N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺的用途

摘要

本发明涉及N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺在制备用于退行性神经病变的药物制剂的用途。所述神经退行性病变包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病，多发性硬化症中的一种或几种。本发明还涉及N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺的合成方法。

权利要求

1.N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺化合物或其药物组合物在制备治疗退行性神经病变药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述退行性神经病变为阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨廷顿氏病、小脑萎缩症、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症中的一种或几种。

3.N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺或其药物组合物在制备抑制炎性反应药物中的应用。

4.N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺或其药物组合物在制备髓鞘保护的药物中的应用。

5.N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺或其药物组合物在制备免疫调节药物中的应用。

6.根据权利要求1-5任一所述应用，其特征在于，所述的化合物的单次治疗有效量为：

1mg-200mg，给药方式为口服。

7.根据权利要求1-5任一所述应用，其特征在于，所述药物组合物由N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺和药物可接受的载体组成，制备成任何药用剂型。

说明书

N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺的用途

技术领域

[0001] 本发明属于医药技术领域，具体涉及N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺在制备治疗神经系统退行性病变药物中的应用，并提供了此化合物的合成方法。

背景技术

[0002] 神经系统退行性疾病(Neurodegenerative disease)是大脑和脊髓的神经元变性丧失的病理结果。大脑和脊髓由神经元组成，神经元有不同的功能，如控制运动，处理感觉信息，并作出决策。大脑和脊髓的细胞一般是不会再生的，所以过度的损害可能是毁灭性的，不可逆转的，并且随着时间的推移而恶化，导致功能障碍。

[0003] 常见的神经系统退行性疾病有阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨廷顿氏病、小脑萎缩症、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症等。

[0004] 帕金森氏病（Parkinson disease，PD），又称震颤麻痹，是中老年常见的神经系统变性疾病，以黑质多巴胺（DA）能神经元变性缺失和路易小体形成为特征。临床表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常等。主要病理改变是含色素神经元变性丢失，黑质致密部DA能神经元尤著。出现临床症状时，此处DA能神经元丢失50%以上，症状明显时丢失的更严重，残留神经元胞浆中出现嗜酸性包涵体（路易小体），含α-突触核蛋白和泛素。类似改变也可见于蓝斑、中缝核、迷走神经背核等，但程度较轻。

[0005] 阿尔茨海默病(Alzheimer’s,简称AD)又称老年痴呆症。是失智症中最普遍的成因。最显著的早期症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期记忆缺失，而长期记忆则相对不受病情的影响。随着病情的加重，患者的语言能力，空间辨别能力，认知能力会逐步衰退。受AD影响的神经功能通常与大脑的额叶(frontal lobe)联系紧密，这反映了疾病的病理学过程。病理改变主要为皮质弥漫性萎缩，沟回增宽，脑室扩大，神经元大量减少，并可见老年斑(SP),神经原纤维结(NFT)等病变，乙酰胆碱酯酶及乙酰胆碱含量显著减少。神经病理显示，AD患者脑重减轻，可有脑萎缩、脑沟回增宽和脑室扩充。SP和NFT大量出现于大脑皮层中，是诊断AD的两个主要依据。①大脑皮质、海马、某些皮层下核团如杏仁核、前脑基底神经核和丘脑中有大量的SP形成。SP的中心是β淀粉样蛋白前体的一个片断。正常老人脑内也可出现SP，但数量比AD患者明显为少。②大脑皮质、海马及皮质下神经元存在大量NFT。NFT由双股螺旋丝构成。主要成分是高度磷酸化的tau蛋白。

[0006] 多发性硬化是中枢神经系统与免疫有关的炎性脱髓鞘(demyelinating)疾病。同时、神经纤维(axon)、神经元（neuron）及寡棘突细胞(oligodedrocyte)亦会受损，也有认知功能障碍。临床表现较为广泛，一般而言、运动、感觉、以及视觉的影响都很常见；若脑干及小脑系统的神经纤维受损、复视、吞咽困难、步履不稳、晕眩的症状亦可能发生。如果脊髓发炎、除了运动、感觉功能外、排泄的功能亦发生障碍。少数病患还会有癫痫及智能障碍的发生。因为多发性硬化是自身免疫病，免疫系统Th1和Th17T细胞是重要的致病细胞，同时血脑屏障（blood brain barrier）可呈现破坏；使致病性的T细胞和巨噬细胞侵入中枢神经系统；继而激活胶质细胞，特别是小胶质细胞，进一步放大中枢神经系统的免疫炎症反应，最终导致炎性脱髓鞘和神经元轴索变性。

[0007] 对于以上疾病，人们一直都在积极的寻找有效的治疗药物，并研究和观察了大量的神经保护剂，试图可以预防和治疗这些神经系统变性疾病的发生和发展，包括钙通道拮抗剂、自由基消除剂、谷氨酸拮抗剂、细胞膜稳定剂和神经营养因子等，但由于神经系统退行性疾病病理过程由多种因素同时或先后参与了神经元的变性与死亡，单纯作用于单个靶点的药物难以取得令人满意的疗效，上述神经保护剂的临床效果并不理想。

[0008] 有证据表明Rho激酶活性药物具有促进神经突触生长，促进损伤后的神经功能恢复的效果，可以治疗和缓解脊髓损伤，帕金森病，多发性硬化等神经系统变性疾病。时至今日，见诸报道的Rho激酶抑制剂主要有异喹啉类，吲哚类，酰胺及脲类和4-氨基吡啶类。属于异喹啉类的HA-1077（又名法舒地尔）作为一种新型的高效血管扩张药，能够有效缓解脑血管痉挛，改善蛛网膜下隙出血(SAH)患者的预后。日本于1995年正式批准其进入临床，防治动脉瘤破裂后迟发性血管痉挛，是目前为止唯一上市的Rho激酶抑制剂，具有广阔的应用前景。

[0009] 但在法舒地尔的使用过程中，人们发现其在体内代谢快，而且不易透过血脑屏障。

发明内容

[0010] 本发明目的在于提供N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺化合物或其药物组合物在制备治疗退行性神经病变药物中的应用。

[0011] 退行性神经病变包括但不限于：阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症、肌肉萎缩性侧索硬化症、共济失调毛细血管扩张症、牛海绵状脑病、克雅二氏病、亨廷顿氏病、小脑萎缩症、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症。

[0012] 本发明所述4-氨基吡啶类化合物N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺(代号W5或WAR-5)，其结构式如下：

[0013]

[0014] 本发明所述化合物为Rho激酶抑制剂，具有抑制炎症、调节免疫、髓鞘修复的作用，相对于目前药物具有多重药理作用，毒副作用更低的特点，可以作为神经系统退行性疾病的治疗药物。

[0015] 本发明还提供N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺或其药物组合物在制备抑制炎性反应药物中的应用。

[0016] 本发明还提供N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺或其药物组合物在制备髓鞘保护的药物中的应用。

[0017] 本发明还提供N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺或其药物组合物在制备免疫调节药物中的应用。

[0018] 本发明所述化合物可以为N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺，其药学上所述的盐、结晶或水合物等药学上可接受的形式，其药学上所述盐包括但不限于：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、醋酸、丙酸、丁酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、己二酸、苯甲酸、苯丙酸、肉桂酸、硬脂酸、三氟醋酸、马来酸、富马酸、烟酸、棕榈酸、果酸、柠檬酸、乳酸、羟基丁酸、乳糖酸、酒石酸、扁桃酸、葡萄糖酸、葡萄糖醛酸、抗坏血酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸和樟脑磺酸、谷氨酸、天冬氨酸。

[0019] 本发明所述的药物组合物由N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺和药物可接受的载体组成，N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺在药物组合物中的重量占到0.1-99.9%。

[0020] 本发明的药物制剂，以单位剂量形式存在，所述单位剂量形式是指制剂的单位，如片剂的每片，胶囊的每粒胶囊，口服液的每瓶，颗粒剂每袋，注射剂的每支等。

[0021] 本发明的药物组合物可以是任何可药用的剂型，这些剂型包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、滴剂、滴丸剂、。

[0022] 本发明的药物组合物，其口服给药的制剂可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适用的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂。适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠。适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁。
适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

[0023] 可通过混合，填充，压片等常用的方法制备固体口服组合物。进行反复混合可使活性物质分布在整个使用大量填充剂的那些组合物中。

[0024] 口服液体制剂的形式例如可以是水性或油性悬浮液、溶液、乳剂、糖浆剂或酏剂，或者可以是一种在使用前可用水或其它适宜的载体复配的干燥产品。这种液体制剂可含有常规的添加剂，诸如悬浮剂，例如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂，例如卵磷脂、脱水山梨醇一油酸酯或阿拉伯胶；非水性载体（它们可以包括食用油），例如杏仁油、分馏椰子油、诸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐剂，例如对羟基苯甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常规的香味剂或着色剂。

[0025] 对于注射剂，制备的液体单位剂型含有本发明的活性物质和无菌载体。根据载体和浓度，可以将此化合物悬浮或者溶解。溶液的制备通常是通过将活性物质溶解在一种载体中，在将其装入一种适宜的小瓶或安瓿前过滤消毒，然后密封。辅料例如一种局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也可以溶解在这种载体中。为了提高其稳定性，可在装入小瓶以后将这种组合物冰冻，并在真空下将水除去。

[0026] 本发明的药物组合物，在制备成药剂时可选择性的加入适合的药物可接受的载体，所述药物可接受的载体选自：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、EDTA二钠、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁等。

[0027] 本发明所述的化合物的的单次治疗有效量为1mg-200mg：优选的：5mg-150mg，特别优选的10mg-90mg，给药方式为口服、静脉、肌注。

[0028] 本发明还提供了化合物N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺的制备方法。

[0029] 本发明所述的化合物N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺的制备方法，包括以下步骤：

[0030] 步骤一：将4-氨基吡啶分散于二氯甲烷中，加入三乙胺，混合均匀后，冰浴下滴加氯甲酸乙酯，之后于室温反应过夜。减压蒸去溶剂，再用5%的稀盐酸溶液调节溶液至PH=5～6，乙酸乙酯萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩后，得到白色固体。

[0031] 步骤二：将白色固体和哌嗪溶于1,4-二氧六环中，并加入N-甲基吡咯烷作为催化剂，然后回流反应24h，减压蒸去溶剂，柱层析分离得到浅黄色油状液体产物。

附图说明

[0032] 图1 N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺红外鉴定光谱图

[0033] 图2 N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺高分辨率质谱图

[0034] 图3 N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺1H-NMR图谱

[0035] 图4 N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺13C-NMR图谱

[0036] 图5 Rho激酶抑制剂活性的测定

[0037] 图6 原代神经元和BV-2小胶质细胞突触形成的影响（24h）

[0038] 图7 不同时间BV-2小胶质细胞突触形成（5d）

[0039] 图8 不同化合物对小胶质细胞突触形成的定量测定

[0040] 图9 神经元细胞活性测定

[0041] 图10 小胶质细胞活性测定。

[0042] 图11 神经元细胞毒性测定。

[0043] 图12 小胶质细胞毒性测定。

[0044] 图13 W5化合物和模型组临床评分

[0045] 图14 W5化合物和模型组体重变化

[0046] 图15A、W5化合物和模型组品均起病时间比较

[0047] 图15B、W5化合物和模型组临床症状累计评分

[0048] 图15C、W5化合物和模型组临床症状品均评分

[0049] 图16A、图16B、EAE和W5两组间脊髓髓鞘染色比较，深颜色部分是脊髓的白质，也是疾病脱髓鞘的病理部位，深颜色中白色部分即为脱髓鞘。

[0050] 图17 72h后NO测定结果

[0051] 图18A、巨噬细胞IL-1β测定结果

[0052] 图18B、巨噬细胞TNF-α测定结果

[0053] 图19A、T细胞IFN-γ测定结果

[0054] 图19B、T细胞IL-17测定结果

[0055] 图19C、T细胞IL-10测定结果

具体实施方式

[0056] 通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。

[0057] 实施例1 N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺的制备

[0058] 步骤一：

[0059] 将4-氨基吡啶（3.76g，39.95mmol）分散于50mL二氯甲烷中，加入三乙胺（4.85g，47.94mmol），混合均匀后，冰浴下滴加氯甲酸乙酯（4.34g，39.95mmol），之后于室温反应过夜。减压蒸去溶剂，再用5%的稀盐酸溶液调节溶液至PH=5～6，乙酸乙酯萃取（50mL×3），合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩后，得到5.80g白色固体，收率87.3%。。

[0060] 步骤二：

[0061] 将白色固体（3.00g，18.06mmol）和哌嗪（3.03g，35.16mmol）溶于30mL1,4-二氧六环中，并加入1mL N-甲基吡咯烷作为催化剂，然后回流反应24h，减压蒸去溶剂，柱柱层析[V（乙酸乙酯）：V（甲醇）=5:1]分离得到1.90g浅黄色油状液体，收率51.1%。

[0062] 所得化合物化学位移值如下：

[0063] 1H-NMR(600MHz,CD3OD)δ:8.24(d,J=5.8Hz,2H),7.48(d,J=5.8Hz,2H),3.51(s,4H),2.83(s,4H)。

[0064] 13C-NMR(125MHz,CD3OD)δ:46.77,54.25,109.09,113.07,150.20,155.33。

[0065] 所得化合物结构鉴定图谱见图1-图4。

[0066] HPLC条件：

[0067] 用十八烷基键合相硅胶为填充剂：0.20g磷酸二氢钠加入500mL蒸馏水，滴入2滴磷酸，控制pH=2.5）为缓冲盐；甲醇：缓冲盐=3:7为流动相，检测波长为274nm，流速为1.0mL/min，理论塔板数应按法舒地尔衍生物算不超过4000。

[0068] （1）取上述终产物适量，用甲醇稀释，配制成0.2mg/mL样品溶液，取20ul进样，在上述HPLC条件下进行检测。

[0069] （2）分析结果：产品含量大于99%。

[0070] 将终产物用于Rho激酶抑制活性，细胞凋亡以及突触再生的测试。

[0071] 实施例2-实施例5为体外细胞实验，用于说明N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺在体外具有治疗神经退行性疾病的治疗作用。

[0072] 实施例2 Rho激酶抑制剂活性的测试

[0073] 小胶质细胞是中枢神经系统内的免疫细胞，既可通过吞噬脑组织中的病原体及有害颗粒对神经元起保护作用，又可在炎性分子的作用下，激活成反应性小胶质细胞，分泌炎性细胞因子对神经元起毒性作用，是治疗神经炎症及神经退行性疾病的一个重要靶点。BV2细胞是体外研究最常用的小胶质细胞。分别用N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺和PBS处理（PBS是磷酸缓冲液的简称，一般有活性的生物制剂都要用它来稀释，原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用）作对照试验，作用24小时后用Rho激酶活性试剂盒检测其活性。

[0074] 图5是N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺Rho激酶活性测定。其中N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺显示其Rho激酶抑制效果。

[0075] 实施例3 细胞再生和突触形成能力的测试

[0076] 图6是N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺对原代神经元和BV-2小胶质细胞突触形成（24h）的影响。我们采用小鼠原代神经元和BV-2小胶质细胞系，观察War-5对细胞突触的影响。结果显示比较PBS对照，War-5能够促进对神经元突触形成。利用BV-2小胶质细胞系，我们也得到了类似的结果。

[0077] 图7是N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺处理不同时间BV-2小胶质细胞突触形成（5d），我们进一步观察War-5处理不同时间对细胞突触形成的影响。结果显示War-5能够促进突触再生，且药效持续时间较长。

[0078] 图8是N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺对小胶质细胞的平均突触长度进行定量测定。结果显示与PBS对照比较，N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺处理可形成突触。

[0079] 综上，N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺具有Rho激酶抑制和突触形成的能力。

[0080] 实施例4 神经元和小胶质细胞活性测试

[0081] MTT法，主要是用于检测细胞活性的方法。其作用的基本原理如下：活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮[3–(4,5–dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenylterazolium bromide,MTT]为蓝紫色的不溶于水的甲臜，生成的甲臜能够沉积在活细胞中，而死细胞则无此功能。用二甲基亚砜将细胞中的甲臜溶解，用酶联免疫检测仪在490nm的波长下测定其吸光值（OD值），可以间接反映活细胞数量。

[0082] 图9是神经元细胞活性的测定。比较神经元PBS对照，N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺呈现活性增加。

[0083] 图10为小胶质细胞活性测定。以PBS为基准，N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺显示细胞活性有轻微增加。

[0084] 实施例5 神经元和小胶质细胞毒性测试

[0085] LDH是测试细胞毒性的方法。向纯化的LDH抗体中加入受试化合物，经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺（TMB）显色，TMB在乳酸脱氢酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色，用酶标仪在450nm的波长下测定吸光值（OD值），颜色的深浅（OD值的大小）与样品中的LDH浓度正相关。

[0086] 图11所示神经元细胞的毒性测试。比较PBS，N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺细胞毒性更低。

[0087] 图12所示小胶质细胞毒性的测定。N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺则没有显示明显的小胶质细胞毒性。

[0088] 综上，N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺对小胶质细胞的细胞毒性最低。

[0089] 实施例6 N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺EAE模型的临床病理机制观察（本实施例用于说明本专利公开化合物治疗神经退行性疾病的治疗作用）

[0090] 一、材料和方法：

[0091] （1）EAE模型的建立:

[0092] 清洁级雌性C57BL/6小鼠（8-10周龄，体重18-20g），购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验前在无病源菌实验室经清洁级饲养，自由饮食正常喂养一周后，按平均体重各组均等原则随机分为EAE对照组和N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺组（以下称为W5）。

[0093] MOG35-55肽段(氨基酸序列:MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK)由北京联科生物公司合成。取MOG35-55肽段3mg，溶于1ml完全弗氏佐剂(4mg/ml)；采用针管混合器将等体积两种溶液体充分混合，制成油包水样乳白色混悬液，以静置后无分层为合格。

[0094] 动物乙醚麻醉后，于脊柱后半部中线两侧分四点进针皮下注入抗原乳剂0.1ml/只，25μl/点，然后记录免疫当天为第0天(p.i.0)。在免疫当日和48小时后，各组小鼠分别腹腔注射百日咳毒素（PTX）800ng/只作为免疫增强剂。

[0095] （2）化合物干预:

[0096] 腹腔注射组于免疫后第3天后每天腹腔W5（0.8mg/只)，分别上下午二次给与，直至免疫后第27天，对照小鼠给予等量生理盐水腹腔注射。

[0097] （3)临床症状评分:

[0098] 小鼠自MOG35-55免疫当日开始每天观察小鼠神经功能评分，采用国际通用的5分评分制对小鼠进行临床评分，直至免疫后第27天。

[0099] 评分标准：

[0100] 0分 无任何临床症状

[0101] 1分 尾部张力消失，可见轻度笨拙

[0102] 2分 一侧后下肢无力，被动翻身后可恢复

[0103] 3分 双侧后肢瘫痪，被动翻身后不能恢复，但给予刺激后可挪动

[0104] 4分 双侧后肢瘫痪伴前肢瘫痪

[0105] 5分 濒死状态或死亡

[0106] 介于两者标准之间以±0.5分记。

[0107] （4)髓鞘染色

[0108] 脑片浸入二甲苯7分钟x3次，100%无水乙醇3分钟x2次，95%乙醇3分钟x3次；置预热至37℃的LFB溶液中过夜或60℃2小时。95%乙醇和蒸馏水漂洗后，70%乙醇处理二次，每次10秒，再蒸馏水漂洗后，乙醇伊红液1分钟，蒸馏水漂洗后，再结晶紫1分钟，蒸馏水漂洗后，95%乙醇脱水5分钟，100%无水乙醇1分钟，二甲苯透明后封片显微镜下观察。

[0109] （5）HE染色

[0110] 冰冻切片经苏木精染色8min；蒸馏水漂洗后20秒；1%盐酸-乙醇处理5～10秒，自来水返蓝1～2min；伊红染色3min，自来水洗20秒；乙醇（95%，95%，75%，70%浓度）脱水各5分钟，二甲苯透明2次，各10分钟；中性树胶封片，显微镜下观察。

[0111] （6）抗原特异性T细胞增生

[0112] 荧光染料CFSE，是一种可对活细胞进行荧光标记的新型染料，可供标记活体细胞。其基本原理如下：CFSE能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。在细胞分裂增殖过程中，它的荧光强度会随着细胞的分裂而逐级递减，标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，通过流式细胞仪检测，因此其荧光强度是亲代细胞的一半，根据这一特性，它可被用于检测细胞增殖。

[0113] 免疫后第28天处死动物，取脾制备单个核细胞（Mononuclear Cells，MNC）。取细胞悬液，加入CFESE反应液（5umol/L）,置37℃放置15分钟，用40%体积德冷冻血清终止反应，离心洗涤后用适量完全培养液重悬细胞进行培养。培养时，加入特异性抗原MOG（10ug/ml）刺激，48小时后收集细胞，用PBS洗涤后重悬PBS中，上流式细胞仪检测分裂峰，用仪器自带软件分析计算分裂细胞百分数。

[0114] （7）细胞因子测定

[0115] 参照试剂盒的说明书检测细胞培养上清液中IL-6、IL-1β、TNF-a的含量。即向96孔板中分别加入50μl的捕获抗体，密封后4℃过夜；次日用洗涤缓冲液洗4次，向96孔板中分别加入50μl封闭液，室温封闭1h；洗涤液洗涤4次，按50μl/孔加入待测上清液，每板设2个空白对照孔，各加入50μl DMEM不完全培养液，室温下孵育2h；用洗涤缓冲液洗4次，各孔加入50μl的相应的检测抗体（生物素标记），室温下孵育1h；洗涤缓冲液洗涤
3次，加入50μl辣根过氧化物酶标记的卵白素，室温下孵育45min；用洗涤液清洗5次后，加入50μl酶作用底物，室温孵育15-20min底物显色后，加入5μl终止液，酶标仪在450nm处测定吸光值。

[0116] （8）NO测定

[0117] 收集各组刺激12h后的培养上清液,按照NO检测试剂盒(硝酸还原酶法)操作说明,各组分别取上清液100μl放入试验孔板，然后各组分别加入与上清液等体积的Griess液（Griess Rea-gent R1,Griess Reagent R2为1:1）,混匀室温静置10min,于540nm处检测各组吸光度(D值),以亚硝酸钠(NaNO2)建立标准曲线。

[0118] 二、结果：

[0119] 1.临床结果

[0120] 我们观察了W5化合物腹腔注射减轻EAE的临床症状。对临床结果解读如下：

[0121] （1）W5化合物水溶性:我们首先配制20mg/ml的药物储备液，临用时1：10稀释为2mg/ml。上下午各200ul，即400ul=800ug。W5化合物在20mg/ml情况下溶解良好。

[0122] （2）W5化合物治疗EAE临床效果有效。从EAE的临床症状评分看比较EAE对照组W5显著地抑制临床症状。评分图见图13。

[0123] （3）W5化合物治疗EAE体重明显增加，从EAE的体重变化看比较EAE对照组W5显著地增加小鼠体重，体重变化见图14。

[0124] （4）结果显示War-5均可有效推迟起病时间，减轻临床症状，包括临床累积的评分和临床平均评分见图15。War-5治疗EAE的起病时间和临床评分比较，见下表1：

[0125] 表1 两组间发病情况比较

[0126]

[0127] 2、实验结果：

[0128] ①脊髓髓鞘染色比较：W5化合物可有效改善EAE的脱髓鞘。（见图16）(此处试验结论用以说明W5的髓鞘修复作用)

[0129] ③氧化应激反应中的活性氧(reactive oxygen)包括氧自由基、NO等。活性氧能和膜磷脂、蛋白质、核酸等多种细胞成分发生反应，破坏细胞的结构和功能，造成细胞损伤。结论：W5化合物可有效抑制NO的产生。（见图17）。

[0130] 另外，我们还检测了War-5对巨噬细胞炎性细胞因子的作用。结果显示War-5均可有效抑制来自巨噬细胞的炎性因子TNF-a和IL-1β（见图18）（此处试验结论用以说明W5具有炎症抑制作用）。

[0131] ④国际上公认EAE（人类多发性硬化）是T细胞介导的中枢神经系统自身免疫性疾病，其中Th1和Th7是二类最重要的致病细胞亚群和细胞因子，因此我们还检测药物对重要致病因子的影响。我们研究了War-5治疗EAE的作用机制，比较了War-5是否具有免疫调节和抗炎作用。我们获取了对照组，法War-5治疗组小鼠脾脏，制备单细胞悬液，培养48小时收集上清液，用ELISA商用试剂盒检测炎性Th1和Th17细胞因子以及M1型巨噬细胞炎性因子TNF-α和IL-1β。结果显示:War-5能非常显著抑制炎性Th1和TH17的细胞因子IFN-γ和IL-17，特别是IL-17。同时，War-5可诱导Th2细胞因子IL-10（图19）。我们的结果认为War-5通过T细胞调节治疗EAE，即抑制致病的Th1和TH17T细胞，同时诱导抑制性的Th2T细胞。因为Th1和TH17T细胞为炎性T细胞，而Th2T细胞为抗炎性T细胞，故抑制TH1和TH17炎性T细胞和诱导Th2抗炎T细胞的免疫调节作用应该同时显示抗炎的作用。（此处试验结论用以说明W5具有免疫调节和抗炎作用，提示具有治疗神经退行性疾病的作用。）

[0132] 实验结果得出：War-5具有免疫调节和抗炎的作用。

[0133] 实施例7 N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺片剂的制备

[0134] 处方

[0135]

[0136] 制备工艺：

[0137] 1.按处方量称取N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺，粉碎，过80目筛，备用。

[0138] 2.按处方量称取其余辅料过80目筛，备用。

[0139] 3.取上述N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺，微晶纤维素，乳糖，混合均匀，加入纯化水适量，制软材。

[0140] 4.上述软材过24目筛制湿颗粒，60℃干燥，24目筛网整粒，得干颗粒。

[0141] 5.计算上述干颗粒的收率，按收率，在上述干颗粒中加入处方量的交联羧甲基纤维素钠，胶态二氧化硅，硬脂酸镁，混合物均匀。

[0142] 6.取上述混合均匀的中间体适量，测定N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺含量，以及水分。

[0143] 7.按步骤6测定结果，以合适冲头压片，包装，得N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺片剂。

[0144] 上述不同规格片剂，可根据神经退行性疾病的进程给予病人口服，用以治疗疾病。

[0145] 实施例8 N-(吡啶-4-)哌嗪-1-甲酰胺注射液的制备

[0146]

[0147] 制备工艺：

[0148] 1.按处方量称取N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺，粉碎，过80目筛，备用。

[0149] 2.按处方量称取N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺，加入到1600mL注射用水中，搅拌，使全部溶解。

[0150] 3.以0.1M HCl调节上述所得溶液pH值至5.0-8.0。

[0151] 4.在上述所得溶液中加入0.2%的针用活性炭，40℃保温搅拌20min。

[0152] 5.加入余量注射用水，定容至处方量。

[0153] 6.将上述所得溶液以0.45um及0.22um微孔滤膜过滤依次过滤两次，得澄明溶液。

[0154] 7.以0.1M HCl调节上述所得溶液pH值至5.0-8.0。

[0155] 8.取上述所得溶液适量，检测含量。

[0156] 9.取上述检测合格后的溶液灌装于2mL中硼硅玻璃安瓿瓶中，2mL/支，封口。

[0157] 10.取上述所得注射液，灭菌，灯检，冷却至室温，即得N-（吡啶-4-基）哌嗪-1-甲酰胺注射液。

[0158] 上述不同规格注射液，可根据神经退行性疾病的进程给予病人静脉注射或肌肉注射，用以治疗疾病。