一种十二温经丸的制备方法及应用

摘要

本发明提供一种十二温经丸的制备方法，由吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、半夏（制）90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g作为原料药制成，采用超临界萃取制备而成，使得有效成分含量增加，服用量减少，本发明还提供了十二温经丸在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用。

权利要求

1.一种十二温经丸在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，其特征在于十二温经丸由吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、制半夏90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠

60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、制半夏90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6％，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，粉碎成细粉，过筛，混匀，每100g粉末加炼蜜50g与适量的水，泛丸，低温干燥，即得

600g水泛丸，每粒丸重0.3g。

2.根据权利要求1所述一种十二温经丸在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，其特征在于十二温经丸制备方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5％。

3.根据权利要求1所述一种十二温经丸在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，其特征在于十二温经丸制备方法中所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度

40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间160min。

说明书

一种十二温经丸的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及中药制剂技术领域，具体涉及一种十二温经丸的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 十二温经丸记载于卫生部标准WS3-B-0005-89，处方为吴茱萸90g、当归60g、川芎（酒制）60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、半夏（制）90g、麦冬120g、甘草（蜜炙）60g，以上十二味，粉碎成细粉，过筛，混匀。每100g粉末加炼蜜50g与适量的水，泛丸，低温干燥，即得，能温经散寒，养血祛瘀。用于冲任虚寒，瘀血阻滞，月经不调，或先或后，或多或少，小腹冷痛以及宫寒不孕。行气活血，制酸止痛。

[0003] 现有技术中，尚未有十二温经丸在提取制备方面采用超临界技术的报道，而采用打粉的方法，工艺粗糙、落后，杂质多，导致患者用量过大，不方便服用，严重影响了本品在临床上应用。

发明内容

[0004] 发明目的：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种十二温经丸的制备方法。

[0005] 本发明的另一个目的在于提供一种十二温经丸在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用。

[0006] 技术方案：本发明的目的是通过如下的方案实现的：

[0007] 一种十二温经丸的制备方法，由吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、半夏（制）90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、半夏（制）90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，粉碎成细粉，过筛，混匀，每100g粉末加炼蜜50g与适量的水，泛丸，低温干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。

[0008] 上述一种十二温经丸的制备方法，所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。

[0009] 上述一种十二温经丸的制备方法，所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间160min。

[0010] 上述十二温经丸在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，十二温经丸由吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、半夏（制）90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g作为原料药制成，其特征在于所述的方法由下列步骤组成：取吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、半夏（制）90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4-6%，萃取压力15-30MPa，温度30-50℃，CO2流量1-3m1/g生药·min，萃取时间150-180min，得超临界萃取物，粉碎成细粉，过筛，混匀，每100g粉末加炼蜜50g与适量的水，泛丸，低温干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。

[0011] 上述十二温经丸在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，十二温经丸制备方法中所述CO2超临界萃取夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%。

[0012] 上述十二温经丸在制备抑制人黑色素瘤细胞M14细胞增殖药物中的应用，十二温经丸制备方法中所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa，温度40℃，CO2流量2ml/g生药·min，萃取时间160min。

[0013] 现有技术中，十二温经丸每丸0.3g，每次6-9g，一日2次，采用本发明制备成的十二温经丸每丸0.3g，但含有的药材量是原来的2倍，因此每次仅需3-4.5g，一日服用2次，在具有更多活性成分的条件下大大减少了服用量，增加了药品的顺应性。

具体实施方式

[0014] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

[0015] 实施例1

[0016] 取吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、半夏（制）90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为4%，萃取压力15MPa，温度30℃，CO2流量1m1/g生药·min，萃取时间150min，得超临界萃取物，粉碎成细粉，过筛，混匀，每
100g粉末加炼蜜50g与适量的水，泛丸，低温干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。

[0017] 实施例2

[0018] 取吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、半夏（制）90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为6%，萃取压力30MPa，温度50℃，CO2流量3m1/g生药·min，萃取时间180min，得超临界萃取物，粉碎成细粉，过筛，混匀，每
100g粉末加炼蜜50g与适量的水，泛丸，低温干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。

[0019] 实施例3

[0020] 取吴茱萸90g、当归60g、酒制川芎60g、白芍60g、阿胶珠60g、肉桂60g、牡丹皮60g、生姜15g、党参60g、半夏（制）90g、麦冬120g、蜜炙甘草60g，加入到CO2超临界萃取器中，乙醇作为夹带剂，夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为5%，萃取压力20MPa，温度40℃，CO2流量2m1/g生药·min，萃取时间160min，得超临界萃取物，粉碎成细粉，过筛，混匀，每
100g粉末加炼蜜50g与适量的水，泛丸，低温干燥，即得600g水泛丸，每粒丸重0.3g。

[0021] 实施例4：十二温经丸抑制M14细胞增殖的实验研究资料

[0022] 1实验材料

[0023] 1.1实验用细胞株

[0024] 人黑色素瘤细胞M14细胞，南京医科大学实验室细胞库，DMEM+10%FBS常规培养。

[0025] 1.2实验药物

[0026] 研究药物：本发明十二温经丸：按实施例3方法制备。

[0027] 药液储液：称取100mg十二温经丸，溶于5ml无水乙醇中，0.2μm滤器过滤，500μldoff管分装，-20℃存储，同时0.2μm滤器过滤无水乙醇以备对照组之用。

[0028] 1.3实验试剂

[0029] DMEM（GIBCO公司Cat.No.12100-061Lot.No.758137）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司Lot.No.100419）；NaHCO3（上海久亿化学试剂有限公司Cat.No.11810-033Lot.No.1088387）；Trypsin（AMRESCO公司批号：2010/04）；EDTA（AMRESCO公司批号：2009/10）；Penicillin G Sodium Salt（AMRESCO公司批号：2010242）；Streptomycin Sulfate（AMRESCO公司批号：2010382）；无水乙醇（南京化学试剂有限公司批号：080310182）；MTT(Biosharp批号：0793);PBS（实验室自配）；

[0030] 1.4实验器材

[0031] 莱卡倒置显微镜（德国Leica型号：DM1L）；可见-紫外光微孔板检测仪（美国MD公司型号：SPECTRA MAX190）；CO2培养箱（FORMA型号：3111）；超净台（苏净集团安泰公司制造型号：SW-CJ-ZFD）；纯水仪（美国Spring公司型号：S/N020579）；精密移液器（法国吉尔森公司型号：P2）；电子天平（德国赛多利斯有限公司型号：BT323S）；全自动高压灭菌锅（日本SANYO公司型号：MLS-3020）；台式电热鼓风干燥箱（上海精密实验设备公司型号：DHG9123A）；冰箱（西门子公司型号：KG18V21TI）；液氮罐（CBS型号：2001）；低速离心机（上海安亭科学仪器厂型号：KA-1000）；0.2μm滤器（MILLIPORE型号：SLGP033RB）；10cm培养皿(NEST公司)、96孔培养板（NEST公司）；细胞计数板；离心管、移液管、Tips若干。

[0032] 2实验方法

[0033] 1）M14细胞用DMEM+10%FBS于37℃、5%CO2进行常规培养（10cm培养皿），当细胞生长至对数期时，收集细胞，弃去培养液，PBS轻洗3遍，加入3ml0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA，37℃消化2min后，向其中加入5ml完全培养基中和反应，吹打细胞后将其转入离心管中，
1000rpm离心5min，调整细胞悬液浓度3×104个/ml。

[0034] 2）将细胞种入96孔培养板中，每孔加入细胞悬液180μl，培养板放入细胞培养箱中（37℃，5%CO2）常规培养。

[0035] 3）根据细胞生长情况，一般长至50%-70%，加入十二温经丸溶液，继续培养24h。

[0036] 4）24h后加入20μl MTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。

[0037] 5）4h后扣板法倒去上清，用吸水纸轻轻拍干，每孔加入200μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。

[0038] 6）同时设置本底（不加细胞，只加培养液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定6个复孔。

[0039] 7）结果以药物对细胞的抑制率表示：

[0040] 细胞增值抑制率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）/对照孔OD值×100%。实验重复3次。

[0041] 3统计处理

[0042] 采用Microsoft Excel2003软件中的相关分析和Student t检验，数据以mean±S.D.表示。