,Harraghy N,Le Fourn V,et al.MAR elements and transposons for improved transgene integration and expression[J].PLoS One,2013,8(4):e62784.Harraghy N,Regamey A,Girod PA,et al.Identification of a potent MAR element from the mouse genome and assessment of its activity in stable and transient transfections[J].J Biotechnol,2011,154(1):11-20.Harraghy N,Buceta M,Regamey A,et al.Using matrix attachment regions to improve recombinant protein production[J].Methods Mol Biol,2012,801:93-110）。然而，MAR在提高转基因表达水平方面仍不理想。因此，亟待开发出一种提高外源基因在人类及哺乳动物细胞表达水平的方法或产品。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种新型的人类及哺乳动物细胞表达载体及其应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明的一种人类及哺乳动物细胞表达载体，其核苷酸序列如Seq ID No.1或Seq ID No.2所示。
[0007] 所述表达载体是以pCAT3-control为骨架载体，含有β-珠蛋白MAR序列及EGFP序列。在SV40启动子的上游插入β-珠蛋白MAR序列；在MAR序列与SV40启动子序列之间插入一段不同长度的EGFP序列片段，所插入的DNA片段大小分别为350、750bp。
[0008] 所述β-珠蛋白MAR序列GenBank登录号为L22754.1；EGFP序列GenBank登录号为U55763.1。
[0009] 所述表达载体可按照基因工程领域的常规方法构建。
[0010] 本发明还提供所述人类及哺乳动物细胞表达载体在高效表达外源基因中的应用。即，将外源基因插入到所述表达载体的SV40启动子下游，然后将携带有所述外源基因的重组载体转化人类或哺乳动物细胞中，随宿主细胞高效表达。
[0011] 本发明提供的一种人类及哺乳动物细胞表达载体，其是以pCAT3-control作为出发载体构建的一种表达载体，本发明的表达载体能够显著提高所携带目的基因的表达水平，同等条件下，比含MAR且不含EGFP的表达载体可显著提高目的基因的表达。
附图说明
[0012] 图1是pCAT3-control载体的质粒图谱。
[0013] 图2是表达载体pCATG的质粒图谱。
[0014] 图3是表达载体pCAD的质粒图谱。
[0015] 图4A和图4B分别是表达载体pCAC1、pCAC2的质粒图谱。
[0016] 图5是表达载体pCAD-VEGF的质粒图谱。
[0017] 图6A和图6B分别是表达载体pCAC1-VEGF、pCAC2-VEGF的质粒图谱。
[0018] 图7是实施例3中各实验组及空白对照组的VEGF蛋白表达水平的比值柱形图；其中，1：转化MAR与转基因之间含有750bp的DNA片段的表达载体VEGF表达量；2：转化MAR与转基因之间含有350bp的DNA片段的表达载体VEGF表达量；3：转化含MAR序列的表达载体VEGF表达量；4：转化不含MAR序列表达载体VEGF表达量；5：未转化质粒的CHO细胞VEGF表达量。
[0019] 图8是实施例3中各实验组及对照组的Western Blot分析结果；其中，1：转化不含MAR序列表达载体；2：转化含MAR序列的表达载体；3：转化MAR与转基因之间含有350bp的DNA片段的表达载体；4：转化MAR与转基因之间含有750bp的DNA片段的表达载体。
具体实施方式
[0020] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0021] 以下实施例中使用的大肠杆菌（Escherichia coli）JM109、pCAT-3-control质粒载体、细胞系、质粒载体和试剂、工具酶均为市售商品。pCAT-3-control质粒载体购自Promega生物公司（图1）。
[0022] 实施例1 表达载体pCAD的构建
[0023] 1.1含neomycin真核抗性基因选择复合体的表达载体pCATG的构建[0024] 1.1.1PCR扩增neomycin真核抗性基因选择复合体
[0025] 根据neomycin真核抗性基因选择复合体序列（GenBank登录号为EF437957.1），设计引物P1和P2，引物的5′端分别引入Sal I酶切位点，引物序列如下(下划线为酶切位点)：P1：5′-GTCGTCGACCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGA-3′；P2：5′-AGCGTCGACCAGACATGATAAGATACATTGATGAGA-3′。以提取的pCDNA3.1质粒为模板，使用引物P1和P2扩增neomycin真核抗性基因选择复合体序列，采用常规PCR方法进行扩增。PCR体系见表1。
[0026] 表1 PCR反应体系
[0027]
[0028] PCR反应条件如下：95℃ 3min；94℃ 40s，60℃ 30s，72℃ 40s，30个循环；72℃3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank中公开的neomycin真核抗性基因选择复合体序列完全一致。
[0029] 1.1.2 构建含neomycin真核抗性基因选择复合体的表达载体pCATG[0030] 用SalⅠ单酶切PCR产物，采用常规的酶切方法，37℃ 3min。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收neomycin抗性基因片段（用于G418筛选）；同时用SalⅠ单酶切pCAT3-control载体，用碱性磷酸酶处理pCAT3-control线性质粒；酶切回收后的neomycin抗性基因片段及经碱性磷酸酶处理过的pCAT3-control按1：5（摩尔比）用T4连接酶进行连接，16℃连接过夜；然后将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，将200μl菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，对重组质粒进行酶切验证，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pCATG（质粒图谱如图2所示）。
[0031] 1.2 构建含β-珠蛋白MAR序列的pCAD表达载体
[0032] 1.2.1 PCR扩增目的片段
[0033] 根据β-珠蛋白MAR序列（GenBank登录号为L22754.1），设计如下引物：P3:5′-TTAGTAAGACATCACCTTGCATTT-3′；P4:5′-AGCCATAGTTTGAGTTACCCTTT-3′。以提取的人外周血基因组DNA为模板，PCR扩增得到人β-珠蛋白MAR。为了实现定向克隆，引物的5′端分别引入NheⅠ/KpnⅠ酶切位点（GTCGCTAGC;AGCGGTACC）。PCR体系同前，PCR条件如下：95℃ 3min；94℃ 40s，60-56℃ 30s，72℃ 40s，每个退火温度4个循环，最后55℃，30个循环；72℃ 3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与Genbank中公开的β-珠蛋白MAR序列完全一致。
[0034] 1.2.2 构建含β-珠蛋白MAR序列的pCAD载体
[0035] 用Nhe Ⅰ/KpnⅠ双酶切β-珠蛋白MAR序列的PCR扩增产物（经测序验证正确的序列），同时用Nhe Ⅰ/Kpn Ⅰ双酶切pCATG质粒，采用常规的酶切方法，37℃ 3h。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收MAR序列片段和pCATG线形质粒；酶切回收后的MAR片段及pCATG线性质粒DNA按1：5（摩尔比）进行连接，16℃连接过夜；然后将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，将200μl菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切（Nhe Ⅰ/Kpn Ⅰ）验证，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pCAD（质粒图谱如图3所示）。
[0036] 实施例2 表达载体pCAC1、pCAC2的构建
[0037] 1.2.1 PCR扩增大小不同的DNA片段
[0038] 参照pEGFP-C1载体的Enhanced green fluorescent protein(EGFP)基因片段序列（GenBank登录号为U55763.1）设计如下引物：P5:5′-CCGGCTAGCGCTACCGGTCGCCA-3′;P6:5′-CGCAGATCTCTGAGTGCGGACTTG-3′;P7:5′-AATAGATCTCGGCGCGGGTCTTGTA-3′。P5和P6用于扩增750bp的片段，P5和P7用于扩增350bp的片段，同时引入Bgl II/NheⅠ酶切位点，以提取的pEGFP-C1质粒为模板，PCR反应体系同前，PCR反应条件如下：95℃ 3min；
94℃ 40s，60-56℃ 30s，72℃ 40s，每个退火温度4个循环，最后55℃，30个循环；72℃
3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank中公开的EGFP序列完全一致。
94℃ 40s，60-56℃ 30s，72℃ 40s，每个退火温度4个循环，最后55℃，30个循环；72℃
3min。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank中公开的EGFP序列完全一致。
[0039] 1.2.2 构建含不同片段大小的pCAC1、pCAC2载体
[0040] 用Bgl II/Nhe Ⅰ双酶切两个大小不同的DNA片段PCR扩增产物（经测序验证正确的序列），同时用Bgl II/Nhe Ⅰ双酶切pCAD质粒，采用常规的酶切方法，37℃ 3h。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收两个大小不同的DNA片段和pCAD线形质粒；分别将酶切回收后的DNA片段及pCAD线性质粒DNA按1：5（摩尔比）进行连接，16℃连接过夜；然后将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，将200μl菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切（BglII/Nhe Ⅰ）验证，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，分别构建MAR与转基因不同距离的载体，载体分别命名为pCAC1和pCAC（2 质粒图谱如图4A和图4B所示，序列分别如Seq ID No.1和2所示）。
[0041] 实施例3 利用本发明的表达载体在中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞中表达VEGF基因
[0042] （1）构建含有血管内皮生长因子（VEGF）的pCAD-VEGF载体
[0043] 根据人的VEGF基因cDNA序列（GenBank登录号为AF022375.1）设计PCR引物P8和P9，为了实现定向克隆，在引物的5′端分别引入NcoI/XbaⅠ酶切位点,引物序列如下：P8：5′-GGCCCATGGATGAACTTTCTGCTGTCTTGGGTG-3′；P9：5′-GCGAAGCTTTCACCGCCTCGGCTTGTCACATCTG-3′。取胎儿心肌组织，Trizol法提取总RNA，用1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。在25μl反应体系中，分别加入RNA 1μg，dNTP 1μl（10mmol/L），浓度为
20μmol/L的P8和P9引物各1μl，AMV-Taq DNA聚合酶1μl（5U/μl）以及AMV反转录酶
1μl（5U/μl），按照One Step PCR Kit（AMV）操作说明进行RT-PCR反应：50℃ 30min，将mRNA反转录为cDNA；然后按如下参数：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank登录的VEGF基因cDNA序列完全一致。
20μmol/L的P8和P9引物各1μl，AMV-Taq DNA聚合酶1μl（5U/μl）以及AMV反转录酶
1μl（5U/μl），按照One Step PCR Kit（AMV）操作说明进行RT-PCR反应：50℃ 30min，将mRNA反转录为cDNA；然后按如下参数：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环。琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物，送生物公司测序验证。结果表明，扩增出的DNA片段与GenBank登录的VEGF基因cDNA序列完全一致。
[0044] 用NcoI/XbaⅠ双酶切VEGF基因的PCR扩增产物（经测序验证正确的序列），同时用NcoI/XbaⅠ双酶切pCAD载体，采用常规的酶切方法，37℃3h。琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收VEGF基因序列片段和pCAD线形质粒；酶切回收后的VEGF基因cDNA序列片段及pCAD线性质粒DNA按1：5（摩尔比）进行连接，16℃连接过夜；然后将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，用NcoI/XbaⅠ双酶切重组质粒载体，选取酶切验证正确的质粒进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pCAD-VEGF（质粒图谱如图5所示）。
[0045] （2）构建含VEGF和距离片段的pCAC1-VEGF、pCAC2-VEGF表达载体[0046] 用Bgl II/Nhe Ⅰ双酶切两个大小不同的DNA片段PCR扩增产物（经测序验证正确的序列），同时用Bgl II/Nhe Ⅰ双酶切pCAD-VEGF质粒，采用常规的酶切方法，37℃ 3h。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收两个大小不同的DNA片段和pCAD-VEGF线形质粒；分别将酶切回收后的DNA片段及pCAD-VEGF线性质粒DNA按1：5（摩尔比）进行连接，16℃连接过夜；然后将连接产物加入到E.coli JM109菌株感受态细胞悬液中，进行转化，将200μl菌液接种在含有氨苄青霉素LB平板上，37℃培养过夜，挑取单菌落继代培养，并进行重组质粒的双酶切（Bgl II/Nhe Ⅰ）验证，选取酶切验证正确的质粒，进行测序验证，分别构建VEGF与转基因不同距离的载体，载体分别命名为pCAC1-VEGF和pCAC2-VEGF（质粒图谱如图6A和图6B所示）。
[0047] （3）不同表达载体转染CHO细胞表达系统的建立
[0048] CHO细胞于37℃，5%CO2条件下，在含10%灭活胎牛血清的DMEM培养基中培养，以6
大约3×10/孔在6孔板内接种CHO细胞。根据实验设计转染共分为4组：不含MAR的对照载体（载体表达盒未含MAR序列的表达载体），含MAR的对照载体（载体表达含MAR的表达载体，pCAC1-VEGF载体（MAR与转基因之间含有750bp的DNA片段的表达载体）和pCAC2-VEGF载体（MAR与转基因之间含有350bp的DNA片段的表达载体）。转染方法按照梭华-sofast基因转染试剂盒说明书进行。转染24h后，用终浓度为700μg/mL的G418培养液加压筛选2周，每3d更换一次培养液，待稳定转化的细胞集落形成后，用0.25%胰酶消化，对每组转染细胞有限稀释并单克隆化，分至96孔培养板继续培养，大约培养7d后，转入培养瓶内继续培养，待细胞密度达80%-90%时，收集细胞以备检测。ELISA分析结果显示，与不含MAR的阴性对照载体pCATG相比，所有含MAR的表达载体均能不同程度提高VEGF基因的表达水平，pCAC1-VEGF载体最高可以提高12倍；与MAR直接连接表达盒的对照载体pCAD相比，pCAC1-VEGF载体（距离MAR序列750bp）能使VEGF基因表达水平平均提高5.8倍,pCAC2-VEGF载体（距离MAR序列350bp）能使VEGF基因表达水平平均提高3.4倍。不同表达载体转染的细胞VEGF含量差异有统计学意义（图7）。
大约3×10/孔在6孔板内接种CHO细胞。根据实验设计转染共分为4组：不含MAR的对照载体（载体表达盒未含MAR序列的表达载体），含MAR的对照载体（载体表达含MAR的表达载体，pCAC1-VEGF载体（MAR与转基因之间含有750bp的DNA片段的表达载体）和pCAC2-VEGF载体（MAR与转基因之间含有350bp的DNA片段的表达载体）。转染方法按照梭华-sofast基因转染试剂盒说明书进行。转染24h后，用终浓度为700μg/mL的G418培养液加压筛选2周，每3d更换一次培养液，待稳定转化的细胞集落形成后，用0.25%胰酶消化，对每组转染细胞有限稀释并单克隆化，分至96孔培养板继续培养，大约培养7d后，转入培养瓶内继续培养，待细胞密度达80%-90%时，收集细胞以备检测。ELISA分析结果显示，与不含MAR的阴性对照载体pCATG相比，所有含MAR的表达载体均能不同程度提高VEGF基因的表达水平，pCAC1-VEGF载体最高可以提高12倍；与MAR直接连接表达盒的对照载体pCAD相比，pCAC1-VEGF载体（距离MAR序列750bp）能使VEGF基因表达水平平均提高5.8倍,pCAC2-VEGF载体（距离MAR序列350bp）能使VEGF基因表达水平平均提高3.4倍。不同表达载体转染的细胞VEGF含量差异有统计学意义（图7）。
[0049] 转染的各组细胞用细胞裂解液充分裂解，4℃条件下12000r/min离心5min，收集上清液定量，取100μg蛋白上样，在120g/L的SDS-PAGE上电泳，蛋白充分分离后，转移到PVDF膜上，于含50g/L脱脂奶粉的封闭液中4℃过夜。VEGF一抗1：300稀释，室温孵育2h，二抗1：2000稀释，室温孵育1h，ECL发光试剂对PVDF膜进行显色反应，X线下曝光、拍照。采用Western Blot分析VEGF蛋白的表达水平（图8）。
[0050] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0051] 参考文献
[0052] Buceta M,Galbete JL,Kostic C,et al.Use of human MAR elements to improve retroviral vector production[J].Gene Ther,2011,18(1):7-13.[PMID:20811469][0053] Ley D,Harraghy N,Le Fourn V,et al.MAR elements and transposons for improved transgene integration and expression[J].PLoS One,2013,8(4):e62784.[PMID:23646143]
[0054] Harraghy N,Regamey A,Girod PA,et al.Identification of a potent MAR element from the mouse genome and assessment of its activity in stable and transient transfections[J].J Biotechnol,2011,154(1):11-20.[PMID:21540066][0055] Harraghy N,Buceta M,Regamey A,et al.Using matrix attachment regions to improve recombinant protein production[J].Methods Mol Biol,2012,801:93-110.[PMID:21987249]