一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法

摘要

本发明涉及微生物领域，公开了一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法。本发明所述方法将中国被毛孢菌落接种于培养基上，在14-20℃温度和65-90%相对湿度的条件下进行菌丝培养35-55天，然后转至10-15℃温度和65-90%相对湿度的条件下诱导分生孢子20-40天，即得中国被毛孢菌成熟分生孢子。本发明将中国被毛孢接种于特定的培养基中，并控制中国被毛孢在不同生长阶段的温度和湿度等条件，制备出大量成熟散落的分生孢子，本发明所述方法提高了中国被毛孢成熟分生孢子的数量，有利于人工培植冬虫夏草的产业化发展。

权利要求

1.一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法，其特征在于，将中国被毛孢菌落接种于培养基上，在14-20℃温度和65-90%相对湿度的条件下进行菌丝培养35-55天，然后转至

10-15℃温度和65-90%相对湿度的条件下诱导分生孢子20-40天，即得中国被毛孢菌成熟分生孢子，所述培养基由60-65mL/100mL质量百分数为1-5%的麸皮液、0.5-1.5g/100mL的蛋白胨、0.5-1.5g/100mL的酵母粉、2-4g/100mL的葡萄糖、30-40g/100mL的大米和

25-35mL/100mL的搅拌均匀的鸡蛋液组成，余量水补足。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述培养基由65mL/100mL质量百分数为2%的麸皮液、1g/100mL的蛋白胨、1g/100mL的酵母粉、3g/100mL的葡萄糖、35g/100mL的大米和30mL/100mL的搅拌均匀的鸡蛋液组成，余量水补足。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述菌丝培养的温度为17-19℃。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述菌丝培养的相对湿度为80-85%。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导分生孢子的温度为12-14℃。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导分生孢子的相对湿度为80-85%。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述菌丝培养的时间为40-50天。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述诱导分生孢子的时间为25-35天。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述质量百分数为1-5%的麸皮液由以下方法制备获得：每100mL水中加入1-5g麸皮，煮沸30min后过滤所得的滤液即为质量百分数为1-5%的麸皮液。

说明书

一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法

[0001] 本申请要求于2012年09月20日提交中国专利局、申请号为201210355665.5、发明名称为“一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

[0002] 本发明涉及微生物领域，具体的说是涉及一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法。

背景技术

[0003] 冬虫夏草是冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)感染并寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上长出的子座（子实体）及幼虫虫体的复合体，属于可食用的真菌，是我国一种传统的名贵滋补中药材，有调节免疫系统功能、抗肿瘤、抗疲劳等多种功效。

[0004] 野生的冬虫夏草仅生长在青藏高原海拔3000-5000米的高山草甸、高原草甸等高寒植被中，由于近年来过度采挖使其产量下降，其价格与20多年前相比已经上涨了1000多倍。因此，我国科研人员一直在进行利用冬虫夏草菌侵染蝙蝠蛾幼虫人工培植冬虫夏草来替代野生冬虫夏草的产业化研究，力图让昂贵的冬虫夏草能够走进寻常百姓家。冬虫夏草要完成产业化，首先必须找到它正确的菌种，然后利用冬虫夏草菌来侵染蝙蝠蛾幼虫，进而培植出冬虫夏草。经过多年的研究，冬虫夏草菌被鉴定为中国被毛孢，又称为蝙蝠蛾被毛孢。

[0005] 人工培植冬虫夏草主要是采用中国被毛孢的菌丝体来侵染蝙蝠蛾幼虫，但是这种常规侵染方法的侵染率不高，使得培植冬虫夏草的成功率受到影响，阻碍了冬虫夏草的产业化发展。随着对人工培植冬虫夏草技术领域的不断探索，有研究表明采用中国被毛孢成熟的分生孢子来侵染蝙蝠蛾幼虫能够明显提高侵染率。因此，人工制备中国被毛孢菌成熟分生孢子的过程就成为影响人工培植冬虫夏草成功率的重要环节。

[0006] 目前只有为数不多的有关利用中国被毛孢来制备分生孢子的报道，如文献“不同因子对冬虫夏草真菌产生分生孢子的研究”（李玉玲，《食用菌》2002年第5期），其论述了中国被毛孢在不同培养基、不同光照以及不同温度下产生分生孢子的研究；又如文献“冬虫夏草菌的动态产孢量及抗异能力”（王伟，杨博，蔡世亮等，《中草药》2002年第33卷第1期），其在文中论述了冬虫夏草菌在PDA、查氏、萨氏培养基中产孢量的研究，但是利用上述文献5 7
中的方法所得到的分生孢子数量不高，只分别达到10和10 数量级的孢子数，且并未说明所得分生孢子是否成熟散落。因此，提供一种能够提高中国被毛孢成熟分生孢子数量的分生孢子制备方法，有利于人工培植冬虫夏草产业化的发展。

发明内容

[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法，使得该方法能够提高中国被毛孢成熟分生孢子的数量。

[0008] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0009] 一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法，将中国被毛孢菌落接种于培养基上，在14-20℃温度和65-90%相对湿度的条件下进行菌丝培养35-55天，然后转至10-15℃温度和65-90%相对湿度的条件下诱导分生孢子20-40天，即得中国被毛孢菌成熟分生孢子，所述培养基由60-65mL/100mL质量百分数为1-5%的麸皮液、0.5-1.5g/100mL的蛋白胨、0.5-1.5g/100mL的酵母粉、2-4g/100mL的葡萄糖、30-40g/100mL的大米和25-35mL/100mL的搅拌均匀的鸡蛋液组成，余量水补足。

[0010] 本发明所述方法采用的中国被毛孢可以通过市售获得，或利用本领域常规技术手段从野生的冬虫夏草上分离获得，所接种的中国被毛孢菌落可通过本技术领域常规方法培养获得，利用扩繁的菌落接种有利于菌丝和分生孢子的生长，这在本领域是公知的。

[0011] 本发明所述培养基优选由65mL/100mL质量百分数为2%的麸皮液、1g/100mL的蛋白胨、1g/100mL的酵母粉、3g/100mL的葡萄糖、35g/100mL的大米和30mL/100mL的搅拌均匀的鸡蛋液组成，余量水补足。其中，所述质量百分数为1-5%的麸皮液可以是每100mL水中加入1-5g麸皮浸泡然后过滤所得的滤液，也可以是搅拌均匀的每100mL水中加入1-5g麸皮的混合液，而作为优选，所述质量百分数为1-5%的麸皮液由以下方法获得：

[0012] 每100mL水中加入1-5g麸皮，煮沸30min后过滤所得的滤液即为质量百分数为1-5%的麸皮液。

[0013] 分生孢子是微生物对于特定条件下的一种应急反应，可以理解为不利环境下，微生物为了不使自身的种属被灭绝而产生的一种更为稳定、耐受性更强的无性繁殖体，因此需要特定的培养基以及培养条件相互协调才能制备得到成熟的分生孢子，其所能适应的培养基以及培养条件范围较窄，而一般的有限次试验根本无法将上述培植条件调整到一个合适的范围，更无法获得适合制备成熟分生孢子的培养基。因此，现有技术少有制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法，而文献“不同因子对冬虫夏草真菌产生分生孢子的研究”（李玉玲，《食用菌》2002年第5期）以及“冬虫夏草菌的动态产孢量及抗异能力”（王伟，杨博，蔡世亮等，《中草药》2002年第33卷第1期）中的方法制备的分生孢子数量不高，而且也未说明分生孢子是否成熟。

[0014] 针对上述问题，申请人在对中国被毛孢生长发育特点深入研究的基础上，经过创造性的劳动，提供了一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法，本发明所述方法分为菌丝培养和分生孢子诱导两个阶段。

[0015] 分生孢子位于分生孢子梗上，而分生孢子梗以及分生孢子的生长依赖于菌丝的生长程度。菌丝过于稠密会消耗掉过多的培养基营养，分生孢子营养不足就不会长出；而菌丝过于稀疏，则不容易长出分生孢子的程度。因此，本发明菌丝培养的时间为35-55天，优选为40-50天，更优选为45天。同时，所述菌丝培养的温度优选为17-19℃，更优选为18℃，所述菌丝培养的相对湿度优选为80-85%。

[0016] 在诱导分生孢子阶段，本发明优化培养条件，降低温度，低温刺激分生孢子的产生，作为优选本发明诱导分生孢子的时间优选为25-35天，更优选为30天。同时，所述诱导分生孢子的温度优选为12-14℃，更优选为13℃，所述诱导分生孢子的相对湿度优选为80-85%。

[0017] 本发明所述方法中对光照无特别限制，可以是散光照射，也可以是12h黑暗和12h光照交替，也可以是完全避光，本发明优选完全避光。

[0018] 利用本发明所述方法制备的分生孢子，经水冲洗镜检可明显看到大量成熟散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子（见图1）。同时，与现有技术的两篇文献（见背景技术）进行产孢对比试验。结果显示，本发明获得的分生孢子无论在分生孢子总数还是成熟散落的分生孢子数上均高于采用现有方法制备的分生孢子数量。

[0019] 经过本发明制备的中国被毛孢成熟分生孢子经无菌水冲洗、过滤，收集沉淀再用无菌水制成菌悬液后即可用于蝙蝠蛾幼虫的侵染。此外，经无菌水冲洗后，进行密度梯度离心，收集沉淀部分可以作为菌种保存。

[0020] 由以上技术方案可知，本发明将中国被毛孢接种于特定的培养基中，并控制中国被毛孢在不同生长阶段的湿度和温度等条件，制备出大量成熟散落的分生孢子，本发明所述方法提高了中国被毛孢成熟分生孢子的数量，有利于人工培植冬虫夏草的产业化发展。

附图说明

[0021] 图1所示为本发明所制备的中国被毛孢成熟分生孢子的镜检图。

具体实施方式

[0022] 本发明实施例公开了一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0023] 为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种制备中国被毛孢成熟分生孢子的方法进行详细说明。

[0024] 实施例1：本发明所述方法制备中国被毛孢成熟分生孢子

[0025] 培养基配方：（质量百分数为2%）麸皮液65ml、蛋白胨1g、酵母粉1g、葡萄糖3g、大米35g、拌匀的鸡蛋液30ml，水补足至100mL；

[0026] 将中国被毛孢菌落接种于上述灭菌后的培养基斜面中，静置于避光、温度18℃、相对湿度85%的培养条件下生长，45d后，培养基生长透彻，表面布满气生菌丝，再静置于避光、温度13℃、相对湿度85%的诱导条件下诱导分生孢子，诱导30d后即获得成熟的分生孢子。经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量成熟散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子（图1），统计结果中分生孢子总数10 9
为1×10 ，成熟分生孢子数量为9×10。

[0027] 实施例2：产孢对比试验

[0028] 参照文献“不同因子对冬虫夏草真菌产生分生孢子的研究”（李玉玲，《食用菌》2002年第5期）以及“冬虫夏草菌的动态产孢量及抗异能力”（王伟，杨博，蔡世亮等，《中草药》2002年第33卷第1期）中的最优方法与实施例1的方法在相同培养环境中制备分生孢子，中国被毛孢菌落为同一菌种且菌落处于同一生长时期，接种量以及培养基体积保持一致，最后用同量的无菌水冲洗统计并镜检，文献其余未说明条件与实施例1相同。

[0029] 其中，文献“不同因子对冬虫夏草真菌产生分生孢子的研究”的最优方法（以下称为对比方法1）为：

[0030] 麦麸培养基（配方见文献），培养条件为20℃、避光。

[0031] 文献“冬虫夏草菌的动态产孢量及抗异能力”的最优方法（以下称为对比方法2）为：

[0032] PDA培养基，培养条件为22.5℃。

[0033] 镜检结果显示，对比方法1和对比方法2中存在明显的孢子梗束，且孢子梗末端都悬有两半月形未成熟分生孢子，而本发明实施例1的镜检结果显示，明显可见大量成熟散落、肾形的分生孢子。

[0034] 分生孢子统计结果见表1。

[0035] 表1产孢量统计结果

[0036]分生孢子总数 成熟分生孢子数
对比方法1 1×105 1×104
对比方法2 1×107 1×106
实施例1 1×1010 9×109

[0037] 由表1可知，本发明所述方法最后所制备的分生孢子总数以及成熟分生孢子数均高于两种对比方法制备的孢子数，表明本发明所述方法够提高中国被毛孢成熟分生孢子的数量。

[0038] 实施例3：本发明所述方法制备中国被毛孢成熟分生孢子

[0039] 培养基配方：（质量百分数为5%）麸皮液60ml、蛋白胨0.5g、酵母粉0.5g、葡萄糖2g、大米40g、拌匀的鸡蛋液35ml，水补足至100mL；

[0040] 将中国被毛孢菌落接种于上述灭菌后的培养基斜面中，静置于散光、温度17℃、相对湿度85%的培养条件下生长，40d后，培养基生长透彻，表面布满气生菌丝，再静置于散光、温度12℃、相对湿度80%的诱导条件下诱导分生孢子，诱导25d后即获得成熟的分生孢子。经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量成熟散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数达到1010数量级，成熟分生孢子数量为109数量级。

[0041] 按照实施例2的方法与本实施例制备的分生孢子对比，其中对比方法1的分生孢子总数达到105数量级，成熟分生孢子数达到104数量级；对比方法2的分生孢子总数达到107数量级，成熟分生孢子数达到106数量级。

[0042] 实施例4：本发明所述方法制备中国被毛孢成熟分生孢子

[0043] 培养基配方：（质量百分数为1%）麸皮液65ml、蛋白胨1.5g、酵母粉1.5g、葡萄糖4g、大米30g、拌匀的鸡蛋液25ml，水补足至100mL；

[0044] 将中国被毛孢菌落接种于上述灭菌后的培养基斜面中，静置于12h黑暗12h光照、温度19℃、相对湿度80%的培养条件下生长，50d后，培养基生长透彻，表面布满气生菌丝，再静置于避光、温度14℃、相对湿度85%的诱导条件下诱导分生孢子，诱导35d后即获得成熟的分生孢子。经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量成熟散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢10 9
子总数达到10 数量级，成熟分生孢子数量为10 数量级。

[0045] 按照实施例2的方法与本实施例制备的分生孢子对比，其中对比方法1的分生孢5 4
子总数达到10数量级，成熟分生孢子数达到10 数量级；对比方法2的分生孢子总数达到
7 6
10数量级，成熟分生孢子数达到10 数量级。

[0046] 实施例5：本发明所述方法制备中国被毛孢成熟分生孢子

[0047] 培养基配方：（质量百分数为3%）麸皮液65ml、蛋白胨1g、酵母粉1g、葡萄糖3g、大米35g、拌匀的鸡蛋液30ml，水补足至100mL；

[0048] 将中国被毛孢菌落接种于上述灭菌后的培养基斜面中，静置于避光、温度14℃、相对湿度65%的培养条件下生长，55d后，培养基生长透彻，表面布满气生菌丝，再静置于避光、温度15℃、相对湿度90%的诱导条件下诱导分生孢子，诱导40d后即获得成熟的分生孢子。经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量成熟散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数达到10 9
10 数量级，成熟分生孢子数量为10 数量级。

[0049] 按照实施例2的方法与本实施例制备的分生孢子对比，其中对比方法1的分生孢5 4
子总数达到10数量级，成熟分生孢子数达到10 数量级；对比方法2的分生孢子总数达到
7 6
10数量级，成熟分生孢子数达到10 数量级。

[0050] 实施例6：本发明所述方法制备中国被毛孢成熟分生孢子

[0051] 培养基配方：（质量百分数为4%）麸皮液65ml、蛋白胨1g、酵母粉1g、葡萄糖3g、大米35g、拌匀的鸡蛋液30ml，水补足至100mL；

[0052] 将中国被毛孢菌落接种于上述灭菌后的培养基斜面中，静置于避光、温度20℃、相对湿度90%的培养条件下生长，35d后，培养基生长透彻，表面布满气生菌丝，再静置于避光、温度10℃、相对湿度65%的诱导条件下诱导分生孢子，诱导20d后即获得成熟的分生孢子。经无菌水冲洗培养基斜面得到悬浮液，用细胞计数法对悬浮液进行统计和镜检，镜检可明显看到大量成熟散落的中国被毛孢菌种肾形分生孢子，统计结果中分生孢子总数达到10 9
10 数量级，成熟分生孢子数量为10 数量级。

[0053] 按照实施例2的方法与本实施例制备的分生孢子对比，其中对比方法1的分生孢5 4
子总数达到10数量级，成熟分生孢子数达到10 数量级；对比方法2的分生孢子总数达到
7 6
10数量级，成熟分生孢子数达到10 数量级。

[0054] 以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。