一种测定细胞DNA损伤标志物?H2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于：是采用一种特异性?H2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白?H2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有荧光产物，可根据底物的荧光值实现对?H2AX定量测定的方法。并利用该方法定量检测出由于卷烟烟气暴露而导致的细胞中?H2AX的含量变化，从而达到评价卷烟烟气基因毒性的目的。与传统有机染料相比，酶标抗体具有以下优势：酶的催化频率高,能放大反应效果，提高检测灵敏度；酶在室温下性质稳定且价格便宜，适于大量分析。酶联免疫分析方法具有快速、准确、高通量、高灵敏等优点。
1.一种测定细胞DNA损伤标志物 ɣH2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于：是采用一种特异性ɣH2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白ɣH2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为荧光产物，可根据产物的荧光值实现对ɣH2AX定量测定的方法，具体步骤如下：
1）实验试剂的配制，包括以下实验试剂：（1）细胞培养基，（2）4%多聚甲醛溶液，（3）PBS-T缓冲液，（4）细胞膜通透液，（5）封闭剂，（6）混合一抗溶液，（7）混合二抗溶液，（8）底物A：取0.1 M、 pH=8.6的Tris-HCl的缓冲液10 ml，加入0.0011 g鲁米诺，0.0008 g对碘苯酚为溶液A1；取0.1 M、 pH=8.6的Tris -HCl的缓冲液10 ml，加入2.6 μl30%的H2O2，为溶液A2；使用前溶液A1和溶液A2各取75 μl混匀使用；（9）底物B：用二乙醇胺（DEA）缓冲液配制0.0125 mmol/l的4-甲基伞花基磷酸钠（4-MUP）溶液；
2）细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，于37 ℃，5％C02培养箱中培养，细胞生长至汇合率为70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种，96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl细胞悬液，最终细胞接种密度为5000 个/孔,于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；
3）卷烟烟气粒相物萃取液及气相物吸收液的制备：制备最终浓度为10 mg/ml的烟气粒相物萃取液，和与其浓度相当的烟气气相物吸收液；
4）卷烟烟气染毒：使用细胞培养基将烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h 后，吸去培养液，分别设置7个不同浓度的烟气粒相物或烟气气相物染毒组和一个空白对照组，每组6个平行样孔，烟气粒相物染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液，烟气气相物染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气气相物吸收液，空白对照每孔加入100 μl 稀释培养液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；
5）基于酶联免疫方法对细胞中ɣH2AX定量测定：(1)细胞固定：细胞染毒24 h后，小心移去培养基，用PBS溶液洗涤两次，每次至少5 min，以除去化合物染毒溶液，每孔加入100 μl的4%多聚甲醛固定细胞15 min；(2)固定好的A549细胞用PBS-T洗涤2次，每孔加入
100 μl通透液室温孵育15 min；(3)PBS-T洗涤3次，滴加2% BSA封闭液37 ℃湿盒中孵育1 h；(4) 加入100 μl含有兔抗总H2AX抗体和小鼠抗ɣH2AX抗体，在37 ℃恒温培养箱中孵育2小时或4 ℃过夜；(5)PBS-T洗涤3次，加入HRP标记驴抗鼠和AP标记的羊抗兔混合二抗溶液，在37 ℃恒温培育1小时；(6)PBS-T洗涤3次，向微孔板中加入75 μl的辣根酶底物A，孵育50 min，再加入75 μl的碱性磷酸酶底物B，孵育30 min后经荧光酶标仪测定荧光强度值，分别在540 nm处激发，在600 nm处检测，以及在360 nm处激发，在450 nm处检测；
所述小鼠抗ɣH2AX抗体的最佳浓度为0.6-1.0 μg/ml；HRP酶标记的驴抗鼠抗体稀释浓度为4-6μg/ml；
6）数据处理：试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入酶标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；本实验在检测目标物ɣH2AX的同时，对细胞中总H2AX也进行了定量测定且不区分磷酸化标记，根据目标物ɣH2AX与总H2AX荧光检测信号的比值来确定H2AX的磷酸化程度。
2.根据权利要求1所述的测定细胞DNA损伤标志物 ɣH2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于：步骤1）中各实验试剂的具体配制方法如下：（1）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μg/ml；
（2）4%多聚甲醛溶液：40 g多聚甲醛、2.965 g磷酸二氢钠、29 g磷酸二氢钠和1000 ml蒸馏水放入烧杯中，在磁力搅拌器上加热60 ℃振荡24 h；
（3）PBS-T缓冲液：0.2 g磷酸二氢钾，2.9 g磷酸氢二钠，8.0 g氯化钠，0.2 g氯化钾，
（4）细胞膜通透液：0.5% Triton X-100的配制：取0.5 ml Triton X-100，加入至99.5 ml的pH7.4的磷酸盐缓冲液 (PBS)中，混合后置37 ℃～40 ℃水使其充分溶解混匀；
（5）封闭剂：2%牛血清白蛋白（BSA）溶液的配制：取2 gBSA用0.01 mol/l 、 pH7.4的PBS溶解，定容至100 ml；
（6）混合一抗溶液：使用前取适量小鼠抗ɣH2AX抗体和兔抗总H2AX抗体混合，用封闭剂稀释至所需浓度；
（7）混合二抗溶液：使用前取适量HRP标记驴抗鼠和AP标记的羊抗兔混合二抗溶液混合，用封闭剂稀释至所需浓度；
（8）底物A中0.1 M、 pH=8.6的Tris-HCl的缓冲液是通过以下方法制备：先制备0.1 M的三羟甲基甲烷（Tris）溶液，再利用高浓度盐酸将pH调节至8.6；
（9）底物B中的二乙醇胺（DEA）缓冲液的制备方法为：二乙醇胺97ml，蒸馏水800ml，混合，用浓HCl调pH=9.8 ，加水至1000ml。
3.根据权利要求1所述的测定细胞DNA损伤标志物 ɣH2AX含量的酶联免疫测定方法，其特征在于：步骤3）中卷烟烟气粒相物萃取液及气相物吸收液的制备方法如下：卷烟样品于温度22℃±1℃和相对湿度60%±3%条件下平衡48 h；然后使用转盘式吸烟机在ISO抽吸条件下抽吸卷烟，烟气粒相物用剑桥滤片收集，根据烟气粒相物质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为10 mg/ml的烟气粒相物萃取液，使用前在－70 ℃以下储存；在收集烟气总粒相物的同时将气相物通入装有PBS溶液的吸收瓶中，粒相物收集完毕后，将PBS吸收液定容至与粒相物萃取液中DMSO体积相同，通过0.2 μm的滤膜除菌后，得到最终浓度与粒相物萃取液相当的烟气气相物吸收液，且必须在制备后半小时内使用。
一种测定细胞DNA损伤标志物γH2AX含量的酶联免疫测定
方法
技术领域
[0001] 本发明涉及细胞DNA损伤标志物磷酸化组蛋白（H2AX）的酶联免疫检测技术，并将其用于卷烟烟气的基因毒性评估，具体是一种测定细胞DNA损伤标志物H2AX含量的酶联免疫测定方法。
背景技术
[0002] DNA损伤有许多不同的形式，其中DNA双链断裂被认为是DNA最严重的损伤。当细胞发生DNA双链断裂后，组蛋白H2AX的丝氨酸残基可以被毛细血管共济失调突变基因（ATM）和DNA依赖性蛋白激酶（DNA-PK）等磷酸化，形成H2AX。H2AX的形成与双链断裂数量成正比，从而使H2AX成为DNA双链断裂的重要的特异性生物标志物。近年来，有大量文献开展了卷烟烟气导致DNA双链断裂的研究。Albino等使用H2AX来评价卷烟烟气对人类A549肺癌细胞和正常的人支气管上皮细胞基因毒性，发现呈剂量效应关系，进一步研究表明H2AX与焦油含量正相关，而与卷烟类型和吸烟行为无关。Toyooka等研究证实卷烟主流和侧流烟气暴露于人类A549肺癌细胞，H2AX呈剂量效应关系且与时间正相关。
[0003] 目前H2AX的检测方法主要有免疫荧光法、流式细胞技术和高内涵细胞成像技术。这些技术所需仪器昂贵，都是利用H2AX的特异性抗体和荧光分子标记的二抗实现对目标物定量测定的，所用的荧光分子均为传统有机染料。本实验所采用的二抗为酶标抗体，目前应用较多的有辣根过氧化物（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等酶标记的抗体。
发明内容
[0004] 本发明是基于现有技术状况而开发的细胞中DNA损伤标志物—H2AX蛋白的酶联免疫检测方法，并利用该方法定量检测出由于卷烟烟气暴露而导致的细胞中H2AX的含量变化，从而达到评价卷烟烟气基因毒性的目的。该检测方法具有快速、准确、高通量、高灵敏等特点。
[0005] 本发明的目的是通过以下具体步骤实现的：一种测定细胞DNA损伤标志物H2AX含量的酶联免疫测定方法，是采用一种特异性H2AX抗体及酶标二抗对目标蛋白H2AX特异性夹心识别，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有荧光产物，可根据底物的荧光值实现对H2AX定量测定的方法，具体步骤如下：
[0006] 1)实验试剂的配制，包括以下实验试剂：（1）细胞培养基，（2）4%多聚甲醛溶液，（3）PBS-T缓冲液，（4）细胞膜通透液，（5）封闭剂，（6）混合一抗溶液，（7）混合二抗溶液，（8）底物A，（9）底物B；
[0007] 2)细胞培养：人肺癌细胞A549细胞株培养于含10％胎牛血清的1640培养基中，于37 ℃，5％C02培养箱中培养,细胞生长至汇合率为70%-80%时，用0.25％胰蛋白酶消化法进行细胞接种,96 孔板的最外周36 个孔中每孔加入100 μl生长培养液作为空白对照，其余每孔加入100 μl细胞悬液，最终细胞接种密度为5000 个/孔,于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；
[0008] 3)卷烟烟气粒相物萃取液及气相物吸收液的制备：卷烟样品于温度（22±1）℃和相对湿度60%±3%条件下平衡48 h；然后使用转盘式吸烟机在ISO抽吸条件下抽吸卷烟，烟气总粒相物用剑桥滤片收集，根据烟气总粒相物质量加入相应体积的DMSO溶剂，得到最终浓度为10 mg/ml的烟气粒相物萃取液，使用前在－70 ℃以下储存；在收集烟气总粒相物的同时将气相物通入装有PBS溶液的吸收瓶中，粒相物收集完毕后，将PBS吸收液定容至与粒相物萃取液中DMSO体积相同，通过0.2 μm的滤膜除菌后，得到最终浓度与粒相物萃取液相当的烟气气相物吸收液，且必须在制备后半小时内使用。
[0009] 4) 卷烟烟气染毒：使用细胞培养基将烟气粒相物萃取液或烟气气相物吸收液调整到不同浓度，设置7个非零浓度，细胞培养24 h 后，吸去培养液，分别设置7个不同浓度的烟气粒相物或烟气气相物染毒组和一个空白对照组，每组6个平行样孔，烟气粒相物染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气粒相物萃取液，烟气气相物染毒组每孔加入100 μl不同浓度梯度的烟气气相物吸收液，空白对照每孔加入100 μl 稀释培养液，于37 ℃、5% CO2 条件下培养24 h；
[0010] 5）基于酶联免疫方法对细胞中H2AX定量测定：(1)细胞固定：细胞染毒24 h后，小心移去培养基，用PBS溶液洗涤两次，每次至少5 min，以除去化合物染毒溶液，每孔加入100 μl的4%多聚甲醛固定细胞15 min；(2)固定好的A549细胞用PBS-T洗涤2次，每孔加入100 μl通透液室温孵育15 min；(3)PBS-T洗涤3次，滴加2% BSA封闭液37 ℃湿盒中孵育1 h；(4) 加入100 μl含有兔抗总H2AX抗体和小鼠抗H2AX抗体，在37 ℃恒温培养箱中孵育2小时或4 ℃过夜；(5)PBS-T洗涤3次，加入HRP标记驴抗鼠和AP标记的羊抗兔混合二抗溶液，在37 ℃恒温培育1小时；(6)PBS-T洗涤3次，向微孔板中加入75 μl的辣根酶底物A，孵育50 min，再加入75 μl的碱性磷酸酶底物B，孵育30 min后经荧光酶标仪（540 nm处激发，在600 nm处检测和360 nm处激发，在450 nm处检测）测定荧光强度值。
[0011] 6）数据处理：试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入酶标记的二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号；本实验在检测目标物H2AX的同时，对细胞中总H2AX（不区分磷酸化标记）也进行了定量测定，根据目标物H2AX与总H2AX荧光检测信号的比值来确定H2AX的磷酸化程度。
[0012] 在本发明中，步骤1）中各实验试剂的具体配制方法如下：
[0013] （1）细胞培养基：溶剂为RPMI-1640 培养基，其中胎牛血清的体积百分比为10%，L-谷氨酰胺的浓度为2 mM，青霉素的浓度为100 IU/ml，链霉素的浓度为100 μg/ml；
[0014] （2）4%多聚甲醛溶液：40 g多聚甲醛、2.965 g磷酸二氢钠、29 g磷酸二氢钠和1000 ml蒸馏水放入烧杯中，在磁力搅拌器上加热60 ℃振荡24 h；
[0015] （3）PBS-T缓冲液：0.2 g磷酸二氢钾，2.9 g磷酸氢二钠，8.0 g氯化钠，0.2 g氯化钾，0.5 ml吐温20，加水至1000 ml；
[0016] （4）细胞膜通透液：0.5% Triton X-100的配制：取0.5 ml Triton X-100，加入至99.5 ml的磷酸盐缓冲液 (PBS，pH7.4) 中，混合后置37 ℃～40 ℃水使其充分溶解混匀；
[0017] （5）封闭剂：2%牛血清白蛋白（BSA）溶液的配制：取2 gBSA用0.01 mol/l PBS(pH7.4)溶解，定容至100 ml；
[0018] （6）混合一抗溶液：使用前取适量小鼠抗H2AX抗体和兔抗总H2AX抗体混合，用封闭剂稀释至所需浓度；
[0019] （7）混合二抗溶液：使用前取适量HRP标记驴抗鼠和AP标记的羊抗兔混合二抗溶液混合，用封闭剂稀释至所需浓度；
[0020] （8）底物A：取0.1 M的Tris-HCl(PH=8.6)的缓冲液10 ml，加入0.0011 g鲁米诺，0.0008 g对碘苯酚为溶液A1；取0.1 M的Tris -HCl(PH=8.6)的缓冲液10 ml，加入2.6 ul30%的H2O2，为溶液A2；使用前溶液A1和溶液A2各取75 ul混匀使用。所述0.1 M的Tris-HCl(pH=8.6)的缓冲液是通过以下方法制备：先制备0.1 M的三羟甲基甲烷（Tris）溶液，再利用高浓度盐酸将pH调节至8.6。
[0021] （9）底物B：用二乙醇胺（DEA）缓冲液配制0.0125 mmol/l的4-甲基伞花基磷酸钠（4-MUP）溶液。所述二乙醇胺（DEA）缓冲液的制备方法为：二乙醇胺97ml，蒸馏水800ml，混合，用浓HCl调pH=9.8 ，加水至1000ml；或通过市场购买。
[0022] 本发明中，对特异性抗体使用浓度进行了优化：酶联免疫法对细胞中H2AX测定的灵敏度取决于特异性识别的一抗与目标物分子的结合量，其间接影响酶标记的二抗分子对目标分子的特异性识别。为提高检测灵敏度，分别对实验中小鼠抗H2AX抗体和HRP酶标记的驴抗鼠抗体进行了优化。图2A所示为使用不同浓度的小鼠抗H2AX抗体和相同浓度的HRP酶标记的驴抗鼠抗体对相同目标物分析时，在荧光酶标仪上测定的荧光强度值。由图2A可知，当小鼠抗H2AX抗体稀释浓度为0.6-1.0 μg/ml时，发射波长450 nm处测定的荧光强度最大。因此本实验中选择小鼠抗H2AX抗体的最佳浓度为0.6-1.0 μg/ml。图2B所示为使用相同浓度的小鼠抗H2AX抗体和不同浓度的HRP酶标记的驴抗鼠抗体对相同目标物分析时，在荧光酶标仪上测定的荧光强度值。由图2B可知，当HRP酶标记的驴抗鼠抗体稀释浓度为4-6 μg/ml时，发射波长450 nm处测定的荧光强度最大。因此本发明中HRP酶标记的驴抗鼠抗体稀释浓度为4-6μg/ml。
[0023] 本发明中，为了消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差，使用了H2AX特异性抗体和能识别总H2AX蛋白的抗体作为识别一抗，然后采用不同激发波长酶标记的特异性二抗对一抗识别，根据目标物H2AX与总H2AX荧光检测信号的比值和烟气染毒浓度绘制效应——剂量曲线，从而实现目标物H2AX的准确定量。图3A为对卷烟样品3R4F烟气冷凝物对细胞染毒12小时后检测细胞中H2AX得到的荧光信号。由图3A可知，烟气冷凝物染毒后细胞中H2AX对应的荧光检测信号随着烟气冷凝物染毒浓度的增加而逐渐增大，呈明显的剂量效应关系。图3B为根据目标物H2AX与总H2AX荧光检测信号的比值和烟气染毒浓度绘制的效应——剂量曲线。有图3B可知，通过测定细胞中总H2AX的荧光信号可消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差，减小平行样本荧光检测信号的偏差，从而实现目标物H2AX的准确定量。
[0024] 本发明的方法克服了现有H2AX免疫测定方法的不足，采用酶标二抗，提高了检测灵敏度。细胞接种在96孔板中，烟气染毒后通过细胞固定和通透可实现细胞样本的直接、高通量检测，省去了蛋白质提取步骤。通过测定细胞中总H2AX的荧光信号可消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差，减小平行样本荧光检测信号的偏差，从而实现目标物H2AX的准确定量。与现有技术相比具有如下特点和优势：
[0025] 1）高通量：本发明方法将常用的96孔微孔板应用于细胞DNA损伤标志物H2AX的测定中，可同时实现96孔中细胞DNA损伤标志物H2AX的定量测定，具有快速、高通量的优势。
[0026] 2）灵敏度高：对相同样品的测定中，利用酶标记抗体代替传统有机染料标记抗体，由于酶催化频率高，可放大反应效果，提高检测灵敏度。
[0027] 3）定量准确：本方法中，将目标物H2AX与总H2AX的荧光信号的比值和化合物染毒浓度绘制剂量效应曲线。通过测定细胞中总H2AX的荧光信号可消除各检测孔中由细胞个数差异引起的信号偏差。更准确的反映出细胞DNA的损伤程度，减小平行样本荧光检测信号的偏差，提高方法重现性。
[0028] 本发明所用的酶标抗体与目前所用的传统有机染料标记的抗体相比，具有以下优势：酶的催化频率高,能放大反应效果，提高检测灵敏度；酶在室温下性质稳定且价格便宜，适于大量分析。酶联免疫分析方法具有快速、准确、高通量、高灵敏等优点。
附图说明
[0029] 图1. 本发明实验方法原理图。
[0030] 图2. 小鼠抗H2AX抗体、其对应的HRP酶标记驴抗鼠抗体使用浓度与荧光强度的关系坐标曲线图，其中：（A）使用不同稀释比的小鼠抗H2AX抗体所得到的荧光强度；（B）使用不同稀释比的HRP酶标记驴抗鼠抗体所得到的荧光强度。
[0031] 图3. 烟气粒相物染毒浓度与荧光检测信号之间的剂量-效应曲线图，其中：（A）烟气粒相物染毒浓度和目标物H2AX荧光检测信号绘制的剂量效应曲线；（B）烟气粒相物染毒浓度和目标物H2AX与总H2AX荧光检测信号的比值绘制的剂量效应曲线。
[0032] 图4.卷烟样品A的烟气气相物和烟气粒相物染毒浓度与细胞中H2AX测定的相对荧光强度的剂量效应曲线。
具体实施方式
[0033] 本发明以下结合实施例做进一步描述，但并不是限制本发明。
[0034] 实例1：
[0035] 为考察卷烟样品A的烟气粒相冷凝物与气相冷凝物对细胞DNA损伤的影响差异，采用转盘式20H型吸烟机（德国，Borgwaldt公司）对20支卷烟样品进行抽吸，抽吸模式参照ISO的要求。剑桥滤片共捕集到烟气粒相物178 mg。加入17.8 mL的DMSO溶液，置于振荡器上萃取30分钟。将萃取液通过0.22μm的滤膜除菌后得到10 mg/mL的烟气总粒相物萃取液。在收集烟气总粒相物的同时将气相物通入装有PBS溶液的吸收瓶中，收集完毕后，将PBS吸收液定容至与粒相物萃取液中DMSO体积相同，通过0.22 μm的滤膜除菌后，得到相应的烟气气相物吸收液。用细胞培养液稀释烟气总粒相物萃取液和烟气气相物吸收液，分别配不同浓度的染毒溶液对A549细胞进行染毒，染毒浓度均为10、25、50、75、100、150、200 μg/mL。然后用基于酶联免疫方法测定细胞中H2AX和总H2AX的含量。试验中设置空白对照组，即不加入一抗抗体，仅加入二抗抗体，所检测信号即为由非特异性吸附引起的空白信号。所有样品测试孔的检测信号应扣除空白信号。最后，根据目标物H2AX与总H2AX荧光检测信号的比值和染毒浓度绘制剂量效应曲线，结果如图4所示。由图4可知，细胞中H2AX的含量随着烟气冷凝物萃取液浓度的升高而增大，呈明显的剂量效应关系。粒相冷凝物暴露下细胞中H2AX的含量明显高于同浓度气相冷凝物暴露下的细胞，且粒相冷凝物暴露下细胞中H2AX的含量随萃取液浓度升高的增长趋势更显著。因此，烟气粒相冷凝物对细胞DNA损伤的影响大于气相冷凝物。
