一种同时测定泊马度胺及其有关物质的方法

摘要

本发明公开了一种同时测定泊马度胺及其有关物质的方法，该方法采用高效液相色谱法对泊马度胺及其有关物质进行分离；其中应用十八烷基硅胶键合色谱柱，流动相为甲醇：醋酸水溶液。所述高效液相色谱法中流速为0.5～1.2ml/min。所述高效液相色谱法中检测波长为226nm。该方法简单，方便，实用，能快速达到同时测定分离泊马度胺有关物质的目的，并能应用于液质联用（LC-MS）确定未知杂质的分子量，为推断未知杂质的结构提供可靠依据，便于泊马度胺原料及制剂的质量控制。

权利要求

1.一种测定泊马度胺的方法，包括以下步骤：

(1)制备系统适用性溶液；

(2)制备泊马度胺供试品溶液；

(3)按以下高效液相色谱条件进行测定：a.色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以pH值为2.6～3.0的醋酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，柱温为20～

35℃，流速为0.5～1.2ml/min，检测波长为226nm；

所述梯度洗脱条件为：

b.精密吸取供试品溶液，注入液相色谱仪，测定泊马度胺。

2.如权利要求1所述的测定泊马度胺的方法，其特征在于：所述步骤(1)制备系统适用性溶液：取泊马度胺和副产物5-氨基-2-(2,6-二氧代-哌啶-3-基)-异二氢吲哚-1,3-二酮工作对照品，精密称定，加乙腈适量使溶解，再加流动相A：pH值为2.6～3.0的醋酸制成每1ml含泊马度胺、副产物都为0.01mg的溶液，所述乙腈和流动相A醋酸的最终体积比为20：80。

3.如权利要求1所述的测定泊马度胺的方法，其特征在于：所述步骤(2)制备泊马度胺供试品溶液：取泊马度胺，精密称定，加乙腈适量使溶解，加流动相A：pH值为2.6～3.0的醋酸制成每1ml含泊马度胺为0.125mg的溶液，所述乙腈和流动相A醋酸的最终体积比为20：80。

4.如权利要求1～3任一所述的测定泊马度胺的方法，其特征在于：步骤(3)所述醋酸溶液的pH为2.6。

5.如权利要求1～3任一所述的测定泊马度胺的方法，其特征在于：所述a.色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，150×4.0mm，5μm，以醋酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，柱温为30℃，流速为1ml/min，检测波长为226nm。

说明书

一种同时测定泊马度胺及其有关物质的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种分离、测定泊马度胺及其有关物质的方法，尤其是涉及一种同时测定泊马度胺、合成起始原料、中间体、副产物、降解物和其他未知杂质的方法。

背景技术

[0002] 泊马度胺化学名称为4-氨基-2-（2,6-二氧代-哌啶-3-基）-异二氢吲哚-1,3-二酮，是一种沙利度胺类似物，是一种有抗肿瘤活性的免疫调节剂。在体外细胞学试验中，可抑制造血肿瘤细胞增殖和诱导凋亡。此外，泊马度胺能抑制来那度胺耐药多发性骨髓瘤细胞株的增殖和在来那度胺-敏感和来那度胺-耐药细胞株与地塞米松协同诱导肿瘤细胞凋亡。泊马度胺增强T细胞-和天然杀伤(NK)细胞介导的免疫和抑制单核细胞促炎性细胞因子的生成(如，TNF-α和IL-6)。在小鼠肿瘤模型和和体外脐带模型中泊马度胺显示抗血管生成活性，目前该药已在临床使用。

[0003] 结构式为：

[0004]

[0005] 本品合成工艺中以3-硝基邻苯二甲酸和3-氨基-2,6,-哌啶二酮作为原料，中间体为3-氨基邻苯二甲酸，工艺过程中可能产生4位硝基或5位氨基的副产物，以及未知的杂质。采用目前检测有关物质常用的高效液相方法检测这些杂质难度较大，在现有已知方法中难以在同一方法中完全分离以上已知杂质，以至本品的质量控制存在一定难度，为安全用药带来相对较大的隐患。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种同时测定泊马度胺及其有关物质的方法。经反复优化，用高效液相色谱方法，达到同时分离目的，并能适用于质谱检测的高效液相方法的流动相，方便通过质谱分析确定已知和未知有关物质的结构。

[0007] 本发明的技术方案为：

[0008] 一种同时测定泊马度胺及其有关物质的方法，包括以下步骤：

[0009] （1）制备系统适用性溶液：

[0010] 取泊马度胺和副产物5-氨基-2-（2,6-二氧代-哌啶-3-基）-异二氢吲哚-1,3-二酮工作对照品，精密称定，加乙腈适量使溶解，再加流动相A：pH值为2.6～3.0的醋酸制成每1ml含泊马度胺、副产物都为0.01mg的溶液，所述乙腈和流动相A醋酸的最终体积比为20：80；

[0011] （2）制备泊马度胺供试品溶液：

[0012] 取泊马度胺，精密称定，加乙腈适量使溶解，加流动相A：pH值为2.6～3.0的醋酸制成每1ml含泊马度胺为0.125mg的溶液，所述乙腈和流动相A醋酸的最终体积比为20：80；

[0013] （3）按以下高效液相色谱条件进行有关物质测定：

[0014] a.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以pH值为2.6～3.0的醋酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，柱温为20～35℃，流速为0.5～1.2ml/min，检测波长为226nm；

[0015] 所述梯度洗脱条件为：

[0016]

[0017] b.分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液，注入液相色谱仪，测定泊马度胺及其有关物质。

[0018] 优选的，步骤3所述醋酸溶液的pH为2.6。

[0019] 优选的，所述a.以十八烷基硅烷键合硅胶为150×4.0mm，5μm填充剂，以醋酸溶液为流动相A，以甲为流动相B，梯度洗脱，柱温为30℃，流速为1ml/min，检测波长为226nm。

[0020] 本发明的优点是通过建立、优化的高效液相色谱法，同时测定泊马度胺、合成起始原料、中间体、副产物、降解物和其他未知杂质及其有关物质，提供了一种稳定性、重复性好的测定方法，能应用于液质联用（LC-MS）确定未知杂质的分子量，为推断未知杂质的结构提供可靠依据，为泊马度胺原料及制剂的质量控制提供可靠依据，可便于该新药质控。

[0021] 按以上分析方法，能有效的将泊马度胺及其有关物质分离，分离度均远远满足色谱分离的要求，且流动相中不含盐，对质谱检测无干扰，可用于质谱研究，确定各杂质峰的分子量，为推断未知杂质供可靠的依据。

[0022] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出各种替换和变更，均包括在本发明的范围内。

附图说明

[0023] 图1为在泊马度胺添加相关杂质色谱分离图（实施例7）。

[0024] 图中已知原料、中间体或副产物的色谱峰保留时间见下表：

[0025]

具体实施方式

[0026] 以下实施例中所用仪器和试剂，除特殊说明以外均为普通市售。

[0027] 仪器：Agilent1260series高效液相色谱仪，色谱级乙腈、甲醇（Merck公司），冰醋酸（分析纯）。

[0028] 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C185μm4.6×150mm

[0029] 试剂：原料1：3-氨基-2,6,-哌啶二酮（市场采购）、中间体：3-氨基邻苯二甲酸（市场采购）、原料2：3-硝基邻苯二甲酸（市场采购）、副产物1：4–硝基-2-（2,6-二氧代-哌啶-3-基）-异二氢吲哚-1,3-二酮（自制）、副产物2：5-氨基-2-（2,6-二氧代-哌啶-3-基）-异二氢吲哚-1,3-二酮（自制）、泊马度胺原料（深圳海王药业有限公司提供，批号20130401、20130402、20130403）。

[0030] 实施例1系统适用性溶液的制备

[0031] 取泊马度胺与副产物2：5-氨基-2-（2,6-二氧代-哌啶-3-基）-异二氢吲哚-1,3-二酮；适量，用乙腈适量使溶解，加流动相A pH值为2.6～3.0的醋酸稀释至含泊马度胺与副产物2都为10μg/ml的溶液。乙腈和流动相A pH值为2.6～3.0醋酸的最终体积比为20：80。副产物2是最接近泊马度胺的副产物，与副产物2分离了，其他的杂质即可分离。

[0032] 实施例2色谱条件与系统适用性的筛选

[0033] 2.1流动相的选择

[0034] 根据质谱检测器测定相关要求，先后选用不同流动相条件下的分离效果如下（见表1）；醋酸溶液为水中加醋酸调节pH。

[0035] 表1.流动相选择结果

[0036]流动相 分离效果
甲醇-醋酸溶液（pH2.2）（30：70） 分离度为4.3
甲醇-醋酸溶液（pH2.6）（30：70） 分离度为8.5
甲醇-醋酸溶液（pH3.0）（30：70） 分离度为6.1
甲醇-醋酸溶液（pH2.6）（梯度1） 分离度为11.2
甲醇-醋酸溶液（pH2.6）（梯度2） 分离度为9.2

[0037] 根据不同流动相所测得的系统适用性溶液中泊马度胺峰和副产物2峰的分离度结果（见表1），表明梯度洗脱比等度洗脱的分离效果好，采用本法（表4所示）的梯度洗脱程序所获得的分离度增大较明显。

[0038] 2.2色谱柱的选择

[0039] 试用不同品牌、不同型号的色谱柱，最后确定采用Agilent ZORBAXSB-C18（150×4.6mm，5μm），色谱柱选择结果见表2。

[0040] 表2.色谱柱选择结果

[0041]

[0042] 采用表4所示的梯度洗脱程序，在不同品牌C18色谱柱上进行比较试验，结果表明（见表2），使用Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm）时，泊马度胺主峰的柱效较高，系统适用性溶液中两成分的分离度较好。

[0043] 最后确定以醋酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，醋酸溶液的最佳pH值为2.6左右，照下表4进行梯度洗脱。

[0044] 2.3柱温的选择

[0045] 选择柱温为25℃、30℃和35℃进行考察，最后确定柱温为30℃，柱温选择结果见表3。

[0046] 表3.柱温选择结果

[0047]

[0048] 采用表4所示的梯度洗脱程序，使用Agilent ZORBAX SB-C18（150×4.6mm，5μm）色谱柱，在不同柱温下进行试验，结果表明（见表3）,在柱温为30℃时,分离度较好，主峰柱效较高。

[0049] 色谱条件的确定：经上述选择试验，确定的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶（150×4.0mm，5μm）为填充剂，以醋酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，柱温为30℃，流速为1ml/min，检测波长为226nm；所述的梯度洗脱条件见表4。

[0050] 2.4系统适用性试验：

[0051] 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶（Agilent ZORBAXSB-C18150×4.6mm，5μm）为填充剂，以醋酸溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，柱温为30℃，流速为1ml/min，检测波长为226nm，照下表4进行梯度1洗脱。

[0052] 表4.梯度1流动相洗脱程序

[0053]

[0054] 实施例3检测限溶液的制备

[0055] 检测限溶液：精密量取供试品溶液0.11ml，置100ml量瓶中，加流动相A-流动相B（80：20（v/v））稀释至刻度，摇匀，即得。

[0056] 系统适用性溶液：取泊马度胺与副产物2适量，用乙腈适量使溶解，加流动相B稀释至含泊马度胺与副产物2分别为10μg/ml的溶液。

[0057] 实施例4检测限试验

[0058] 精密吸取实施例3所述的检测限溶液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算主峰信噪比（S/N），3<（S/N）<5，表明本法测定泊马度胺的检测限浓度约为0.12μg/ml。

[0059] 实施例5专属性溶液的制备

[0060] 供试品溶液：精密称取泊马度胺12.5mg，置100ml量瓶中，加乙腈20ml使溶解，加流动相B稀释至刻度，摇匀，即得。

[0061] 专属性溶液：取泊马度胺供试品溶液，适量加入5个已知杂质：原料1：3-氨基-2,6,-哌啶二酮、中间体：3-氨基邻苯二甲酸、原料2：3-硝基邻苯二甲酸、副产物1：4–硝基-2-（2,6-二氧代-哌啶-3-基）-异二氢吲哚-1,3-二酮、副产物2：5-氨基-2-（2,6-二氧代-哌啶-3-基）-异二氢吲哚-1,3-二酮。

[0062] 实施例6专属性试验

[0063] 精密吸取实施例5所述的专属性溶液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，泊马度胺主峰与5个已知杂质的分离度均大于10，5个已知杂质之间的分离度均大于5，表明本法测定泊马度胺与5个已知杂质的专属性较好。

[0064] 实施例7有关物质测定试验

[0065] 精密吸取实施例5所述的供试品溶液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图。三个批号（深圳海王药业有限公司提供，批号20130401、20130402、20130403）的泊马度胺中均未检出5个已知杂质，未知杂质总含量分别为0.03%、0.04%和0.02%。

[0066] 实施例8与现有已知方法的对比

[0067] 现有已知方法色谱条件：

[0068] 色谱柱：ACE C18柱150×4.6mm，3μm

[0069] 流动相A：甲醇

[0070] 流动相B：25mM醋酸铵（加甲酸调pH=5.5）

[0071] 两者体积按梯度洗脱，如下表：

[0072] 表5.现有已知方法流动相洗脱程序

[0073]

[0074] 流速：0.7ml/min，

[0075] 柱温：30℃。

[0076] 按上述现有方法色谱条件，精密吸取实施例5所述的专属性溶液20ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果与本法比较见表6

[0077] 表6.现有已知方法与本法比较

[0078]