一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料及其制备方法

摘要

本发明公开了一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料及其制备方法。具体包括如下步骤：(a)丝素蛋白膜的制备；(b)纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备；所述复合膜材料中纳米羟基磷灰石的尺寸为10-500nm。本发明开发了一种新的制备工艺简单的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，解决了羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料力学性能差的问题，其制得的复合膜材料可生物降解，对人体无害，是一种理想的生物医用材料。

权利要求

1.一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(a) 丝素蛋白膜的制备：蚕丝经脱胶、干燥得到丝素纤维，丝素纤维经溶解得到再生丝素蛋白溶液；再生丝素蛋白溶液经过透析、过滤，制备成质量浓度为0.1%～60%的丝素蛋白水溶液；然后将丝素蛋白水溶液与无机钙盐混合，搅拌均匀，再制备得到无机钙盐/丝素蛋白膜；

(b) 复合膜材料的制备：将磷酸盐配制成质量浓度为0.05mol/L～饱和的磷酸盐水溶液，并调节磷酸盐水溶液pH值为4～11；然后将步骤(a)制备的无机钙盐/丝素蛋白膜放入磷酸盐水溶液中，经过室温静置陈化、水洗、干燥，获得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料；调节磷酸盐水溶液pH值的试剂为氨水、氢氧化钠或者盐酸；

所述无机钙盐选自CaCl2、Ca(NO3)2中的一种；磷酸盐选自(NH4)2HPO4、Na3PO4、K2HPO4中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)中无机钙盐/丝素蛋白膜中丝素蛋白和无机钙盐的质量比为99∶1～

10∶90。

3.根据权利要求1所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)中静置陈化反应时间为0.5～30天，干燥温度为20～120℃，干燥时间为1～72h。

4.一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(a) 丝素蛋白膜的制备：蚕丝经脱胶、干燥得到丝素纤维，丝素纤维经溶解得到再生丝素蛋白溶液；再生丝素蛋白溶液经过透析、过滤，制备成质量浓度为0.1%～60%的丝素蛋白水溶液；然后将丝素蛋白水溶液与磷酸盐混合，搅拌均匀，再制备得到磷酸盐/丝素蛋白膜；

(b) 复合膜材料的制备：将无机钙盐配制成质量浓度为0.05mol/L～饱和的无机钙盐水溶液，并调节无机钙盐水溶液pH值为4～11；然后将步骤(a)制备的磷酸盐/丝素蛋白膜放入无机钙盐水溶液中，经过室温静置陈化、水洗、干燥，获得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料；调节无机钙盐水溶液pH值的试剂为氨水、氢氧化钠或者盐酸；

所述无机钙盐选自CaCl2、Ca(NO3)2中的一种；磷酸盐选自(NH4)2HPO4、Na3PO4、K2HPO4中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)磷酸盐/丝素蛋白膜中丝素蛋白和磷酸盐的质量比为99∶1～

10∶90。

6.根据权利要求4所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)中静置陈化反应时间为0.5～30天，干燥温度为20～120℃，干燥时间为1～72h。

7.根据权利要求1或者4所述的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(b)中制备的复合膜材料中纳米羟基磷灰石的粒径为10～500nm。

8.根据权利要求1或者4所述纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法制备得到的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料。

说明书

一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种复合膜材料及其制备方法，具体涉及一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料及其制备方法，制备的复合膜材料可应用于骨组织工程的修复与替代。

背景技术

[0002] 骨损伤和骨缺损的治疗和修复是骨科临床常见的难症之一。传统的治疗方式是进行自体或异体骨移植进行修复治疗，自体骨移植效果好，但存在供应有限及二次手术的缺点，另外异体骨移植存在免疫原性(免疫排斥)以及传播传染病的风险。利用生物材料进行治疗，可根据骨修复或缺损情况任意塑形达到完善的形态修复，并经体外细胞培养扩增，最终实现无损伤修复，可避免传统治疗方式的缺点。

[0003] 目前可用于骨修复或替代的生物材料主要有：医用金属材料、医用生物陶瓷、医用高分子材料和医用复合材料等，其中医用生物陶瓷材料因在人体内理化性能稳定、具有良好的生物活性和生物相容性、性能可通过成分设计进行控制、容易成型和着色而得到重要关注。

[0004] 羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HAp，Ca10(PO4)6(OH)2)是脊椎动物的骨和齿的主要成分，所以这一种以钙、磷元素为主组成人工合成的陶瓷具有良好生物活性和生物相容性，它们在生理环境中可被逐渐地降解吸收，并随之为新生组织替代，从而达到修复或替换被损坏组织的目的。但纯羟基磷灰石材料较脆，弯曲强度低，几乎没有韧性，为了改善羟基磷灰石陶瓷的力学性能，金属、陶瓷、聚合物等都被用来与之复合，以期得到一种理想的骨修复材料，其中将纳米羟基磷灰石与具有骨诱导活性的有机大分子复合构建改善其性能已成为当前的研究趋势。

[0005] 丝素蛋白具有良好的生物相容性，可控的生物降解性，并且由于丝素蛋白分子链含有极性基团，该基团与无机材料有良好的相容性，能提高羟基磷灰石的韧性，所以将羟基磷灰石和丝素蛋白复合，可获得生物相容性和生物活性良好的骨修复或替代的复合材料。

[0006] 在本发明作出之前，中国专利申请CN201010618923.5公开了一种羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料，其制备过程首先将硝酸钙和硅酸钠混合反应，将反应产物煅烧得到硅灰石；再将丝素蛋白与硝酸钙形成混合溶液；将硅灰石水溶液滴加到丝素蛋白/硝酸钙溶液中，得到羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料，该方法得到的复合材料分散性较差。

[0007] 中国专利CN101502672B公开了一种羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料的制备方法：将丝素蛋白溶液滴加于羟基磷灰石匀浆中，再将混合溶液超声处理，并滴加戊二醛交联剂，搅拌均匀后，移入细胞培养板，冷冻干燥获得各种不同比例的羟基磷灰石/丝素蛋白复合多孔支架材料；中国专利CN101235204B公开了一种纳米相羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料的制备方法，该方法采用氯化钙/乙醇/水三元溶剂溶解丝素蛋白纤维，然后向丝素蛋白溶液中添加磷酸氢二铵，并用氨水调节反应体系的pH值，反应结束后，经过滤、水洗等，获得纳米相羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料。以上方法制备的羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料的力学性能较差，很难满足实际使用的要求。

[0008] Zhao Yong等人采用交替矿化法构建了丝素蛋白/HAp复合生物材料，随着矿化周期的增加，丝素膜上沉积的磷灰石数量逐渐增多、体积逐步增大、结晶度越来越高，且磷灰石晶体为针状，晶体尺寸长0.35μm，直径约30nm(参见：Zhao Yong, Deng Xia, Nie Rong-rong, et al. Journal of Oral Science Research 22(2006) 116-119)；王刚等人采用“一步法”制备羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料，即：选用摩尔比为1:2:8的氯化钙/乙醇/水三元体系作溶剂，于75±5℃、0.5h溶解适量丝素蛋白纤维，将磷酸氢二铵溶液在3h内匀速向丝素蛋白溶液中滴加完毕，继续反应1h，经真空抽滤，干燥，获得纳米级羟基磷灰石/丝素蛋白复合材料粉末（参见：王刚. 纳米相羟基磷灰石/丝素蛋白生物复合材料的制备及其结构特征的研究 天津工业大学. 2007）；Li Wang等人通过共沉淀法制备了一种羟基磷灰石/壳聚糖/丝素蛋白复合材料，该复合材料中羟基磷灰石掺杂碳酸盐且结晶度低(参见：Li Wang, Chunzhong Li. Preparation and physicochemical properties of a novel hydroxyapatite/chitosan–silk fibroin composite. Carbohydrate Polymers68(2007)740-745)；Sarindr Bhumiratana等人采用冷冻干燥法制备丝素蛋白/羟基磷灰石支架材料，其在成骨生长因子缺乏时，通过人骨髓间充质干细胞引导和支撑骨基质的形成(参见：Sarindr Bhumiratana, Warren L. Grayson, et al. Nucleation and growth of mineralized bone matrix on silk-hydroxyapatite composite scaffolds. Biomaterial 32(2011)2812-2820)；Chunling Du等人将甘油作为添加剂，采用生物矿化的方式制备了丝素蛋白/羟基磷灰石复合材料，其中HA的理论质量分数为2%-31%(参见：
Chunling Du, Jun Jin, et al. Novel silk fibroin/hydroxyapatite composite films: Structure and properties. Materials Science and Engineering C 29(2009)62-68)。
以上制备方式虽然可以将丝素蛋白与羟基磷灰石复合在一起，但复合材料中羟基磷灰石分散性较差，形貌尺寸难控制，直接影响了其生物活性和生物相容性。

发明内容

[0009] 本发明目的是提供一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法。

[0010] 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，包括如下步骤：

[0011] (a) 丝素蛋白膜的制备：蚕丝经脱胶、干燥得到丝素纤维，丝素纤维经溶解得到再生丝素蛋白溶液；再生丝素蛋白溶液经过透析、过滤，制备成质量浓度为0.1%～60%的丝素蛋白水溶液；然后将丝素蛋白水溶液与无机钙盐混合，搅拌均匀，再制备得到无机钙盐/丝素蛋白膜；

[0012] (b) 复合膜材料的制备：将磷酸盐配制成质量浓度为0.05mol/L～饱和的磷酸盐水溶液，并调节磷酸盐水溶液pH值为4～11；然后将步骤(a)制备的无机钙盐/丝素蛋白膜放入磷酸盐水溶液中，经过室温静置陈化、水洗、干燥，获得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料；调节磷酸盐水溶液pH值的试剂为氨水、氢氧化钠或者盐酸。

[0013] 上述技术方案中，所述步骤(a)中无机钙盐/丝素蛋白膜中丝素蛋白和无机钙盐的质量比为99∶1～10∶90。

[0014] 上述技术方案中，所述无机钙盐选自CaCl2、Ca(OH)2、Ca(NO3)2、Ca(OC2H5)2中的一种或多种；磷酸盐选自(NH4)2HPO4、H3PO4、Na3PO4、K2HPO4中的一种或多种。

[0015] 上述技术方案中，所述步骤(b)中静置陈化反应时间为0.5～30天，干燥温度为20～120℃，干燥时间为1～72h。

[0016] 本发明还公开了一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，包括如下步骤：

[0017] (a) 丝素蛋白膜的制备：蚕丝经脱胶、干燥得到丝素纤维，丝素纤维经溶解得到再生丝素蛋白溶液；再生丝素蛋白溶液经过透析、过滤，制备成质量浓度为0.1%～60%的丝素蛋白水溶液；然后将丝素蛋白水溶液与磷酸盐混合，搅拌均匀，再制备得到磷酸盐/丝素蛋白膜；

[0018] (b) 复合膜材料的制备：将无机钙盐配制成质量浓度为0.05mol/L～饱和的无机钙盐水溶液，并调节无机钙盐水溶液pH值为4～11；然后将步骤(a)制备的磷酸盐/丝素蛋白膜放入无机钙盐水溶液中，经过室温静置陈化、水洗、干燥，获得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料；调节无机钙盐水溶液pH值的试剂为氨水、氢氧化钠或者盐酸。

[0019] 上述技术方案中，所述步骤(a)磷酸盐/丝素蛋白膜中丝素蛋白和磷酸盐的质量比为99∶1～10∶90。

[0020] 上述技术方案中，所述无机钙盐选自CaCl2、Ca(OH)2、Ca(NO3)2、Ca(OC2H5)2中的一种或多种；磷酸盐选自(NH4)2HPO4、H3PO4、Na3PO4、K2HPO4中的一种或多种。

[0021] 上述技术方案中，所述步骤(b)中静置陈化反应时间为0.5～30天，干燥温度为20～120℃，干燥时间为1～72h。

[0022] 本发明中，制备再生丝素蛋白溶液的方法没有特别限制，可以选用传统的溶解法；制备磷酸盐/丝素蛋白膜或者无机钙盐/丝素蛋白膜的方法为常规成膜方法，优选室温成膜法。

[0023] 本发明制备的复合膜材料中纳米羟基磷灰石的粒径为10～500nm。

[0024] 本发明还公开了由以上方法制备得到的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料。

[0025] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

[0026] 1．本发明开发了一种新的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的制备方法，由此制备的羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜中羟基磷灰石分散均匀，形貌尺寸可控；并解决了现有技术中羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料力学性能差的问题；

[0027] 2．本发明制备的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料可生物降解，对人体无害，并具有良好的理化性能和生物学性能，是一种理想的生物医用材料；同时该复合膜材料可充分发挥各组分材料的特性，构建适合人体的骨组织修复或替代材料，具有很好的实用价值；

[0028] 3．本发明公开的制备工艺简单，制备条件可控，所用试剂少且廉价，适合工业化生产。

附图说明

[0029] 图1是实施例一中纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜的SEM图。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明作进一步描述：

[0031] 实施例一

[0032] 一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料及其制备方法，包括如下步骤：

[0033] (1)天然桑蚕丝用质量分数0.05%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯丝素蛋白纤维；将该丝素蛋白纤维溶解于LiBr:C2H5OH:H2O=45:44:11（质量比）中恒温70±2℃水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白溶液；经透析、过滤获得质量分数为2.0%的丝素蛋白水溶液；取10mL丝素蛋白水溶液，按丝素蛋白和氯化钙的质量比1:0.1，往丝素蛋白水溶液中添加氯化钙，磁力搅拌3h，室温成膜，获得含有氯化钙的氯化钙/再生丝素蛋白膜；

[0034] (2)将(NH4)2HPO4制备成0.1mol/L的(NH4)2HPO4水溶液，并用氨水调节(NH4)2HPO4水溶液pH值为10；将上述氯化钙/再生丝素蛋白膜放入0.1mol/L的(NH4)2HPO4水溶液中，室温陈化反应6h，去离子水清洗，60℃干燥40h，获得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料。

[0035] 附图1为上述制备方式获得的纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的扫描电镜图；由图1可见：羟基磷灰石在再生丝素蛋白膜表面生长、分散均匀，且羟基磷灰石与丝素蛋白膜的结合牢固，导致纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料的力学性能优异，其原因主要是羟基磷灰石是以丝素蛋白膜中的钙离子为基点生长的。

[0036] 实施例二

[0037] 一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料及其制备方法，包括如下步骤：

[0038] (1)天然桑蚕丝用质量分数为0.05%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯丝素蛋白纤维；将该丝素蛋白纤维溶解于CaCl2: C2H5OH: H2O=1:2:8（摩尔比）中恒温70±2℃水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白溶液；经透析、过滤、浓缩，获得质量分数为5.0%的丝素蛋白水溶液；取8mL丝素蛋白水溶液，按丝素蛋白和Ca(OC2H5)2的质量比1:0.25，往丝素蛋白水溶液中添加Ca(OC2H5)2，磁力搅拌1h，室温成膜，获得含有Ca(OC2H5)2的Ca(OC2H5)2/再生丝素蛋白膜；

[0039] (2) 将H3PO4制备成0.05mol/L的H3PO4水溶液并用盐酸调节H3PO4水溶液pH值为7；将Ca(OC2H5)2/再生丝素蛋白膜放入0.05mol/L的H3PO4水溶液中，室温陈化反应240h，去离子水清洗，40℃干燥72h，获得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料。

[0040] 实施例三

[0041] 一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料及其制备方法，包括如下步骤：

[0042] (1)天然桑蚕丝用质量分数为0.5%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯丝素蛋白纤维；将该丝素蛋白纤维溶解于9.3M溴化锂溶液中恒温70±2℃水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白溶液；经透析、过滤、获得质量分数为3.0%的丝素蛋白水溶液；取10mL丝素蛋白水溶液，按丝素蛋白和磷酸氢二铵的质量比1:0.1，往丝素蛋白水溶液中添加磷酸氢二铵，磁力搅拌2h，室温成膜，获得含有磷酸氢二铵的磷酸氢二铵/再生丝素蛋白膜；

[0043] (2)将CaCl2制备成0.1mol/L的CaCl2水溶液，并用氢氧化钠调节CaCl2水溶液pH值为9；将磷酸氢二铵/再生丝素蛋白膜放入0.1mol/L的CaCl2溶液中，室温陈化反应48h，去离子水清洗，120℃干燥1h，获得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料。

[0044] 实施例四

[0045] 一种纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料及其制备方法，包括如下步骤：

[0046] (1)天然桑蚕丝用质量分数为0.5%的碳酸钠溶液煮沸30min脱胶，重复3次后获得纯丝素蛋白纤维；将该丝素蛋白纤维溶解于9.3M溴化锂溶液中恒温70±2℃水浴锅内搅拌溶解获得再生丝素蛋白溶液；经透析、过滤、获得质量分数为3.0%的丝素蛋白水溶液；取10mL丝素蛋白水溶液，按丝素蛋白和Na3PO4的质量比1:9，往丝素蛋白水溶液中添加Na3PO4，磁力搅拌2h，室温成膜，获得含有Na3PO4的Na3PO4/再生丝素蛋白膜；

[0047] (2)将Ca(OC2H5)2制备成饱和的Ca(OC2H5)2水溶液，并用氢氧化钠调节Ca(OC2H5)2水溶液pH值为6；将Na3PO4/再生丝素蛋白膜放入饱和的Ca(OC2H5)2溶液中，室温陈化反应5天，去离子水清洗，100℃干燥10h，获得纳米羟基磷灰石/丝素蛋白复合膜材料。