一种西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的分离纯化方法

摘要

本发明涉及一种同时分离高纯度西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的方法，属于中药活性成分的分离纯化技术领域。本发明是以西红花的干柱头为原料，通过90～95%乙醇提取、浓缩、过滤、高效制备液相色谱分离、产品回收、葡聚糖凝胶柱层析得到西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ单体。本发明通过最适宜的工艺及参数条件，使产品中西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ的含量分别达到99%以上；整个工艺过程稳定、操作简便、分离效率高，成本低廉，可大量高纯度分离制备西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体。

权利要求

1.一种西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的分离纯化方法，其特征在于：以鸢尾科番红花属的多年生花卉的干柱头为原料，通过提取、浓缩、过滤、高效制备液相色谱分离、葡聚糖凝胶柱层析、产品回收得到西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体，具体工艺步骤如下：

1）提取

将西红花粉碎成1～4mm的粗粉，按体积/质量加入40～80倍的乙醇溶液，提取3～

4次，每次2～3小时，合并过滤液，待下一步处理；

所述乙醇溶液的体积百分比浓度为90～95%；

2）浓缩

将步骤1）所得的过滤液，60℃浓缩至无醇，所得浓缩液，进行下一步处理；

3）过滤

将步骤2）所得的浓缩液用0.45μm滤膜过滤，所得过滤液为制备西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的原料；

4）HPLC制备

色谱条件如下：

色谱柱填料为：C18填料；

流动相为：乙腈-0.35wt%磷酸水溶液V/V=25：75；

步骤3）所得的过滤液进样，进样量为70 mL/针，在线紫外监测，检测波长为440nm，收集目标化合物制备溶液，得西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的HPLC制备液；

5）产品回收

将步骤4）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用C18富集、甲醇解析，55℃浓缩至无醇，即分别得西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体溶液；

6）葡聚糖凝胶柱层析

色谱条件如下：

层析柱填料为：Sephadex LH-20；

流动相为：甲醇-水溶液V/V=50：50；

将步骤5）所得的西红花苷Ⅰ单体溶液、西红花苷Ⅱ的单体溶液，分别用葡聚糖凝胶柱分离，55℃浓缩至干即分别得西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体产品。

2. 根据权利要求1所述的一种西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的分离纯化方法，其特征在于：在步骤4）进行高效液相色谱法HPLC制备前，通过液-质联用方法确定高效液相色谱中西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ单体的峰形，取步骤3）所得的过滤液进样，进行西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体在液相色谱中对应的峰形。

3.根据权利要求2所述的一种西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的分离纯化方法，其特征在于：所述液-质联用方法的色谱条件如下：色谱柱填料为：C18填料；

流动相为：乙腈-0.35 wt%磷酸水溶液V/V=25：75。

4.根据权利要求1所述的一种西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的分离纯化方法，其特征在于：利用反相分析型液相色谱RP-HPLC复检产品纯度，其色谱条件如下：填料为C18，流动相为甲醇-水溶液V/V=55：45，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为440nm。

说明书

一种西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的分离纯化方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物化合物单体的制备分离方法，尤其是从西红花中提取西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ单体的分离纯化方法，属中药活性成分的分离纯化技术领域。

背景技术

[0002] 西红花（Stigma Croci）又称藏红花、番红花，英文名:Saffron，为鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的柱头，其原生地在地中海沿岸至喜玛拉雅山麓。据《本草纲目》记载，西红花能“活血、主心气忧郁，又治惊悸”。因此，中医用于治疗心血管疾病。目前，西红花的主产地在伊朗、希腊和西班牙等国，在我国只有少量栽培。由于其产量极低，采收耗时费力，在我国被列为珍稀名贵中药材，为国家中医药管理局重点支持发展的中药材品种。西红花具有三个世界之最：世界上最贵的药用植物、最上好的染料、最高档的香料，西红花在西班牙等欧洲国家又被称为“红色金子”、“植物黄金”、“软黄金”。我国现已在上海、浙江、河南、北京、新疆、四川、广西等省市引种成功，其中上海市崇明县是我国最早引种西红花并实现产业化生产的地区，目前实施GAP的栽培面积保持在2500亩以上，每年出产优质干花丝2000kg以上，年供应成品优质种球50吨以上。

[0003] 西红花苷Ⅰ（Crocin I），分子式为C44H64O24，分子量为976.96，结构式如下：

[0004]

[0005] 西红花苷Ⅱ（Crocin II），分子式为C38H54O19，分子量为814.82，结构式如下：

[0006]

[0007] 西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ来源于鸢尾科植物番红花Crocus sativus L.的干燥柱头，是西红花药材中的主要活性成分，具活血化瘀、凉血解毒、解郁安神等作用。目前主要采用硅胶柱层析和结晶相结合的方法进行西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ单体的精制以及含量测定。生产周期长，试剂浪费严重，产品收率低。相关文献及专利信息如下：1、中国专利 CN102276664 A 公开了一种利用高速逆流色谱法制备西红花苷-Ⅰ的方法，该方法是取乙酸乙酯、乙醇、水混合分层后，取上相充满高速逆流色谱柱，转动主机，泵入下相做流动相，将栀子黄色素溶于下相由进样阀进样，SP-200紫外检测器检测，根据图谱收集目的成分，减压干燥流分，即得。该方法采用高效逆流对试剂的浪费大，且只能得到较高纯度的西红花苷Ⅰ。2、《药物分析杂志》2009年09期“西红花中西红花苷-1和西红花苷-2含量测定方法的建立”，采用高效液相色谱法，使用Zorbax C_(18)色谱柱，乙腈和水为流动相梯度洗脱，检测波长440nm，流速1.0mL·min～(-1)；同时采用单因素分析的方法，对影响含量测定结果的主要因素如提取溶剂、超声处理时间、提取温度及是否避光等进行考察。结果:西红花苷-1在5.2～165μg·mL～(-1)，西红花苷-2在2.7～85μg·mL～(-1)范围均呈良好线性关系，相关系数分别为0.9999和0.9998，平均回收率分别为102.5%和98.2%。该技术着重于对产品纯度检测的研究，且梯度不利于高效色谱的连续生产。

发明内容

[0008] 本发明的目的在于提供一种西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的分离纯化方法。该方法分离效率高，生产周期短，工艺稳定，操作简便，成本低廉，可实现同时大量分离制备高纯度的西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ两种单体。

[0009] 为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0010] 一种西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的分离纯化方法，其特征在于：以鸢尾科番红花属的多年生花卉的干柱头为原料，通过提取、浓缩、过滤、高效制备液相色谱分离、葡聚糖凝胶柱层析、产品回收得到西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体，具体工艺步骤如下：

[0011] 1）提取

[0012] 将西红花粉碎成1～4mm的粗粉，按体积/质量加入40～80倍的乙醇溶液，提取3～4次，每次2～3小时，合并过滤液，待下一步处理；

[0013] 所述乙醇溶液的体积百分比浓度为90～95%；

[0014] 通过对该提取步骤中工艺参数的有效控制，可以确保西红花苷能够较完全从药材中提取出来。

[0015] 2）浓缩

[0016] 将步骤1）所得的过滤液，60℃浓缩至无醇，所得浓缩液，进行下一步处理；

[0017] 3）过滤

[0018] 将步骤2）所得的浓缩液用0.45μm滤膜过滤，所得过滤液为制备西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的原料；

[0019] 通过膜过滤能有效保护设备不受损坏。

[0020] 4）HPLC制备

[0021] 色谱条件如下：

[0022] 色谱柱填料为：C18填料；

[0023] 流动相为：乙腈-0.35%磷酸水溶液V/V=25：75；

[0024] 步骤3）所得的过滤液进样，进样量为70 mL/针，在线紫外监测，检测波长为440nm，收集目标化合物制备溶液，得西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的HPLC制备液；

[0025] 在进行高效制备液相色谱分离（HPLC）前，通过液-质联用方法（色谱条件同上）确定高效液相色谱中西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ单体的峰形，取步骤3）所得的过滤液进样，进行西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体在液相色谱中对应的峰形。

[0026] 5）产品回收

[0027] 将步骤4）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用C18富集、甲醇解析，55℃浓缩至无醇，即分别得西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体溶液；

[0028] 6）葡聚糖凝胶柱层析

[0029] 色谱条件如下：

[0030] 层析柱填料为：Sephadex LH-20；

[0031] 流动相为：甲醇-水溶液V/V=50：50；

[0032] 将步骤5）所得的西红花苷Ⅰ单体溶液、西红花苷Ⅱ的单体溶液，分别用葡聚糖凝胶柱分离，55℃浓缩至干即分别得西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体产品。再次通过该流动相的葡聚糖凝胶柱层析，可以有效除去目标物中分子量相差较大的，而色谱又不好分离的杂质。

[0033] 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，其色谱条件如下：填料为C18，流动相为甲醇-水溶液V/V=55：45，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为440nm。

[0034] 本发明的优点在于：

[0035] 1、本发明采用制备型高效液相色谱系统对西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体进行分离纯化，达到了很好的分离效果，并且通过在线紫外监测，针对性的收集西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体，目标明确，避免了常规柱层析等造成的资源浪费，而且便于控制产品质量，产品纯度（面积归一法）可达96%以上。

[0036] 2、本发明采用葡聚糖凝胶柱层析进一步对西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体进行精制分离纯化，通过反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，其纯度可达99%以上。

[0037] 3、由于高效液相色谱对样品的色泽、纯度等要求比较高，通过简单处理得到的提取液不能直接进样，因此若在进行高效液相色谱分离前，不按照本发明方法步骤对进样溶液进行前处理，则不但分离效果不好，而且还可能对仪器造成严重影响（如缩短寿命等），进而增加产品的生产成本。

[0038] 4、针对西红花药材中存在的各种成分的理化性质，本发明方法通过前述步骤1）、2）、3）的顺序搭配，以及适当的参数组合，有效提取出了西红花苷等成分，并除去了大量杂质，由此获得可以进入制备型高效液相色谱系统的样品溶液，不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节约了生产成本。

[0039] 5、在高效液相色谱分离过程中，各色谱条件的选择及其组合很重要，因为它直接影响物质的出峰时间、峰形等；色谱条件主要包括色谱柱（包括填料、柱长、柱温等）、流动相（包括成分、流速等）、检测器及检测波长等。本发明通过大量的试验研究和对比分析，确定了以上所述的色谱条件，从而使物质的出峰时间、峰形、分离效果等达到最佳化，实现了西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的高效分离。

附图说明

[0040] 图1是本发明实施例1西红花苷Ⅰ单体产品的HPLC图谱。

[0041] 图2是本发明实施例1西红花苷Ⅱ单体产品的HPLC图谱。

具体实施方式

[0042] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明仅限于下述实施例。

[0043] 下述各实施例中，终产品西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）法，色谱条件如下：

[0044] 填料为C18，流动相为甲醇-水溶液V/V=55：45，柱温为30℃，流速为1.0mL/min，检测波长为440nm。

[0045] 实施例1

[0046] 1）提取

[0047] 将西红花药材10g粉碎成1～4mm的粗粉，加入0.5L体积百分比浓度为90%的乙醇溶液，提取3次，每次2小时，合并过滤提取液，共1500mL；

[0048] 2）浓缩

[0049] 将步骤1）所得的提取液，60℃浓缩至无醇，得浓缩液200mL；

[0050] 3）过滤

[0051] 将步骤2）所得的200mL浓缩液用0.45μm滤膜过滤，得过滤液210mL；

[0052] 4）HPLC制备

[0053] 采用填料为C18的色谱柱，柱规格为50cm×8cm；

[0054] 流动相组成为：乙腈-0.35%磷酸水溶液（V/V=25：75）

[0055] 检测波长为440nm，室温操作；

[0056] 取步骤3）所得的过滤液进样，进样量为70mL/针，进行西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，在线紫外监测，收集得到目标化合物制备溶液西红花苷Ⅰ单体的HPLC制备液2200mL，西红花苷Ⅱ单体的HPLC制备液1200mL；

[0057] 在进行高效制备液相色谱分离前，通过液-质联用方法（色谱条件同上）确定高效液相色谱中西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的峰形，取步骤3）所得的过滤液进样，进行西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体在液相色谱中对应的峰形。

[0058] 5）产品回收

[0059] 将步骤4）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用C18富集、甲醇解析，55℃浓缩至无醇，即分别得西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ的单体溶液15mL、10mL；

[0060] 6）葡聚糖凝胶柱层析

[0061] 采用填料Sephadex LH-20的层析柱，柱规格为100cm×5cm；

[0062] 流动相为：甲醇-水V/V=50：50；

[0063] 将步骤5）所得的西红花苷Ⅰ的单体溶液、西红花苷Ⅱ的单体溶液，分别用葡聚糖凝胶柱分离，55℃浓缩至干即分别得西红花苷Ⅰ单体产品0.6g、西红花苷Ⅱ单体产品0.4g。

[0064] 整个生产流程用时约3天。

[0065] 计算得产品收率为：

[0066] 西红花苷Ⅰ：（0.6/10）×100%=6.0%；

[0067] 西红花苷Ⅱ：（0.4/10）×100%=4.0%。

[0068] 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为西红花苷Ⅰ99.55%，西红花苷Ⅱ99.85%。

[0069] 实施例2

[0070] 1）提取

[0071] 将西红花药材10g粉碎成1～4mm的粗粉，加入0.5L体积百分比浓度为95%的乙醇溶液，提取3次，每次2小时，合并过滤提取液，共1500mL；

[0072] 2）浓缩

[0073] 将步骤1)所得的提取液，60℃浓缩至无醇，得浓缩液200mL；

[0074] 3）过滤

[0075] 将步骤2）所得的200mL浓缩液用0.45μm滤膜过滤，得过滤液210mL；

[0076] 4）HPLC制备

[0077] 采用填料为C18的色谱柱，柱规格为50cm×8cm；

[0078] 流动相组成为：乙腈-0.35%磷酸水溶液（V/V=25：75）

[0079] 检测波长为440nm，室温操作；

[0080] 取步骤3）所得的过滤液进样，进样量为70mL/针，进行西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，在线紫外监测，收集得到目标化合物制备溶液西红花苷Ⅰ单体的HPLC制备液2200mL，西红花苷Ⅱ单体的HPLC制备液1200mL；

[0081] 在进行高效制备液相色谱分离前，通过液-质联用方法（色谱条件同上）确定高效液相色谱中西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的峰形，取步骤3）所得的过滤液进样，进行西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体在液相色谱中对应的峰形。

[0082] 5）产品回收

[0083] 将步骤4）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用C18富集、甲醇解析，55℃浓缩至无醇，即分别得西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ的单体溶液15mL、10mL；

[0084] 6）葡聚糖凝胶柱层析

[0085] 采用填料Sephadex LH-20的层析柱，株规格为100cm×5cm；

[0086] 流动相为：甲醇-水（50：50）；

[0087] 将步骤5）所得的西红花苷Ⅰ的单体溶液、西红花苷Ⅱ的单体溶液，分别用葡聚糖凝胶柱分离，55℃浓缩至干即分别得西红花苷Ⅰ单体产品0.61g、西红花苷Ⅱ单体产品0.42g。

[0088] 整个生产流程用时约3天。

[0089] 计算得产品收率为：

[0090] 西红花苷Ⅰ：（0.61/10）×100%=6.1%；

[0091] 西红花苷Ⅱ：（0.42/10）×100%=4.2%。

[0092] 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为西红花苷Ⅰ99.15%，西红花苷Ⅱ99.75%。

[0093] 实施例3

[0094] 1）提取

[0095] 将西红花药材100g粉碎成1～4mm的粗粉，加入8L体积百分比浓度为95%的乙醇溶液，提取3次，每次2小时，合并过滤提取液，共24L；

[0096] 2）浓缩

[0097] 将步骤1）所得的提取液，60℃浓缩至无醇，得浓缩液1.7L；

[0098] 3）过滤

[0099] 将步骤2）所得的1.7L浓缩液用0.45μm滤膜过滤，得过滤液1.8L；

[0100] 4）HPLC制备

[0101] 采用填料为C18的色谱柱，柱规格为50cm×8cm；

[0102] 流动相组成为：乙腈-0.35%磷酸水溶液（V/V=25：75）

[0103] 检测波长为440nm，室温操作；

[0104] 取步骤3）所得的过滤液进样，进样量为70mL/针，进行西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，在线紫外监测，收集得到目标化合物制备溶液西红花苷Ⅰ单体的HPLC制备液3.0L，西红花苷Ⅱ单体的HPLC制备液2.6L；

[0105] 在进行高效制备液相色谱分离前，通过液-质联用方法（色谱条件同上）确定高效液相色谱中西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的峰形，取步骤3）所得的过滤液进样，进行西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体在液相色谱中对应的峰形。

[0106] 5）产品回收

[0107] 将步骤4）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用C18富集、甲醇解析，55℃浓缩至无醇即分别得西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ的单体溶液260mL、200mL；

[0108] 6）葡聚糖凝胶柱层析

[0109] 采用填料Sephadex LH-20的层析柱，株规格为100cm×5cm；

[0110] 流动相为：甲醇-水（V/V=50：50）；

[0111] 将步骤5）所得的西红花苷Ⅰ的单体溶液、西红花苷Ⅱ的单体溶液，分别用葡聚糖凝胶柱分离，55℃浓缩至干即分别得西红花苷Ⅰ单体产品5.8g、西红花苷Ⅱ单体产品3.9g。

[0112] 整个生产流程用时约6天。

[0113] 计算得产品收率为：

[0114] 西红花苷Ⅰ：（5.8/100）×100%=5.8%；

[0115] 西红花苷Ⅱ：（3.9/100）×100%=3.9%。

[0116] 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为西红花苷Ⅰ99.69%，西红花苷Ⅱ99.90%。

[0117] 实施例4

[0118] 1）提取

[0119] 将西红花药材100g粉碎成1～4mm的粗粉，加入8L体积百分比浓度为90%的乙醇溶液，提取4次，每次3小时，合并过滤提取液，共24L；

[0120] 2）浓缩

[0121] 将步骤1）所得的提取液，60℃浓缩至无醇，得浓缩液1.8L；

[0122] 3）过滤

[0123] 将步骤2）所得的1.8L浓缩液用0.45μm滤膜过滤，得过滤液2.1L；

[0124] 4）HPLC制备

[0125] 采用填料为C18的色谱柱，柱规格为50cm×8cm；

[0126] 流动相组成为：乙腈-0.35%磷酸水溶液（V/V=25：75）

[0127] 检测波长为440nm，室温操作；

[0128] 取步骤3）所得的过滤液进样，进样量为70mL/针，进行西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，在线紫外监测，收集得到目标化合物制备溶液西红花苷Ⅰ单体的HPLC制备液3.2L，西红花苷Ⅱ单体的HPLC制备液2.8L；

[0129] 在进行高效制备液相色谱分离前，通过液-质联用方法（色谱条件同上）确定高效液相色谱中西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的峰形，取步骤3）所得的过滤液进样，进行西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体的制备分离，根据质谱检测结果，确定西红花苷Ⅰ单体、西红花苷Ⅱ单体在液相色谱中对应的峰形。

[0130] 5）产品回收

[0131] 将步骤4）所得的HPLC制备液，回收乙腈，剩余水溶液用C18富集、甲醇解析，55℃浓缩至无醇，即分别得西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ的单体溶液270mL、210mL；

[0132] 6）葡聚糖凝胶柱层析

[0133] 采用填料Sephadex LH-20的层析柱，株规格为100cm×5cm；

[0134] 流动相为：甲醇-水（V/V=50：50）；

[0135] 将步骤5）所得的西红花苷Ⅰ的单体溶液、西红花苷Ⅱ的单体溶液，分别用葡聚糖凝胶柱分离，55℃浓缩至干即分别得西红花苷Ⅰ单体产品5.9g、西红花苷Ⅱ单体产品3.9g。

[0136] 整个生产流程用时约8天。

[0137] 计算得产品收率为：

[0138] 西红花苷Ⅰ：（5.9/100）×100%=5.9%；

[0139] 西红花苷Ⅱ：（3.9 /100）×100%=3.9%。

[0140] 通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（RP-HPLC）复检产品纯度，测得结果为西红花苷Ⅰ99.01%，西红花苷Ⅱ99.23%。