α-芋螺毒素肽TxIC/Txd1、其药物组合物及用途转让专利
申请号 : CN201210325531.9
文献号 : CN103665130B
文献日 : 2016-11-02
发明人 : 罗素兰 , 长孙东亭 , 胡远艳 , 朱晓鹏 , 吴勇 , J·迈克尔·麦金托什
申请人 : 海南大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种在体外阻断乙酰胆碱受体或者调节乙酰胆碱水平的方法,包括使用有效量的多肽或融合蛋白的步骤;其中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5-7和SEQ ID NO:9中的任一序列所示;所述融合蛋白包含所述多肽;其中,所述乙酰胆碱受体是α3β4乙酰胆碱受体;其中,所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键,并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述多肽的羧基末端是酰胺化的。
3.一种确定乙酰胆碱受体亚型是否为α3β4乙酰胆碱受体的方法,该方法包括:将乙酰胆碱受体与多肽或融合蛋白进行接触的步骤;其中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:
5-7和SEQ ID NO:9中的任一序列所示;所述融合蛋白包含所述多肽;其中,所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键,并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述多肽的羧基末端是酰胺化的。
5.多肽或融合蛋白在制备阻断乙酰胆碱受体的药物或试剂中的用途;其中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5-7和SEQ ID NO:9中的任一序列所示;所述融合蛋白包含所述多肽;其中,所述乙酰胆碱受体是α3β4乙酰胆碱受体。
6.根据权利要求5所述的用途,其中,所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键,并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键。
7.根据权利要求5或6所述的用途,其中,所述多肽的羧基末端是酰胺化的。
8.多肽或融合蛋白在制备治疗和/或预防神经系统疾病的药物中的用途,或者用于制备镇痛、戒烟、戒毒的药物的用途;其中,所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5-7和SEQ ID NO:9中的任一序列所示;所述融合蛋白包含所述多肽;其中,所述神经系统疾病为成瘾或神经痛。
9.根据权利要求8所述的用途,其中,所述成瘾由如下原因导致:各种精神活性物质,以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的麻醉药品和精神药品。
10.根据权利要求9所述的用途,其中,所述各种精神活性物质选自尼古丁、鸦片、海洛因、甲基苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻和可卡因。
11.根据权利要求8所述的用途,其中,所述神经痛由如下原因导致:癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎或过敏症。
12.根据权利要求8所述的用途,其中,所述神经痛由如下原因导致:骨髓瘤或血管炎。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的用途,其中,所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第三个半胱氨酸形成二硫键,并且第二个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键。
14.根据权利要求8至12中任一项所述的用途,其中,所述多肽的羧基末端是酰胺化的。
说明书 :
α-芋螺毒素肽TxIC/Txd1、其药物组合物及用途
技术领域
背景技术
富含二硫键,生物活性强,能特异地作用于动物细胞膜上的受体和离子通道。尤其是对电压
门控或配体门控离子通道(包括少数G-蛋白相关受体等)具有较高的选择性。芋螺毒素按其
前体蛋白的内质网信号肽序列的相似性,以及半胱氨酸模式,分为不同的基因家族,至今,
所有已知的芋螺毒素可分为18个超家族,分别为A、C、D、S、M、I1、I2、I3、J、L、O1、O2、O3、P、T、V、Y、K(Kaas Q,Yu R,Jin AH,Dutertre S and Craik DJ.ConoServer:updated content,
knowledge,and discovery tools in the conopeptide database.Nucleic Acids
Research(2012)[Ahead of print];Ye M,Khoo KK,Xu S,Zhou M,Boonyalai N,Perugini
MA,Shao X,Chi C,Galea CA,Wang C & Norton RS(2012)A helical conotoxin from
Conus imperialis has a novel cysteine framework and defines a new
superfamily.Journal of Biological Chemistry 287,14973-14983)。芋螺毒素按其受体
靶位可分为α、ω、μ、δ等多种药理学家族。每个超家族根据受体靶类型,又可分为α、αA、κA(A-超家族),ω、δ、κ、μO(O-超家族),μ、ψ、KM(M-超家族)等家族(亚型)。
具有极其重要的价值。α-芋螺毒素是人们最早发现的一类芋螺毒素,通常分子量较小,一般由12-19个氨基酸残基组成,富含二硫键。α-芋螺毒素种类繁多,活性多样,结构变化复杂。
通过其高度保守的信号肽序列、药理学活性及半胱氨酸模式可对α-芋螺毒素进行分类。α-
芋螺毒素的半胱氨酸模式为CC-C-C,其中天然肽的二硫键连接方式为C1-C3与C2-C4,称为
球形异构体(globular isomer),二硫键间形成2个loop环。含有4个半胱氨酸的α-芋螺毒素线性肽氧化折叠后往往产生3种异构体,除了C1-C3与C2-C4间的天然肽二硫键连接方式(球
形异构体)外,另外两种异构体分别是带状异构体(ribbon isomer)与珠子状异构体(bead isomer)。带状异构体的二硫键连接方式为C1-C4与C2-C3;珠子状异构体的二硫键连接方式
为C1-C2与C3-C4。球形异构体具有完全的生物活性,带状异构体有时通过不同的作用机制
也发挥生物活性,珠子状异构体活性往往减小。根据二三及三四半胱氨酸间氨基酸数量不
同又可把α-芋螺毒素分为α3/5,α4/7,α4/6,α4/4和α4/3等多种亚家族,每个loop的特征和残基组成的不同是毒素作用于不同受体亚型的基础(Ulens C,Hogg RC,Celie PH,et
al.Structural determinants of selective alpha-conotoxin binding to a
nicotinic acetylcholine receptor homolog AChBP[J].Proc Natl Acad Sci USA
2006;103:3615–20;Gehrmann J,Alewood PF,Craik DJ.Structure determination of
the three disulfide bond isomers of alpha-conotoxin GI:a model for the role
of disulfide bonds in structural stability.J Mol Biol.1998,278(2):401-15;
Grishin AA,Wang CI,Muttenthaler M,Alewood PF,Lewis RJ,Adams DJ.Alpha-
conotoxin AuIB isomers exhibit distinct inhibitory mechanisms and
differential sensitivity to stoichiometry of alpha3beta4 nicotinic
acetylcholine receptors.J Biol Chem.2010,285(29):22254-63)。
型乙酰胆碱受体。nAChRs是细胞膜上的变构膜蛋白,介导众多中枢和外周神经系统的生理
功能,包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病
药物的关键靶点,这些疾病包括疼痛、烟酒和毒品成瘾、智障、痴呆、精神分裂症、中枢神经紊乱、癫痫症、帕金森病、精神病、神经肌肉阻滞、重症肌无力、抑郁症、高血压、心率不齐、哮喘、肌肉松弛、中风、乳腺癌和肺癌等。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性的nAChR激动剂如烟碱,虽然可以缓解上述神经疾病的症状,但它们对心脏和胃肠道
产生强烈的副作用,且有成瘾性。因此,开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物
是治疗上述疾病的关键所在(Livett BG,Sandall DW,Keays D,Down J,Gayler KR,
Satkunanathan N,Khalil Z.Therapeutic applications of conotoxins that target
the neuronal nicotinic acetylcholine receptor.Toxicon,2006,48(7):810-829;Taly
A,Corringer PJ,Guedin D,Lestage P,Changeux JP.Nicotinic receptors:allosteric
transitions and therapeutic targets in the nervous system.Nat Rev Drug
Discov.2009,8(9):733-50;Layla A,McIntosh JM.Alpha-conotoxins as
pharmacological probes of nicotinic acetylcholine receptors[J].Acta Pharmacol
Sin 2009 Jun;30(6):771–783.)。
病的治疗药物。
2、α3β2、α2β4等。此外,α7和α9可以形成同源多聚体。由于缺乏针对各种亚型的高选择性配体化合物,要研究和阐明各种各样的nAChRs亚型的精细结构和功能面临诸多挑战。
性疼痛是一个世界性的健康难题,急需新的治疗药物面世(Napier,I.A.;Klimis,H.;
Rycroft,B.K.;Jin,A.H.;Alewood,P.F.;Motin,L.;Adams,D.J.;Christie,M.J.,
Intrathecal α-conotoxins Vc1.1,AuIB and MII acting on distinct nicotinic
receptor subtypes reverse signs of neuropathic pain.Neuropharmacology 2012,62
(7),2202-2207.Blyth,F.M.;March,L.M.;Brnabic,A.J.;Jorm,L.R.;Williamson,M.;
Cousins,M.J.,Chronic pain in Australia:a prevalence study.PAIN 2001,89(2-3),
127-34.Cousins,M.J.;Brennan,F.;Carr,D.B.,Pain relief:a universal human
right.PAIN 2004,112(1-2),1-4.Eisenberg,E.;McNicol,E.D.;Carr,D.B.,Efficacy and
safety of opioid agonists in the treatment of neuropathic pain of
nonmalignant origin:systematic review and meta-analysis of randomized
controlled trials.JAMA:the journal of the American Medical Association 2005,
293(24),3043-52.)。
conotoxins as pharmacological probes of nicotinic acetylcholine
receptors.Acta Pharmacol Sin.2009;30(6):771-783)。新近研究表明,阻断含有α3β4的nAChRs可有效防止烟瘾、吗啡和可卡因毒瘾的发作,显著抑制吸烟和吸毒的欲望(Brunzell DH,Boschen KE,Hendrick ES,Beardsley PM,McIntosh JM.Alpha-conotoxin MII-
sensitive nicotinic acetylcholine receptors in the nucleus accumbens shell
regulate progressive ratio responding maintained by nicotine,
Neuropsychopharmacology,2010,35(3):665-73)。
Jerlhag,E.;Svensson,L.;Soderpalm,B.;Engel,J.A.,Is an alpha-conotoxin MII-
sensitive mechanism involved in the neurochemical,stimulatory,and rewarding
effects of ethanol?Alcohol 2004,34(2-3),239-50.Jerlhag,E.;Egecioglu,E.;
Dickson,S.L.;Svensson,L.;Engel,J.A.,Alpha-conotoxin MII-sensitive nicotinic
acetylcholine receptors are involved in mediating the ghrelin-induced
locomotor stimulation and dopamine overflow in nucleus accumbens.European
neuropsychopharmacology,2008,18(7),508-18)。
nicotinic acetylcholine receptors.Neuropharmacology 2009,56(1),237-46;Tapper,
A.R.;McKinney,S.L.;Nashmi,R.;Schwarz,J.;Deshpande,P.;Labarca,C.;Whiteaker,P.;
Marks,M.J.;Collins,A.C.;Lester,H.A.,Nicotine activation of alpha4* receptors:
sufficient for reward,tolerance,and sensitization.Science 2004,306(5698),
1029-32.)。α3β4nAChR涉及到中枢边缘多巴胺途径,对于滥用某种物质(如毒品)产生的奖赏效应起着非常重要的作用。并且在β4亚基敲除的老鼠中,烟碱引起的运动和奖赏效应显
著减少,这意味着α3β4nAChR在CNS中烟碱成瘾的重要作用(24 Salas,2004)。α3β4 nAChR在恐惧反应中也起着很重要的作用,对于调节谷氨酸和去甲肾上腺素的释放至关重要(Zhu,
P.J.;Stewart,R.R.;McIntosh,J.M.;Weight,F.F.,Activation of nicotinic
acetylcholine receptors increases the frequency of spontaneous GABAergic
IPSCs in rat basolateral amygdala neurons.Journal of neurophysiology 2005,94
(5),3081-91.Alkondon,M.;Albuquerque,E.X.,A non-alpha7 nicotinic acetylcholine
receptor modulates excitatory input to hippocampal CA1 interneurons.Journal
of neurophysiology2002,87(3),1651-4.Luo,S.;Kulak,J.M.;Cartier,G.E.;Jacobsen,
R.B.;Yoshikami,D.;Olivera,B.M.;McIntosh,J.M.,alpha-conotoxin AuIB selectively
blocks alpha3 beta4 nicotinic acetylcholine receptors and nicotine-evoked
norepinephrine release.The Journal of neuroscience:the official journal of
the Society for Neuroscience 1998,18(21),8571-9.Kulak,J.M.;McIntosh,J.M.;
Yoshikami,D.;Olivera,B.M.,Nicotine-evoked transmitter release from
synaptosomes:functional association of specific presynaptic acetylcholine
receptors and voltage-gated calcium channels.Journal of neurochemistry 2001,
77(6),1581-9.)。
发明内容
列参数确定的:blastall p blastp-a4-e10-E0-v500-b250-I[查询文档]-d prot_all,其
中-p指程序名称,-a指将要用到的服务器数,-e指期望值,-E指延伸缺口的代价,-v指单线
描述(one-line description)数,-b指将要显示的比对数,-I指查询文档,-d指用于查询的
数据库。
1-2个、最优选1个氨基酸残基。优选地,氨基酸改变是性质改变较小的变化,即是不会显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守性氨基酸取代;小片段缺 失,通常是1到大约5个、优选
1-3个、更优选1个氨基酸的缺失;小的氨基或羧基末端延伸,如氨基端添加的甲硫氨酸残
基;有多达大约20-25个残基的小连接肽;或可通过改变净电荷或者其它功能而有助于纯
化的小延伸如多聚组氨酸片段、抗原表位或结合区。
过。最常见的替换是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly以及反向进行的替换。因此,本发明还涉及上述氨基酸替换得到的多肽。
明肽的编码序列与编码所述其它肽/多肽的编码序列,使它们在同一读框中,并且融合多肽
的表达受控于相同的启动子和终止子。
的N末端的第一个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键,并且第二个半胱氨酸与第三个
半胱氨酸形成二硫键;或所述多肽的N末端的第一个半胱氨酸与第二个半胱氨酸形成二硫
键,并且第三个半胱氨酸与第四个半胱氨酸形成二硫键;具体地,所述多肽的羧基末端是酰
胺化的。
酸(核苷酸序列的制备参考实施例1或者直接按照实施例2中的方法进行多肽的人工合成),
得到多肽。也可以参考下面的方法:
20-25℃下在6X SSPE、5XDenhardt氏溶液、0.1%SDS、0.1mg/ml变性DNA中进行过夜。清洗
通常如下进行:于Tm-20℃在0.2X SSPE、0.1%SDS中一次15分钟(中度严谨条件清洗)。
本发明任一项所述的多肽或融合蛋 白进行接触的步骤;具体地,所述乙酰胆碱受体为α3β4乙酰胆碱受体。当α-芋螺毒素TxIC/Txd1能够特异阻断α3β4乙酰胆碱受体时,则推断该乙酰胆碱受体是α3β4亚型的乙酰胆碱受体。
痛、戒烟、或戒毒的药物的用途;具体地,所述神经痛由如下原因导致:癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎、血管炎、局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。
受体的亲和性不同,有时相差几个数量级。这种种系间的差异使得α-CTX可作为有用的探针
用于研究脊椎动物nAChR的种系发生,可作为分子探针来确定nAchR的不同亚型。它们是新
药开发的候选药物、先导药物和治疗药物。
苯丙胺(冰毒)、吗啡、大麻、可卡因以及国家规定管制的其他能够使人形成瘾癖的麻醉药品和精神药品等。成瘾与大脑中大量产生的多巴胺(Dopamine)有关。表现为不可遏制地应用
偏爱的物质和难以自制或难以矫正使用行为,为获取精神活性物质达到感觉良好或避免戒
断痛苦之目的,可以不择手段。 典型情况是耐受性增高,并在物质使用中断后常出现戒断
症状。成瘾者的生活可能完全由物质使用主宰,因而严重影响,甚至抛弃了其他重要活动和
一切责任。因此,物质使用既给个人,也给社会带来损害。当用于酒精使用时,与慢性酒精中毒的概念等同。成瘾一词还涵盖躯体及心理两方面的内容。心理成瘾强调对饮酒、服药的自
控力受损体验,而躯体成瘾指耐受和戒断症状。
敏等。很多疾病都会引起神经痛,包括癌症与癌症化疗、酒精中毒、坐骨神经痛、糖尿病、三叉神经痛、硬化症、带状疱疹、机械伤和手术伤、艾滋病、头部神经瘫痪、药物中毒、工业污染中毒、淋巴神经痛、骨髓瘤、多点运动神经痛、慢性先天性感觉神经病、急性剧烈自发性神经痛、挤压神经痛、脉管炎(血管炎)/局部缺血、尿毒症、儿童胆汁肝脏疾病、慢性呼吸障碍、复合神经痛、多器官衰竭、脓毒病/脓血症、肝炎、卟啉症、维生素缺乏、慢性肝脏病、原生胆汁硬化、高血脂症、麻疯病、莱姆关节炎、感觉神经束膜炎、过敏症等。
达。表达应理解为包括多肽生产中所涉及的任何步骤,包括,但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
码序列必需的所有调控序列时,术语核酸构建体与表达盒同义。术语“编码序列”在文中定
义为核酸序列中直接确定其蛋白产物的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻
mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码
框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括,但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。
修饰核酸序列的技术为本领域所熟知。
限于,前导序列、多聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号序列和转录终止子。最低限度,调控序列要包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了导入特定的限制位点以便将调控
序列与编码多肽的核酸序列的编码区进行连接,可以提供带接头的调控序列。术语“可操作
连接”在文中定义为这样一种构象,其中调控序列位于相对DNA序列之编码序列的适当位
置,以使调控序列指导多肽的表达。
转录活性的任何核酸序列,包括突变的、截短的和杂合的启动子,可以得自编码与宿主细胞
同源或异源的胞外或胞内多肽的基因。
功能的任何终止子都可以用于本发明。
的任何前导序列均可用于本发明。
与分泌多肽的编码区片段自然连接的信号肽编码区。或者,编码区的5’端可含有对编码序
列是外来的信号肽编码区。当编码序列在正常情况下不含有信号肽编码区时,可能需要添
加外来信号肽编码区。或者,可以用外来的信号肽编码区简单地替换天然的信号肽编码区
以增强多肽分泌。但是,任何能引导表达后的多肽进入所用宿主细胞的分泌途径的信号肽
编码区都可以用于本发明。
原切割肽原而转化为成熟的活性多肽。
而开放或关闭基因表达的系统。调控序列的其他例子是那些能使基因扩增的调控序列。在
这些例子中,应将编码多肽的核酸序列与调控序列可操作连接在一起。
或多个方便的限制位点,以便在这些位点插入或取代编码多肽的核酸序列。或者,可以通过
将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制
备表达载体时,可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作连接。
性或闭环质粒。
一起复制的载体。此外,可应用单个载体或质粒,或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部
DNA的两个或多个载体或质粒,或转座子。
养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因,或者抗生素如氨
苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。
fEhrlich,1978,美国国家科学院学报75:1433)。
或者与该核酸序列一起插入一个 可扩增的选择标记,通过在有合适选择试剂存在下培养
细胞,挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。
港,纽约,1989)。
我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变
而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于多肽编码基因及其来源。
养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳和氮源以及无机盐的合适的培养基中,采用本领域已知的步骤进行培
养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如,美国典型培养物保藏中
心的目录中所述)来制备。如果多肽被分泌到培养基中,则可以直接从培养基中回收多肽。
如果多肽 不分泌,可以从细胞裂解物中回收。
码本发明的芋螺毒素肽的基因转化植物。转化可以由本领域技术人员使用常规技术进行。
此处公开了用于这些转化的必要物质,或者熟练的技术人员可以通过其它方法容易的获
得。
株处理应用。制剂可以包括扩散-增稠佐剂、稳定剂、其它杀虫添加剂、或表面活性剂。液体制剂可 以是基于水的或非水的,并以泡沫、凝胶、悬浮液、可乳化浓缩物等等形式使用。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂、或聚合物。
1-60%。含有细胞的制剂将通常含有大约102-大约104个细胞/mg。这些制剂将以每公顷大
约50mg(液体的或干的)-1kg或更多的量使用。通过喷、撒、洒等等,可以将制剂应用于害虫环境,例如土壤和植物。
明肽的药物组合物以利于药用的方式配制和给药,并需考虑到个体病人的临床状况、运送
位点、给药方法、给药日程安排和医生已知的其它因素。因此用于本文目的的“有效量”由这些方面的考虑决定。
病如成瘾、帕金森氏病、行动障碍、精神分裂症等的工具药和治疗药物;治疗乳腺癌、肺癌、小细胞肺癌等的侯选药物。作为多肽杀虫剂,开发为新型生物农药等。
附图说明
(processing site 1)在碱性氨基酸精氨酸(R)的后面;C末端酰胺化加工位点在箭头所指的甘氨酸的位置,用字符底纹表示,即processing site 2.成熟肽C末端紧挨半胱氨酸
(Cys)的第一个甘氨酸残基往往是酰胺化翻译后修饰的加工位点,从processing site 2进
行酰胺化产生的成熟肽命名为TxIC/Txd1(或TxIC),序列为:GCCSHPVCSAMSPIC#(#表示C末
端酰胺化)。前肽区用斜体字表示,成熟肽用下划线表示,其中的半胱氨酸(C)用黑体字显
示,终止密码子用*表示。
B液从15%到50%,A液从85%到50%,A液是0.65%的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA),B
是0.5% TFA与90%乙腈(acetonitrile)的水溶液。紫外分析波长为214nm,TxIC的出峰时间,即保留时间是23.366分钟。
值百分数。α-TxIC特异阻断α3β4nAChR,其半阻断剂量(IC50)仅为12.5nM;α-TxIC对α6/α3β
4nAChR也有一定的阻断作用,其半阻断剂量(IC50)为94nM;α-TxIC对α2β4nAChR有很微弱的阻断作用,其半阻断剂量高达4550nM。在10μM毒素浓度下,TxIC对其他亚型没有阻断作用,其IC50>10μM。图中各个数值是取自3-8个非洲爪蟾卵母细胞的电流平均值。
具体实施方式
技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄
培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)、相应的参考文献、或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
试剂盒(购自中国北京天根生化科技有限公司),提取毒腺的基因组DNA,具体操作按照试剂盒说明书进行。得到毒腺的基因组DNA。
测定DNA溶液的OD260、OD280值以及OD260/OD280比值,并计算DNA的浓度(μg·ml-1)、纯度和DNA产率(μg·g-1)。
化重组子质粒用于测序分析。得到两个测序结果,即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2(图1,
168bp),分别如下:
GGACCCTCTGAACCACGACA(SEQ ID NO:2)。
因。即SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中带下划线的部分,其为编码TxIC/Txd1芋螺毒素前肽的核苷酸序列,如下(114aa):
precursor或α-TxIC/Txd1precursor或TxIC/Txd1 precursor或TxIC precursor):
cleavage sites.Protein engineering,design&selection:PEDS 2004,17(1),107-12.)。
推断的方法和原理请参考Luo S,Zhangsun D,Zhang B,Quan Y,Wu Y.Novel alpha-
conotoxins identified by gene sequencing from cone snails native to Hainan,
and their sequence diversity.J Pept Sci.2006,12(11):693-704。推导过程和 结果亦
参见图1。
对二硫键。TxIC/Txd1为4/6型α-CTX(图1和图2A)。TxIC/Txd1是新的α-芋螺毒素,与其他α-CTX的序列和活性比较见表1。
行酰胺化。
(Cys)的-SH用Trt(S-trityl)保护,第2和第4个半胱氨酸的-SH用Acm(S-acetamidomethyl)
成对保护。其合成步骤为:采用固相合成法中的Fmoc与FastMoc方法,在ABI Prism 433a多
肽合成仪上合成了3个异构体线性肽。Fmoc氨基酸的侧链保护基为:Pmc(Arg)、Trt(Cys)、
But(Thr、Ser、Tyr)、OBut(Asp)、Boc(Lys).采用Fmoc HOBT DCC方法,Rink酰胺化树脂及
Fmoc氨基酸,合成步骤参考仪器合成手册进行。为反应完全,在哌啶脱保护及偶合时间上分
别适当延长,对难接氨基酸采用双偶合,获得树脂肽。用reagent K(trifluoroacetic
acid/water/ethanedithiol/phenol/thioanisole;90:5:2.5:7.5:5,v/v/v/v/v)将线性肽
从树脂上切割下来,并用冰乙醚沉淀和洗涤回收线性肽粗品,用制备型反向HPLC C18柱
(Vydac)纯化,洗脱线性梯度为在0-40min内15-50% B90,第40-45min 50-100% B90.溶
剂B90是90% ACN(acetonitrile),10% H20,0.5% TFA(trifluoroacetic acid);溶剂A是
0.65% TFA的水溶液。紫外吸收值分析在214nm波长下进行。纯化后的线性肽用分析型的
HPLC C18柱(Vydac)进行纯度检测,洗脱梯度为0–40min 2–42% B60,42-47min 42–100% B60,流速为1mL/min。其纯度达95%以上,用于氧化折叠。
selective for alpha6 subunit-containing nicotinic acetylcholine receptors.The
Journal of neuroscience 2003,23(24),8445-52.)对TxIC的线性肽进行两步氧化折叠反
应,过程简述如下:
(Vydac)纯化后,进行碘氧化(10mM iodine in H2O:trifluoroacetic acid:acetonitrile
(78:2:20by volume,10min),移去另外2个半胱氨酸上的Acm,同时在这2个半胱氨酸之间形成第二对二硫键。二环肽再经反相HPLC C18柱(Vydac)纯化,洗脱线性梯度仍为在0-40min
内15-50% B90,第40-45min 50-100% B90.溶剂B90是90% ACN(acetonitrile),10% H2O,
0.5% TFA(trifluoroacetic acid);溶剂A是0.65% TFA的水溶液。紫外吸收值分析在214nm
波长下进行。即获得按照从N端至C端的顺序在相应的半胱氨酸之间定向形成二硫键的α-芋
螺毒素,TxIC的出峰时间为23.366min(图2B),并通过质谱(MS)鉴定为正确。
1492.815Da减少4Da。多肽浓度用280nm波长下比色测定,根据Beer-Lambert方程
(equation)计算多肽浓度和质量。这些定量过的折叠好的毒素肽用于下面实施例中的活性
实验。
subunit to alpha-conotoxinMII[S4A,E11A,L15A].J Biol Chem.2008;283(17):11625-
32.)中的方法,以及体外转录试剂盒(mMessage mMachine in vitro transcription kit
(Ambion,Austin,TX))说明书,制备各种大鼠神经型nAChRs亚型(α3β4,α6/α3β4,α9α10,α4β
2,α4β4,α3β4,α2β2,α2β4,α7)、人类α3β4、以及小鼠肌肉型nAChRs(α1β1δε)的cRNA,其浓度用UV 260nm下的OD值进行测算。解剖收集非洲爪蟾(Xenopus laveis)卵母细胞(蛙卵),将cRNA注射入蛙卵中,每个亚基的注射 量为5ng cRNA。肌肉nAChR每个亚基注射0.5-2.5ng
DNA。蛙卵在ND-96中培养。蛙卵收集后的1-2天内注射cRNA,注射后1-4天内用于nAChRs的
电压钳记录。
1.8mM CaCl2,1.0mM MgCl2,5mM HEPES,pH 7.1-7.5)或含有1mM atropine的ND96(ND96A),流速为1ml/min。所有的芋螺毒素溶液也含有0.1mg/ml BSA以减少毒素的非特异性吸附,用
转换阀(SmartValve,Cavro Scientific Instruments,Sunnyvale,CA)可以在灌注毒素或
乙酰胆碱(ACh)之间进行自由切换,以及一系列三通螺线阀(solenoid valves,model
161TO31,Neptune Research,Northboro,MA)使灌注ND96与ACh等之间进行自由切换。Ach门
控的电流由双电极电压箝放大器(model OC-725B,Warner Instrument Corp.,Hamden,CT)
设置在“慢”箝,以及clamp gain在最大值(×2000)位置时进行在线记录。用1mm外径×0.75内径mm的玻璃毛细管(fiber-filled borosilicate capillaries,WPI Inc.,Sarasota,
FL)拉制玻璃电极,并充满3M KCl作为电压和电流电极。膜电压箝制在-70mV.整个系统均由
电脑控制和记录数据。ACh脉冲为每隔5min自动灌注1s的ACh。ACh的浓度分别为,表达肌肉
型的nAChRs和神经型α9α10 nAChRs卵为10μM;表达神经型的nAChRs之α7为200μM,其它的亚型都为100μM。至少记录4个卵表达某个亚型对不同毒素浓度的电流反应情况,以及电流轨
迹。
12.5nM,与其他已知的芋螺毒素的活性比较见下面的表1。
(nM)c
α3β4 12.5(9.4-16.5) 1 0.19(0.66-1.44) α6/α3β2β3 >10000
α6/α3β4 94.1(73-121) 7.5 0.26(0.73-1.87) α2β2 >10000
α2β4 4550(3950-5230) 524 0.20(1.48-2.42) α9α10 >10000
α4β4 >10000 -- -- α7 >10000
α4β2 >10000 -- -- α1β1δε >10000
护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。