基于变性沉淀的样本处理液及其应用、核酸释放方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于变性沉淀的样本处理液及其应用和核酸释放方法。本发明的样本处理液包括下述质量百分数的组分：1-15%的PEG400、0.1-2%的表面活性剂、1-20%的固相树脂chelex-100和3-20%的PCR增强剂，10-40mmol/L的氢氧化钾和100-400mmol/L的KCL，所述样本处理液的溶剂为无菌水。本发明样本处理液基于变性沉淀对PCR扩增的抑制物质进行清除处理，处理产物能进行直接扩增，保证扩增的稳定性；基于本原理的处理产物对扩增无选择性，适用于taq酶类、化学修饰及抗体修饰的热启动酶等，尤其适应于对长片段及结构复杂的基因片段进行扩增。

权利要求

1.一种基于变性沉淀的样本处理液，其特征在于，包括下述质量百分数的组分：6％的PEG400、1.2％的Teween-20、5％的甘油、200mmol/L的KCL和8％的固相树脂chelex-100，所述样本处理液还包括：30mmol/L的KOH，所述样本处理液溶剂为无菌水，所述样本为血液。

2.一种核酸释放方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：配制如权利要求1所述的样本处理液，并使样本处理液的颗粒悬浮均匀；

步骤2：将样本加入到步骤1所得的样本处理液中，涡旋混匀，56℃温浴10min，得处理产物；所述样本为血液；所述样本和样本处理液的体积比为1：1.5-7.5。

3.根据权利要求2所述的核酸释放方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：配制如权利要求1所述的样本处理液，用移液器吹打使样本处理液的颗粒悬浮均匀；

步骤2：将20μL地中海贫血的血液样本加入到100μL步骤1所得的样本处理液中，涡旋混匀，56℃温浴10min，得处理产物。

4.如权利要求1所述的基于变性沉淀的样本处理液在样本核酸释放过程的应用。

说明书

基于变性沉淀的样本处理液及其应用、核酸释放方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于变性沉淀的样本处理液及其应用、核酸释放方法。

背景技术

[0002] 随着临床基因诊断的深入，基因诊断已广泛应用于产前诊断、新生儿筛查以及遗传代谢疾病的检测。

[0003] 在临床、病理等领域中，以基因诊断为目的分子检测广泛使用PCR法。一般来说，PCR法是通过对DNA双链的解离链的一条链为模板、相对DNA链的特定区域的引物结合、由DNA聚合酶进行重复的DNA合成反应而使目的DNA片段指数级扩增的核酸扩增方法。此外，除了PCR扩增方法外，还有RT-PCR、NASBA、LAMP、3SR等核酸扩增方法。

[0004] 基于上述核酸扩增方法中的生物样本，容易受到血红蛋白、血红素、免疫球蛋白IgD等抑制物质的干扰，这些抑制物质通常抑制PCR反应的扩增，所以通常用核酸扩增法检测时，需要对生物样本进行处理，分离纯化DNA或RNA等核酸物质再进行扩增，目前，用以分离纯化基因组DNA的方法很多，大多数方法都要经过白细胞分离、裂解细胞、抽取核酸及纯化核酸等，才能得到高质量的DNA；但也有些方法只需裂解细胞、无需抽取、纯化核酸，就可直接用于PCR扩增、基因测序等。现对分离基因组DNA的一些常见方法比较如下：经典的有机溶剂提取法、非有机溶剂提取法、固相载体法和DNA提取试剂盒法。

[0005] 以上方法能清除上述抑制物质对扩增的影响，但对生物样本进行处理的方法比较复杂费时；目前也有采用直接裂解的方法进行扩增，常规的实验室及临床用于细胞裂解的方法主要有：（1）基于机械作用的微波法、煮沸法、稀释法、超声法、冻融法，（2）基于化学作用的PH值变性法、表面活性剂法（SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40、CTAB、sarcosyl、Chelex-100）、强离子法（异硫氰酸胍、盐酸胍、碘化钠），（3）基于酶解作用的溶菌酶法、蛋白酶K消化法等。

[0006] 现对常规的裂解方法比较如下：

[0007] (1)机械作用：包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。这些方法用机械力使细胞破碎，但机械力也可引起核酸链的断裂，因而不适用于高分子量长链核酸的分离。有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从500bp-20kb之间，而颗粒匀浆法提取的核酸一般小于10kb。

[0008] (2)化学作用：在一定的pH环境和变性条件下，细胞破裂，蛋白质变性沉淀，核酸被释放到水相。或者通过加热、加入表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween20、NP-40、CTAB、sarcosyl、Chelex-100等)或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍)而获得。而pH环境则由加入的强碱(NaOH)或缓冲液(TE、STE等)提供。在一定的pH环境下，表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋白质和多糖沉淀，缓冲液中的一些金属离子螯合剂(EDTA等)可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子Mg2+、Ca2+，从而抑制核酸酶的活性，保护核酸不被降解。

[0009] (3)酶作用：主要是通过加入溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)以使细胞破裂，核酸释放。蛋白酶还能降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。其中溶菌酶能催化细菌细胞壁的蛋白多糖N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸残基间的β-(1，4)键水解。蛋白酶K能催化水解多种多肽键，其在65℃及有EDTA、尿素(1-4mol/L)和去污剂(0.5%SDS或1%TritonX-100)存在时仍保留酶活性，这有利于提高对高分子量核酸的提取效率。

[0010] 在实际工作中，采用上述方法裂解的样本不适用于长片段的扩增，因其抑制物质没有有效的清除。公开号为101712954A的中国发明专利提到一种核酸快速释放试剂及方法，以及申请号为200910157536.3的中国发明专利公开了细胞核酸释放剂，申请号为200310116699.X的中国发明专利公开了微量核酸释放剂。以及非专利文章Evaluation of an Alkaline Lysis Method for the Extraction of DNA from Whole Blood and Forensic Stains for STR Analysis；均提到对核酸进行快速扩增的试剂及方法，基于上述的扩增方法一般均只适用于<500bp以下的片段进行扩增，对>1kb以上的片段扩增效果较差，甚至无扩增。

[0011] 公开号为101712954A的中国发明公开了一种核酸快速释放试剂及方法，是一种基于生物活性肽的表面活性剂，在高盐的情况下裂解细胞，释放核酸，但试剂本身没有对生物样本的抑制物质进行处理，对血液样本中含有的PCR抑制物质采用该方法进行处理后不能有效的进行扩增，因此基于此方法发明的核酸释放剂对核酸的释放及后续的扩增，不能直接进行，需配合其自身的扩增聚合酶，价格昂贵，不便于推广应用。

[0012] 申请号为201210319905.6的中国发明专利公开了一种核酸释放试剂及释放方法，该方法借助蛋白酶K及碱变性对细胞进行裂解，释放核酸DNA，释放后的DNA需要对蛋白酶K进行消化灭活，操作比较繁琐，至少需要两部法才能进行，且只用于血清、血浆等的扩增，不适用于血液的直接扩增。

[0013] 非专利文章Evaluation of an Alkaline Lysis Method for the Extraction of DNA from Whole Blood and Forensic Stains for STR Analysis采用碱变性法对生物样本处理后进行直接扩增，一般只适用于STR分析，不适应于长片段的扩增。

[0014] 另外还有文章采用改变PH值、外加血样抑制物的结合剂BSA，来提高Taq酶的扩增效率，对生物试样进行直接扩增，但这些方法均不能从根本解决生物试样对扩增的抑制作用。

发明内容

[0015] 本发明解决了核酸扩增样本中样本制备回收效率低、操作复杂和成本高等问题，提供一种无需离心、无需蛋白酶K消化的，适用于对长片段及多重PCR，扩增效率高且稳定的基于变性沉淀的样本处理液及核酸释放方法。

[0016] 本发明的一个技术方案为提供一种基于变性沉淀的样本处理液，包括下述质量百分数的组分：1-15%的PEG400、0.1-2%的表面活性剂、1-20%的固相树脂chelex-100和3-20%的PCR增强剂，所述样本处理液还包括：10-40mmol/L的氢氧化钾和100-400mmol/L的KCL，所述样本处理液溶剂为无菌水。

[0017] 优选的，上述的样本处理液包括下述质量百分数的组分：3-10%的PEG400、0.5-1.2%的表面活性剂、5-15%的固相树脂chelex-100和质量百分数为5-8%的PCR增强剂，所述样本处理液还包括：20-30mmol/L的氢氧化钾和150-300mmol/L的KCL，所述样本处理液溶剂为无菌水。

[0018] 优选的，上述的样本处理液中，所述PCR增强剂为甘油或DMSO，而甜菜碱、BSA、甲酰胺类等扩增增强剂基于降低熔解温度，对多重扩增的稳定性影响较大，尤其对GC含量及结构复杂的样本扩增的均一性影响较大。所述表面活性剂最佳为Teween-20或TritonX-100，SDS及离子型表面活性剂在本方案中效果不佳。

[0019] 优选的，上述的样本处理液包括下述质量百分数的组分：6%的PEG400、1.2%的Teween-20、5%的甘油和8%的固相树脂chelex-100，所述样本处理液还包括：30mmol/L的KOH，所述样本处理液溶剂为无菌水。

[0020] 本发明的另一技术方案为提供一种核酸释放方法，包括如下步骤：

[0021] 步骤1：配制如权利要求1所述的样本处理液，并使颗粒悬浮均匀；

[0022] 步骤2：将样本加入到样本处理液中，涡旋混匀，56℃温浴10min，得处理产物。

[0023] 优选的，上述的核酸释放方法中，所述样本为血液、血清、血浆、干血点、组织、口腔细胞、法医样本或环境样本。

[0024] 优选的，上述的核酸释放方法中，所述步骤2中样本和样本处理液的体积比为1：1.5-7.5。

[0025] 优选的，上述的核酸释放方法包括：步骤1：配制如权利要求4所述的样本处理液；

[0026] 步骤2：将20μL地中海贫血的血液样本加入到100μL的样本处理液中，涡旋混匀，56℃温浴10min，得处理产物。

[0027] 本发明的又一技术方案为提供一种上述样本处理液在样本核酸释放过程的应用。

[0028] 本发明有益效果：本发明样本处理液基于变性沉淀对PCR扩增的抑制物质进行清除处理，处理产物加入至PCR反应液后，PEG400终浓度的改变导致溶液酸碱性的改变，加入PCR反应体系后PCR体系的pH环境无明显变化，这样处理的产物可以直接用于扩增检测，保证扩增的稳定性；基于本原理的处理产物对扩增无选择性，适用于taq酶类、化学修饰及抗体修饰的热启动酶等，尤其适应于对长片段及结构复杂的基因片段进行扩增。

[0029] 本发明样本处理液能稳定的对高GC、长片段核酸及结构复杂的样本进行扩增，同时能应用于血清、血浆、干血点、组织、口腔细胞、法医样本及环境样本等不同来源的生物样本，大大的提高临床的检测效率及减少操作的污染源。

[0030] 与目前已有的核酸提取方法相比，本发明无需离心、无需蛋白酶K消化，无需样本间的转移，几乎接近自动化，避免人工操作引起的误差及污染，可广泛应用于临床基因的诊断检测、新生儿的筛查检测、突变体的检测及病原微生物的检测等，样本处理液处理血液样本后的扩增效率与市面试剂盒提取DNA扩增效率相当。

附图说明

[0031] 图1为α-地中海贫血基因检测试剂盒扩增结果，其中1：QIANGEN Qiamp DNA Blood mini Kit提取DNA扩增结果；2：本发明样本处理液处理产物扩增结果；

[0032] 图2为β-地中海贫血检测试剂盒扩增结果，其中1：QIANGEN Qiamp DNA Blood mini Kit提取DNA扩增结果；2：本发明样本处理液处理产物扩增结果。

具体实施方式

[0033] 为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图详予说明。

[0034] 实施例1本发明技术原理

[0035] 聚乙二醇可诱导水溶液中大分子的聚集，在聚乙二醇的作用下，能增加溶液的亲水性，提升溶液OH-离子浓度，提供的强碱性环境有助于细胞的快速裂解并对核蛋白结构破坏，而当其加入PCR反应液中，其pH值会降低至正常水平，不会对扩增产生抑制。

[0036] 高盐液有利于细胞中核蛋白的沉淀，固相螯合树脂能整合多价金属离子，尤其是选择性整合二价离子，比普通离子交换剂具有更高的金属离子选择性和较强的结合力，能结合许多可能影响一步分析的其他外源物质（如二价铁离子），通过离心去除固相颗粒树脂及杂质，达到分离外源物质的目的。

[0037] 聚乙二醇的羟值对溶液的pH影响较大，通过比较研究PEG200—PEG20000对溶液酸碱性的改变，如表1所示。聚乙二醇PEG200一般是基于溶液酸碱性的改变增加对细胞的裂解强度，通常需要高浓度的PEG200，体积比在60％以上，能实现对溶液pH环境的改变，但对PcR扩增抑制物不能有效的清除，导致扩增的稳定性较差；而大分子的聚乙二醇系列对DNA片段的吸附作用较强，其羟值较低，对溶液的酸碱性改变不大，主要是通过引起DNA分子的聚集来增强扩增的效率，对粗样本的裂解能力较弱；本发明优选的聚乙二醇为PEG400，较大的羟基值能对溶液的pH环境改变较大，增加对细胞的裂解强度，其强粘度对大分子抑制物的吸附作用较强，能对PCR扩增的抑制物进行有效的清除。

[0038] 表1

[0039]品名(规格) 外观 熔点 PH值 平均分子量 粘度 羟值
PEG-200 无色透明 -50±2 6.0-8.0 190-210 22-23 534-590
PEG-400 无色透明 5±2 6.0-8.0 380-420 37-45 268-294
PEG-600 无色透明 20±2 6.0-8.0 570-630 1.9-2.1 178-196
PEG-800 白色膏体 28±2 6.0-8.0 760-840 2.2-2.4 133-147
PEG-1000 白色蜡状 37±2 6.0-8.0 950-1050 2.4-3.0 107-118
PEG-2000 白色固体 51±2 6.0-8.0 1800-2200 5.0-6.7 51-62
PEG-4000 白色固体 55±2 6.0-8.0 3600-4400 8.0-11 25-32
PEG-6000 白色固体 57±2 6.0-8.0 5500-7500 12-16 15-20
PEG-8000 白色固体 60±2 6.0-8.0 7500-8500 16-18 12-15
PEG-10000 白色固体 61±2 6.0-8.0 8600-10500 19-21 8-11
PEG-20000 白色固体 62±2 6.0-8.0 18500-2200 30-35 ---

[0040] 本发明基于变性沉淀原理，对生物样本在核酸扩增时存在的抑制物血红素、血红蛋白、IgD等抑制物质进行结合，并通过离心沉淀吸附在固相树脂表面，选择性的结合除去扩增的抑制物，而释放的核酸则在上清中，取上清进行核酸的扩增。本发明样本处理液是利用PEG400(聚乙二醇)和KOH共同作用下，直接裂解细胞，并进一步的破坏核蛋白结构，在高盐离子情况下，选择性沉淀蛋白，吸附在固相介质表面；核酸则释放在上清溶液中，取上清进行直接扩增；形成的强碱性环境能抑制样本中的生物酶，避免了传统方法所出现的样本降解、化学修饰、与蛋白质发生分子交联等不利情况。

[0041] 处理产物加入至PCR反应液中，PEG400终浓度的改变导致溶液酸碱性的改变，加入PCR反应体系后PCR体系的pH环境无明显变化，这样处理的产物可以直接用于扩增检测，广泛适用于市面上普通的Taq酶、hot-star Taq的扩增等，通过外加甘油等PCR增效剂，维持扩增的效率及稳定性。

[0042] 实施例2

[0043] 本发明的样本处理液是由（占样本处理液的质量百分数）1-15%PEG400、10-40mmol/L氢氧化钾（KOH）、0.1-2%表面活性剂(Teween-20、TritonX-100）、1-20%固相树脂chelex-100、3-20%PCR增强剂（甘油、DMSO）及100-400mmol/L的KCL组成。

[0044] 配置方法：以无菌水，加入1-15%PEG400与10-40mmol/L氢氧化钾（KOH），加入0.1-2%表面活性剂(Teween-20、TritonX-100）及100-400mmol/L的KCL，然后加入3-20%PCR增效剂（甘油、DMSO），最后加入1-20%固相树脂chelex-100混匀即得到样本处理液，

[0045] 配置的样本处理液与血液样本按一定的比例加入混匀，优选的血样加入比例为20μL的血样加入到20-500μL的裂解液中，涡旋混匀，更优选的为20μL的血样加入到
50-150μL的裂解液中，涡旋混匀后按10%的比例加入PCR反应液体中进行后续的扩增。

[0046] 本发明优化得到的样本处理液比例为（占样本处理液的质量百分数）：3-10%的PEG400、20-30mmol/LKOH、0.5-1.2%表面活性剂、5-15%的固相树脂chelex-100、5-8%的PCR增效剂及150-300mmol/LKCL组成。

[0047] 实施例3

[0048] 本发明一个优选的样本处理液有以下组分组成（占样本处理液的质量百分数）：3%的PEG400、0.5-1.2%表面活性剂、5-15%的固相树脂chelex-100、5-8%的PCR增效剂，
150-300mmol/LKCL和20mmol/LKOH。所述样本处理液溶剂为无菌水。

[0049] 本发明上述样本处理液的使用：

[0050] 1、取出样本处理液（该试剂为悬浊液，使用前要充分摇匀，使颗粒悬浮）,向1.5mL离心管中加入300μL样本处理液，吸取样本处理液的过程中应不时的用移液器吹打，使颗粒悬浮均匀。

[0051] 2、将20.0ul的抗凝血加入样本处理液中，涡旋震荡25sec，短暂离心避免管内壁的液滴残留。

[0052] 3、放入56℃温浴10min，处理的样本室温（15-25℃)保存或2-8℃保存。

[0053] 4、取1-2μL处理产物加入25μLPCR反应体系中进行扩增。

[0054] 上述样本处理液的使用局限性：作为样本快速处理扩增试剂，不能直接用于核酸的提取。

[0055] 上述样本处理液的产品性能指标：

[0056] 1、溶液酸碱性：通过PH计测定，溶液的PH值为12.5±0.2。

[0057] 2、细胞裂解率：通过显微镜进行细胞计数，90%以上的细胞均被裂解，对细胞的裂解能力强。

[0058] 3、稳定性：通过对三批试剂进行实时稳定性实验，结果显示产品在常温（15-25℃）保存15个月质量合格，确定其效期为12个月；

[0059] 通过开瓶稳定性研究，结果显示每次常温开瓶2min中，每天开瓶1次，开瓶30次对结果无影响。

[0060] 实施例4

[0061] 用于地中海贫血样本的PCR扩增检测

[0062] 1、样本处理液的配置（占样本处理液的质量百分数）：6%的PEG400溶于水溶液中，加入30mM的KOH、1.2%的Teween-20、5%的甘油、200mM KCl，混匀然后加入8%的固相树脂chelex-100。

[0063] 2、核酸的释放：20μL血液加入到100μL的样本处理液中，涡旋混匀，入56℃温浴10min。

[0064] 3、处理产物的扩增：采用2.0μL处理产物作为模板进行α-地中海贫血、β-地中海贫血扩增检测，α-地中海贫血基因检测试剂盒、β-地中海贫血检测试剂盒均为亚能生物技术（深圳）有限公司产品(粤药食监械生产许20020515号)，与此采用德国QIANGEN Qiamp DNA Blood mini Kit提取试剂盒提取的样本DNA进行直接扩增，检测扩增效果；具体操作按试剂盒说明书进行。

[0065] 3、扩增产物的检测：跑1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，

[0066] 结果见图1、2所示。图1为α-地中海贫血基因检测试剂盒扩增结果，其中1：Qiamp DNA Blood Mini Kit（德国QIAGEN）提取DNA扩增结果；2：本发明样本处理液处理产物扩增结果；图2为β-地中海贫血检测试剂盒扩增结果，其中1：Qiamp DNA Blood Mini Kit（德国QIAGEN）提取DNA扩增结果；2：本发明样本处理液处理产物扩增结果。

[0067] 实施例5

[0068] 用于人乳头瘤病毒HPV基因分型检测试剂盒的扩增检测

[0069] 1、样本处理液的配置（占样本处理液的质量百分数）：10%的PEG400溶于水溶液中，加入30mM的KOH、1.2%的Teween-20、8%的甘油、150mM KCl，混匀然后加入15%的固相树脂chelex-100。

[0070] 2、样本准备：充分洗脱宫颈刷上的样本，并在管壁上挤干后，丢弃宫颈刷，把全部洗脱液专业至1.5ml离心管中，丢弃上清，保留管底的细胞块。

[0071] 3、核酸的释放：将20μL血液样本处理液加入到上述管中，涡旋混匀，入56℃温浴10min。

[0072] 4、处理产物的扩增：采用2.0μL处理产物作为模板进行扩增检测，人乳头瘤病毒HPV基因分型采用亚能生物技术的人乳头瘤病毒HPV基因分型检测试剂盒。

[0073] 5、杂交检测扩增产物，结果显示，杂交信号、杂交特异性及均一性与常规病毒提取方法显示一致。

[0074] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。