重组人角质细胞因子KGF-2环境敏感型眼部传递系统及其应用

摘要

本发明公开了一种重组人角质细胞因子KGF-2环境敏感型眼部传递系统及其应用。具体涉及一种KGF-2硅质体为核心的环境敏感型眼部传递系统、其制备方法及应用。所述传递系统包含1.2～3.5重量％的KGF-2、1～10重量％的有机-无机复合脂质、6～20重量％的保护剂和1～5重量％的凝胶基质。该KGF-2硅质体采用薄膜水化超声法制备，并进一步制备成环境敏感型眼部传递系统。与现有技术相比，本发明产品可明显提高KGF-2稳定性，延长KGF-2在眼内滞留的时间，有利于KGF-2的吸收和利用，对各类角膜溃疡具有良好的修复作用，也能滋润眼球缓解干眼症症状，同时对眼部疲劳具备良好的舒缓作用，另外亦适用于其他口腔黏膜、粘膜创伤及皮肤美容治疗后的修复。

权利要求

1.一种重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统，包含1.2～3.5重量％的重组人KGF-2蛋白、1～10重量％的有机-无机复合脂质、6～20重量％的保护剂和1～5重量％的凝胶基质，其中所述的重组人KGF-2的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，所述有机-无机复合脂质选自下式1-4中的任一种：

所述保护剂为多糖或烷基葡萄糖苷；所述凝胶基质选自壳聚糖、明胶、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠或它们的任意组合。

2.根据权利要求1所述的环境敏感型眼部传递系统，其中所述多糖选自壳聚糖、果胶或葡聚糖。

3.根据权利要求1所述的环境敏感型眼部传递系统，其中所述的硅质体环境敏感型眼部传递系统为温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型。

4.根据权利要求3所述的环境敏感型眼部传递系统，其中所述的硅质体环境敏感型眼部传递系统为离子敏感型眼部传递系统。

5.根据权利要求1所述的环境敏感型眼部传递系统，其中所述硅质体平均粒径为

100-300nm。

6.根据权利要求5所述的环境敏感型眼部传递系统，其中所述硅质体平均粒径为

150nm。

7.一种制备权利要求1所述的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统的方法，所述方法包含以下步骤：(1)表达并纯化重组人KGF-2蛋白；

(2)利用选自下式1-4中的任一种的有机-无机复合脂质制备空白硅质体：(3)将步骤(2)制备的空白硅质体、(1)得到的重组人KGF-2蛋白和蛋白保护剂在4℃孵育，制成重组人KGF-2硅质体，所述重组人KGF-2硅质体的粒径在100～300nm范围内；

然后

(4)利用步骤(3)制得的重组人KGF-2硅质体配制KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递凝胶。

8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(2)的空白硅质体通过薄膜水化超声法或乙醇溶胶注入法制备。

9.权利要求1的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备用于治疗受试者中的角膜损伤或病变的药物中的应用，其中所述角膜损伤或病变选自角膜上皮缺损和点状角膜病变、复发性浅层点状角膜病变、轻中度干眼症、大泡性角膜炎、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良或地图状或营养性单庖性角膜溃疡。

10.权利要求1的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备美容剂中的应用。

说明书

重组人角质细胞因子KGF-2环境敏感型眼部传递系统及其

应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程药物制剂领域，公开了一种重组人角质细胞因子KGF-2环境敏感型眼部传递系统及其应用。具体涉及一种以KGF-2硅质体为核心的环境敏感型眼部传递系统、其制备方法及应用。该KGF-2硅质体采用薄膜水化超声法制备，并进一步制备成环境敏感型眼部传递系统。

背景技术

[0002] 角质细胞生长因子-2(KGF-2)是成纤维细胞生长因子家族中第10个成员，是机体内自身存在的多肽生长因子，KGF-2为单拷贝基因，由3个外显子和2个内含子组成，定位于15号染色体，是一条单链多肽，含有5个半胱氨酸残基，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个半胱氨酸在折叠的肽中，为β2三叶草型。

[0003] 临床上KGF-2可以用于治疗多种表皮损伤相关疾病。美国Human Genome Sciences公司开发的KGF-2用于治疗癌症患者骨髓移植前高剂量化疗引起的黏膜炎、溃疡性结肠炎、慢性静脉溃疡，已进入II期临床试验研究。国内上海新生源公司开发的KGF-2用于烧烫伤的治疗，进入III期临床。然而，KGF-2蛋白的生物制备主要存在两大缺陷：(1)KGF-2普遍表达量低(以大肠杆菌为宿主菌，表达量不足菌体总蛋白的5重量％)，这严重制约了该药的规模化生产并造成了产品的价格非常昂贵，影响了其广泛使用；(2)KGF-2与其他蛋白药物一样对热和酸均不稳定，在体内的半衰期仅为数分钟，全身应用则会被快速灭活而难以发挥其有效作用，局部穿刺给药对深部神经有损伤且难以保证每次释药部位的准确性，且不适宜长期用药。

[0004] 角膜位于眼球前面，质地透明表面光滑无血管，直接与外界接触，易受损伤和感染，因而角膜疾病较为多见，也是致盲的重要原因。常见的外伤性角膜上皮缺损由化学烧伤、机械擦伤、手术等多原因引起，如果不能得到及时有效的治疗，重者可导致角膜溃疡或融解，甚至发生穿孔，严重影响视功能。传统的治疗方法虽有一定效果，但仍不够理想。感染性角膜炎临床上主要是采用抗生素疗法，控制感染后靠内源性生长因子促进角膜愈合，但愈合质量差，而且病程长。临床研究发现创面越迟愈合越容易形成瘢痕。因角膜没有血管，基质的修复过程比其他组织缓慢，所以使伤口尽快愈合就显得十分重要，而KGF-2可加快上皮及基质细胞的增殖，对瘢痕的减少有积极的意义。

[0005] 目前临床上可供选用的促角膜上皮损伤修复的有效药物并不多见，国内市场上基因工程药物主要是贝复舒(重组牛bFGF滴眼剂)和金因舒(重组人EGF滴眼剂)。贝复舒开创了国内治疗角膜上皮损伤药物的新纪元，主药是重组牛bFGF，该药在临床上用于因角膜上皮损伤引起的重症干眼症的治疗取得很好的疗效。但重组牛bFGF，因是牛源基因，对人的适应性差，不适合长期用药。金因舒开创了“主动修复”的新纪元，主要药效成分是重组人表皮生长因子衍生物(rhEGF)，适用于各种原因引起的角结膜上皮损伤的修复、各种内眼术后眼表的重建及限表护理。但bFGF和EGF在促进角膜上皮损伤愈合的同时，也会促进新生血管的生长，愈合后留有薄翳、斑翳或白斑，对视力有不同程度影响。虽然角膜细胞可分泌一定的KGF-2，但及时修复仍需补充外源性的KGF-2，以促进基质细胞的增殖和移行。鉴于KGF-2对上皮组织具有高度特异性，同时对对损伤引起的角膜新生血管的生长没有促进作用，这与目前上市的生长因子类滴眼液相比，KGF-2优势明显。

[0006] 硅质体是一种新的制剂技术和药物载体，它结合了脂质体和二氧化硅载体的优点，同时克服了它们各自的缺陷，是目前比较理想的一种药物载体。硅质体与传统的脂质体囊泡相比，是一种非常稳定的囊泡结构，是有机-无机的杂化材料。它是由含有硅醚基团的类脂质化合物(即，有机-无机复合脂质)在水溶液中，经过溶胶-凝胶(sol-gel)自组装过程，聚集形成稳定形态的双层囊泡。同时囊泡表面包裹一层三维网状硅酸盐的结构，用稳定的Si-C键将无机层和有机二分子体连接在一起。结构上的这一特点，使囊泡具有很高的稳定性。本发明用有机-无机复合脂质来包裹KGF-2，对制备方法和制备工艺进行了优化，开发出了具有高稳定性、缓释特性的KGF-2硅质体眼部智能传递系统，对KGF-2的临床应用具有重大意义。

[0007] 本项目课题组前期利用SUMO融合蛋白表达系统实现了KGF-2的高效表达，在此技术上采用制剂学新技术制备了KGF-2硅质体，并进一步制备成环境敏感型智能眼部给药系统，活性保存率超过50％，半衰期延长6倍以上。(美国人类基因组公司喷雾剂进入II期临床试验E.coli系统表达量4.8％，Nham SU et al.Biotechnol Lett，1990，16(7)：661-7.；TM
美国Amgen公司静脉注射液Kepivance E.coli系统表达量4.2％，Zazo M.et al.Gene，
1992，113(2)：231-7；上海新生源、温州医学院，冻干粉进入III临床E.coli系统表达量
4.5％酵母系统表达量3.7％)。实验证实KGF-2硅质体眼部智能传递系统对各种原因引起的角膜上皮缺损和点状角膜病变，复发性浅层点状角膜病变、轻中度干眼症、大泡性角膜炎、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良、地图状(或营养性)单庖性角膜溃疡等有修复治疗作用。

发明内容

[0008] 本发明公开了一种重组人角质细胞因子KGF-2环境敏感型眼部传递系统及其应用。具体涉及一种KGF-2硅质体为核心的环境敏感型眼部传递系统、其制备方法及应用。该KGF-2硅质体采用薄膜水化超声法或乙醇溶胶注入法制备，并进一步制备成环境敏感型眼部传递系统。与现有技术相比，本发明产品可明显提高KGF-2稳定性，延长KGF-2在眼内滞留的时间，有利于KGF-2的吸收和利用。对各类角膜溃疡具有良好的修复作用，也能滋润眼球缓解干眼症症状，同时对眼部疲劳具备良好的舒缓作用，另外亦适用于其他口腔黏膜、粘膜创伤及皮肤美容治疗后的修复。

[0009] 在第一方面中，本发明提供了一种重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统，所述系统包含1.2～3.5重量％的KGF-2、1～10重量％的有机-无机复合脂质、6～20重量％的保护剂和1～5重量％的凝胶基质。

[0010] 其中所述的重组人KGF-2选自基因工程发酵纯化提取的KGF-2，其宿主菌选自大肠杆菌BL21(DE3)、BL21(DE3)rosatta、BL21(DE3)plyss，优选BL21(DE3)菌株。用于本发明的重组人KGF-2的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

[0011] 其中所述的有机-无机复合脂质选自下式1-4中的任一种：

[0012]

[0013] 其中所述保护剂为多糖类，如壳聚糖、果胶、葡聚糖(如右旋糖苷、烷基葡萄糖苷、)；所述凝胶基质选自壳聚糖、明胶、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠或它们的任意组合。

[0014] 本发明提供的KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统可以为温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型，优选离子敏感型眼部传递系统。

[0015] 在本发明提供的KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统，其中所述KGF-2硅质体平均粒径为100-300nm，优选150nm。

[0016] 在第二方面中，本发明提供的一种制备KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统的方法，所述方法包括以下步骤：

[0017] (1)表达并纯化重组人KGF-2蛋白；

[0018] (2)利用选自下式1-4中的任一种的有机-无机复合脂质制备重组人KGF-2硅质体：

[0019]

[0020]

[0021] ①通过下述任一种方法制备空白硅质体：

[0022] (a)薄膜水化超声法：

[0023] 取5mg所述有机-无机复合脂质，将其溶解在2mL pH＝3的酸性乙醇中室温孵育1小时，再将其转移到100mL圆底烧瓶中，加入3mL氯仿溶液，充分混匀；利用旋转蒸发仪在
55℃条件下，缓慢将有机溶剂蒸出，此时在圆底烧瓶底部形成一层均匀的白色薄膜；将圆底烧瓶放入真空干燥箱中干燥过夜；次日，在圆底烧瓶中加入15mL超纯水，然后放入水浴锅中55℃恒温水浴20分钟，使薄膜充分水化。水浴超声15分钟，再用探头超声5分钟(振幅为2.0，超声3秒停止3秒)得到空白硅质体悬液；或

[0024] (b)乙醇溶胶注入法：

[0025] 首先在20℃条件下，将所述有机-无机复合脂质在酸性乙醇溶液中孵育0.5～2h；然后在室温下将硅烷头部水解后的溶胶注入到乙醇/水(1：9v/v)中，注入后在50℃条件下孵育24小时制备硅质体；

[0026] ②将步骤①制备的空白硅质体、步骤(1)得到的重组人KGF-2蛋白和蛋白保护剂在低温(4℃)下孵育过夜，制成重组人KGF-2硅质体，所述重组人KGF-2硅质体的粒径在100～300nm范围内；然后

[0027] (3)利用步骤(2)制得的重组人KGF-2硅质体配制KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递凝胶：

[0028] (i)普通温敏凝胶基质的制备：

[0029] 壳聚糖/明胶/甘油磷酸钠体系：以体积比为10：0.5：2.0的壳聚糖/明胶/甘油磷酸钠体系空白凝胶；按比例加入2重量％壳聚糖溶液和0.5重量％明胶溶液，逐滴加入56重量％甘油磷酸钠并混匀，制成空白凝胶基质；

[0030] 泊洛沙姆体系：18重量％P-407、5重量％P-188和0.6重量％羟丙基甲基纤维素(HPMC)

[0031] 准确称取配方量的P407(泊洛沙姆407)、P188(泊洛沙姆188)和HPMC(羟丙基甲基纤维素)，加入柠檬酸缓冲液(pH4.0)，边加边搅拌，之后将其放入冷库中(4-10℃)，间歇搅拌，待颗粒完全溶胀后高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，置于4℃存放；

[0032] (ii)载有重组KGF-2温敏凝胶的制备

[0033] 在4℃条件下将已制备好的KGF-2硅质体缓慢加入到步骤(i)制备的空白凝胶基质中，KGF-2硅质体与空白凝胶基质的质量比为1：100～1：10，边加边搅拌，混合均匀即得重组KGF-2硅质体环境敏感型凝胶。

[0034] 在本发明的一个优选的实施方案中，所述重组人KGF-2硅质体可以通过下述步骤制备：

[0035] (a1)称取3mg选自式1-4的任一种的有机-无机复合脂质在pH＝3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中，旋干后溶于适量的氯仿，再缓慢旋转蒸发(55℃水浴，90r/min)除去溶剂，溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿；

[0036] (a2)向步骤(a1)的圆底烧瓶中加入总体积4～5mL的包含超纯水、KGF-2和果胶(作为蛋白保护剂)的水溶液(其中所述无机-有机复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10：1，果胶与重组人KGF-2的摩尔比例为3：1)，将烧瓶放在37℃的恒温水浴锅中使薄膜充分水化30min，然后水浴超声，形成多室囊泡；最后用探头超声仪冰水浴超声5min(0℃，振幅20，间隔为3s)至溶液充分分散形成稳定体系，即得到KGF-2硅质体悬液；

[0037] (a3)将步骤(a2)中制得的KGF-2硅质体悬液依次过0.8μm、0.45μm和0.22μm膜，调整KGF-2硅质体的粒径在100～300nm范围内。

[0038] 在本发明的另一个优选的实施方案中，所述重组人KGF-2硅质体还可以通过下述步骤制备：

[0039] (b1)称取3mg有机-无机复合脂质在pH＝3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中，旋干后溶于适量的氯仿，再缓慢旋转蒸发(55℃水浴，90r/min)除去溶剂，溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿；

[0040] (b2)将粒径均一(100nm～2μm)的模板微球溶液(模板微球为可去除的模板材料，选自三聚氰胺甲醛树脂(MF)胶体颗粒、SiO2颗粒、CaCO3颗粒等)加入到步骤(b1)的脂质薄膜中，孵育1～5h后，进行水浴超声；

[0041] (b3)超声后得到的溶液室温静置，待模板微球表面形成无机硅酸盐壳层，用物理或化学的方法除去模板微球得到空白硅质体；

[0042] (b4)向步骤(b3)制得的空白硅质体中加入总体积4～5mL的包含超纯水、重组人KGF-2和葡聚糖400(作为蛋白保护剂)的水溶液(所述无机-有机复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10：1，葡聚糖400与KGF-2的摩尔比例为3：1)，与空白硅质体在4℃过夜孵育。

[0043] 在本发明的一个优选实施方案中，提供一种制备KGF-2硅质体离子敏感型眼部传递系统的方法，所述方法包含以下步骤：

[0044] (1)表达并纯化重组人KGF-2蛋白：采用SUMO融合蛋白表达系统，在大肠杆菌宿主菌中表达重组人KGF-2蛋白，纯化得到重组人KGF-2蛋白；

[0045] (2)制备重组人KGF-2硅质体：

[0046] (a’)称取3mg选自式1-4中任一种的有机-无机复合脂质在pH＝3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中，旋干后溶于适量的氯仿，再缓慢旋转蒸发(55℃水浴，90r/min)除去溶剂，溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿；

[0047] (b’)向步骤(a’)的烧瓶中加入总体积4～5mL的包含超纯水、KGF-2和蛋白保护剂的水溶液(所述复合脂质与重组人KGF-2摩尔比为10：1，蛋白保护剂与KGF-2的摩尔比例为3：1)，将烧瓶放在37℃的恒温水浴锅中使薄膜充分水化30min，然后水浴超声，形成多室囊泡；最后用探头超声仪冰水浴超声5min(0℃，振幅20，间隔为3s)至溶液充分分散形成稳定体系，即得到KGF-2硅质体悬液；

[0048] (c’)将步骤(b’)中制得的KGF-2硅质体悬液依次过0.8μm、0.45μm和0.22μm膜，调整粒径在100～300nm范围内；

[0049] (3)使用步骤(2)中制得的重组人KGF-2硅质体以2重量％海藻酸钠为凝胶基质制备离子敏感型眼用凝胶。

[0050] 在本发明的另一个优选实施方案中，提供的一种制备KGF-2硅质体温度敏感型眼部传递系统的制备方法，所述方法包含以下步骤：

[0051] (1)表达并纯化重组人KGF-2蛋白：采用SUMO融合蛋白表达系统，在大肠杆菌宿主菌中表达重组人KGF-2蛋白，纯化得到重组人KGF-2蛋白；

[0052] (2)利用选自式1-4中的任一种的有机-无机复合脂质制备重组人KGF-2硅质体：

[0053] (a”)称取3mg有机-无机复合脂质在pH＝3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中，旋干后溶于适量的氯仿，再缓慢旋转蒸发(55℃水浴，90r/min)除去溶剂，溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿，制得复合脂质薄膜；

[0054] (b”)将粒径均一(粒径为100nm～2μm)的模板微球溶液(其中所用的模板材料是可去除的，可选自三聚氰胺甲醛树脂(MF)胶体颗粒、SiO2颗粒、CaCO3颗粒等)加入到步骤(a”)中制得的脂质薄膜中，孵育1～5h后，进行水浴超声；

[0055] (c”)将超声后得到的溶液室温静置，待模板微球表面形成无机硅酸盐壳层后，用物理或化学的方法除去模板微球得到空白硅质体；

[0056] (d”)向步骤(c”)制得的空白硅质体中加入总体积4～5mL的包含超纯水、重组人KGF-2和烷基葡萄糖苷的水溶液(其中，所述复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10：1，蛋白保护剂与重组人KGF-2的摩尔比为3：1)，与空白硅质体在4℃过夜孵育；

[0057] (3)使用步骤(2)中制得的重组人KGF-2硅质体以泊洛沙姆为基质制备温度敏感型眼用凝胶。

[0058] 本发明还提供重组人KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备用于治疗受试者中的角膜损伤或病变的药物中的应用，其中所述角膜损伤或病变为各种原因引起的角膜损伤或病变，包括但不限于，角膜上皮缺损和点状角膜病变，复发性浅层点状角膜病变、轻中度干眼症、大泡性角膜炎、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良、地图状(或营养性)单庖性角膜溃疡等。

[0059] 本发明还提供治疗受试者中的角膜损伤或病变的方法，所述方法包括给所述受试者施用有效量的本发明的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统。

[0060] 其中所述角膜损伤或病变包括各种原因引起的角膜损伤或病变，包括但不限于，角膜上皮缺损和点状角膜病变，复发性浅层点状角膜病变、轻中度干眼症、大泡性角膜炎、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良、地图状(或营养性)单庖性角膜溃疡等。

[0061] 本发明提供的重组人KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统，为局部药物制剂，其也可以用于口腔黏膜、其他黏膜创伤的修复。因此，本发明还提供重组人KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备用于修复黏膜创伤的试剂盒中的应用，其中所述粘膜创伤包括但不限于，口腔黏膜创伤，鼻窦粘膜创伤等。

[0062] 本发明提供的重组人KGF-2硅质体环境敏感型制剂也可以制成美容剂用在美容中。

[0063] 综上所述，本发明提供下述：

[0064] 1.一种重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统，包含1.2～3.5重量％的重组人KGF-2蛋白、1～10重量％的有机-无机复合脂质、6～20重量％的保护剂和1～5重量％的凝胶基质。

[0065] 2.根据第1项所述的环境敏感型眼部传递系统，其中所述的重组人KGF-2的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

[0066] 3.根据第1项所述的环境敏感型眼部传递系统，其中所述有机-无机复合脂质选自下式1-4中的任一种：

[0067]

[0068] 其中所述保护剂为多糖类，如壳聚糖、果胶、葡聚糖(如右旋糖苷、烷基葡萄糖苷)；所述凝胶基质选自壳聚糖、明胶、泊洛沙姆407、泊洛沙姆188、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、海藻酸钠或它们的任意组合。

[0069] 4.根据第1项所述的环境敏感型眼部传递系统，其中所述的硅质体环境敏感型眼部传递系统为温度敏感型、pH敏感型或离子敏感型，优选离子敏感型眼部传递系统。

[0070] 5.根据第1项所述的环境敏感型眼部传递系统，其中所述硅质体平均粒径为100-300nm，优选150nm。

[0071] 6.一种制备第1项所述的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统的方法，所述方法包含以下步骤：

[0072] (1)表达并纯化重组人KGF-2蛋白；

[0073] (2)利用选自下式1-4中的任一种的有机-无机复合脂质制备空白硅质体：

[0074]

[0075] (3)将步骤(2)制备的空白硅质体、(1)得到的重组人KGF-2蛋白和蛋白保护剂在低温(4℃)下孵育，制成重组人KGF-2硅质体，所述重组人KGF-2硅质体的粒径在100～300nm范围内；然后

[0076] (4)利用步骤(3)制得的重组人KGF-2硅质体配制KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递凝胶。

[0077] 7.根据第6项所述的方法，其中步骤(2)的空白硅质体通过薄膜水化超声法或乙醇溶胶注入法制备。

[0078] 8.第1项的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备用于治疗受试者中的角膜损伤或病变的药物中的应用，其中所述角膜损伤或病变为各种原因引起的角膜损伤或病变，包括，角膜上皮缺损和点状角膜病变、复发性浅层点状角膜病变、轻中度干眼症、大泡性角膜炎、角膜擦伤、轻中度化学烧伤、角膜手术及术后愈合不良或地图状(或营养性)单庖性角膜溃疡。

[0079] 9.第1项的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统在制备美容剂中的应用。

[0080] 10.一种用于治疗受试者中的角膜损伤或病变的方法，所述方法包括向所述受试者的损伤或病变处施用有效性的权利要求1所述的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统。

附图说明

[0081] 从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：

[0082] 图1显示使用本发明的重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼用凝胶的碱烧伤后兔角膜半定量损伤修复率(％)。其中烧伤阴性对照组使用等量的生理盐水，阳性(bFGF滴眼液)对照组使用有效量的贝复舒滴眼液，实验组分别使用不同剂量的实施例五制备的重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼部给药系统。

[0083] 图2显示使用本发明的重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼用凝胶的碱烧伤后角膜新生血管的形成。其中烧伤阴性对照组使用等量的生理盐水，阳性(bFGF滴眼液)对照组使用有效量的贝复舒滴眼液，实验组分别使用不同剂量的实施例五制备的重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼部给药系统。

具体实施方式

[0084] 下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。

[0085] 实施例一、重组人KGF-2蛋白的表达和纯化

[0086] 采用SUMO融合蛋白表达系统，利用大肠杆菌表达宿主，使用LB培养液发酵，菌体破碎液通过阳离子交换层析、肝素亲和层析柱、HPLC进行分离，收集得到纯化的重组人KGF-2蛋白。其中重组人KGF-2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

[0087] 先使用分子伴侣SUMO作为表达rhKGF-2的融合标签，该标签一方面可以改善目的蛋白的溶解性和帮助其正确折叠，以达到获得大量可溶性融合蛋白的目的，而且还能大大提高rhKGF-2的表达率，有利于进行大规模的发酵生产。具体可参见文献(提供 相 关 的 文 献 )(Molecular Biotechnology.01/2009；42(1)：68-74.DOI：10.1007/s12033-008-9135-7)。

[0088] 实施例二、重组人KGF-2硅质体的制备

[0089] (a)称取3mg选自式1-4中任一项的有机-无机复合脂质在pH＝3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中，旋干后溶于适量的氯仿，再缓慢旋转蒸发(55℃水浴，90r/min)除去溶剂，溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿；

[0090] (b)加入总体积4～5mL的超纯水、重组人KGF-2的水溶液(其中所述复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10：1)以及烷基葡萄糖苷(烷基葡萄糖苷作为蛋白保护剂，其中所述的烷基葡萄糖苷与重组人KGF-2的摩尔比为3：1)，将烧瓶放在50℃的恒温水浴锅中使薄膜充分水化30min，然后水浴超声，形成多室囊泡；最后用探头超声仪超声5min(振幅20，间隔为3s)至溶液充分分散形成稳定体系，即得到KGF-2硅质体悬液；

[0091] (c)将步骤(c)中制得的KGF-2硅质体悬液依次过0.8μm、0.45μm和0.22μm膜，调整KGF-2硅质体的粒径在100～300nm范围内。

[0092] 实施例三、重组人KGF-2硅质体的制备

[0093] (a)称取3mg选自式1-4中任一项的有机-无机复合脂质在pH＝3的盐酸乙醇溶液中酸化后置于25mL圆底烧瓶中，旋干后溶于适量的氯仿，再缓慢旋转蒸发(55℃水浴，90r/min)除去溶剂，溶剂蒸发完以后再旋转30min以充分除去痕量氯仿；

[0094] (b)将粒径均一(粒径为100nm～2μm)的模板微球溶液(即，SiO2颗粒)加入到脂质薄膜中，孵育3h后，进行水浴超声；

[0095] (c)超声后得到的溶液室温静置，待模板微球表面形成无机硅酸盐壳层后，用物理或化学的方法除去模板微球得到空白硅质体；

[0096] (d)加入总体积4～5mL的超纯水、重组KGF-2和蛋白保护剂的水溶液(其中复合脂质与重组人KGF-2的摩尔比为10：1，蛋白保护剂与重组人KGF-2的摩尔比为3：1)与空白硅质体在4℃过夜孵育，即得到KGF-2硅质体悬液。

[0097] 实施例四、重组人KGF-2硅质体离子敏感型眼部给药系统的制备

[0098] 海藻酸钠和羟丙基甲基纤维素(HPMC)组成离子敏感型凝胶基质。

[0099] 以1重量％的海藻酸钠和8重量％的HPMC在搅拌下加入适量注射用水，另取羟苯乙酯(0.03重量％)溶于适量热水后加入，待混匀放凉后，再加入氯化钠(0.68重量％)，得到的空白凝胶100℃，流通蒸汽灭菌30min，备用。

[0100] 空白凝胶基质加入实施例二中的KGF-2硅质体(其中在制得的凝胶剂中KGF-2硅质体的含量为10重量％)，混合均匀，加注释用水至足量。并分装。此过程严格无菌操作。

[0101] 实施例五、KGF-2硅质体温度敏感型眼部给药系统的制备

[0102] 采用冷法，制备KGF-2硅质体温度敏感型凝胶。

[0103] 21重量％泊洛沙姆407、5重量％泊洛沙姆188(购自德国BASF公司)和0.10重量％透明质酸(购自山东福瑞达)组成稳定敏感型凝胶基质。防腐剂采用羟苯乙酯(0.03重量％)，氯化钠调等渗。先制备空白凝胶基质，100℃，流通蒸汽灭菌30min，备用。

[0104] 此空白凝胶基质加入实施例三中的KGF-2硅质体(其中在制得的凝胶剂中KGF-2硅质体的含量为15重量％)，混合均匀，加注释用水至足量。并分装。此过程严格无菌操作。

[0105] 实施例六、重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼部给药系统(实施例五)药效学研究

[0106] I.材料与方法

[0107] ①动物模型的构建：

[0108] 碱烧伤模型：日本大耳白兔用速眠新II注射液按0.2～0.3ml/kg肌肉注射麻醉，局部用1重量％盐酸丁卡因滴眼液点眼表面麻醉后，将直径6mm的滤纸片浸入0.5mol/L NaOH溶液中3秒钟后取出，贴于角膜表面，计时30s后取下，于角膜中央造成瓷白色圆形烧伤斑。

[0109] ②实验分组

[0110] 阴性对照组：给药等量的生理盐水

[0111] 实验组：给予不同剂量的实施例五制备的重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼部给药系统，其中给予的KGF-2含量为：

[0112] KGF-2 12.5μg/ml组

[0113] KGF-2 25μg/ml组

[0114] KGF-2 50μg/ml组

[0115] KGF-2 100μg/ml组

[0116] 阳性对照组：给药有效量的贝复舒滴眼液(珠海亿胜生物制药有限公司批号：20120601，21000IU/5ml/瓶，浓度约为2.5μg/ml(1ng相当于1.7IU)。)③观察指标[0117] A.动物整体观察

[0118] 烧伤后1～14d(天)，每日观察各组动物恢复状况、角膜临床表现，包括结膜囊内分泌物、结膜充血、角膜和结膜水肿、角膜烧伤斑混浊程度以及角膜新生血管形成等。

[0119] B.裂隙灯观察及角膜照相

[0120] 于兔角膜碱烧伤前及伤后即刻、7d和14d行眼科裂隙灯观察及角膜彩色照相，记录角膜烧伤斑的病程变化。应用SLM型眼科裂隙灯自带软件对烧伤斑在不同时间点的面积、平均灰度进行测量。经SAS软件统计处理，定量分析不同实验组角膜烧伤斑的修复情况。

[0121] 此外，对数码相机拍摄的角膜相片进行电脑图像分析，采用半定量方法确定角膜损伤修复率(％)。

[0122] C.病理组织学观察

[0123] 于兔角膜碱烧伤后1d、7d和14d在体分离角膜，制备病理组织学切片，光镜下观察。

[0124] D.角膜透光率OD值测定

[0125] 分别于兔角膜碱烧伤后7d、14d时将动物处死，沿角巩膜缘剪取角膜，分光光度计560nm波长下在损伤斑区域从上向下沿轴心均匀测定10个点，再将角膜倒转90°测定10个点，总计每只角膜测定20个点。

[0126] E.MTT法检测角膜上皮活性

[0127] 分别于兔角膜碱烧伤后7d、14d时将动物处死，用直径6mm的角膜环钻钻取烧伤部位的前1/3板层角膜，培养于含2ml10％胎牛血清DMEM培养液的24孔板中，37℃孵箱孵育1h后，每孔加入新配制的MTT工作液(5mg/ml)200μl，37℃恒温摇床振摇4～6h，每孔加入
2ml含10％SDS的10nmol/L HCl中止反应，37℃孵箱中过夜，混匀后吸取100μl加于96孔培养板中，设5个复孔，酶联免疫仪测定492nm处的光吸收值，每个样品重复测量3次。

[0128] II.重组人KGF-2硅质体温度敏感型限用凝胶促进兔角膜上皮损伤修复试验[0129] 建立兔角膜碱烧伤模型，模型动物随机分为5组，即KGF-2硅质体温度敏感型眼用凝胶低、中和高三个剂量组、赋形剂对照组(阴性对照组)和bFGF滴眼液组(阳性对照组，其中bFGF滴眼液为购自珠海亿胜生物科技有限公司的贝复舒滴眼液)，每组8只，雌雄各半。每天滴眼四次，连续3周。观察KGF-2硅质体温度敏感型眼用凝胶是否可阻断机体的免疫应答、感染、炎症反应，抑制角膜新生血管的形成及促进角膜上皮细胞的恢复。

[0130] II.1下表1显示使用本发明的重组人KGF-2硅质体温度敏感型眼用凝胶的激光烧伤后兔角膜半定量损伤修复率。

[0131] 表1和图1为碱烧伤后兔角膜半定量损伤修复率情况，结果显示，与烧伤对照组相比，伤后7d，bFGF2.5μg/ml组和各剂量KGF-2组均有显著性差异；伤后14d，bFGF2.5μg/ml组和KGF-225μg/ml组与烧伤对照组有显著性差异。与bFGF2.5μg/ml组相比，伤后7d，烧伤对照组和各剂量KGF-2组均有显著性差异，bFGF2.5μg/ml组明显优于其它各组；伤后14d，bFGF2.5μg/ml组明显优于烧伤对照组和KGF-212.5μg/ml组，而与KGF-225μg/ml组和KGF-250μg/ml组间无显著性差异。

[0132] 表1碱烧伤后兔角膜半定量损伤修复率(％)

[0133]

[0134] 注：与同一时间点碱烧伤阴性对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01# ##

[0135] 与同一时间点bFGF2.5μg/ml组比较，P＜0.05，P＜0.01

[0136] 另外，从图1可以看到，碱烧伤后7d，bFGF2.5μg/ml治疗组的损伤修复率高于烧伤对照组和各剂量KGF-2组，14d时，bFGF2.5μg/ml治疗组与KGF-225μg/ml治疗组间无显著性差异，二者促进角膜损伤修复的作用相当。

[0137] II.2裂隙灯显微镜观察结果

[0138] 角膜新生血管的形成：经眼科裂隙灯显微镜观察，计数损伤后角膜新生血管的形成，并对记录数据进行综合计数统计，结果参见表2和图2、8。碱烧伤后，与烧伤对照组相比，伤后1-w，KGF-212.5μg/ml组的角膜新生血管发生率有显著性差异，二者分别为17.5％(14/80)和4.17％(1/24)；与2.5μg/ml bFGF-2组相比，烧伤对照组和各剂量KGF-2组均无显著性差异。碱烧伤后2-w，无论与碱烧伤对照组还是2.5μg/ml bFGF-2组相比较，各组之间均无明显的统计学差异。

[0139] 表2碱烧伤后兔角膜新生血管发生率(％)

[0140]

[0141]

[0142] 注：与同一时间点碱烧伤阴性对照组比较，*P＜0.05

[0143] 从以上结果可以看出，在兔角膜碱烧伤模型中，本发明的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体温度敏感型眼部传递系统与阳性bFGF滴眼液组一样有效。本发明的重组人角质细胞因子KGF-2硅质体环境敏感型眼部传递系统可以用于治疗各种原因引起的角膜损伤或病变。

[0144] 应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。