羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制备方法与应用

摘要

本发明公开一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制备方法与应用。本发明以羊布鲁氏菌M5基因组为模板，PCR得到znuA基因的上、下游同源臂，并将其连接，得到片段ΔznuA；将片段ΔznuA克隆至载体pRE112上，得到重组质粒pRE-ΔznuA；将该质粒导入羊布鲁氏菌M5-Δbp26细胞中，分别通过氯霉素和蔗糖选择培养基筛选，得到同源重组双交换子，为重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA。该菌株较M5亲本菌株，生长特性一致，遗传稳定使其不易返祖，毒力小且免疫效果保持良好，并因bp26基因缺失标记可应用于区分检测自然感染或人工免疫。因此，该菌株可作为一种效果更佳的标记疫苗应用于临床。

权利要求

1.一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)自杀性同源重组质粒的构建

①以羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的引物为P1和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；

P1：5′-GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC-3′；

P2：5′-TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3′；

P3：5′-GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3′；

P4：5′-AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3′；

②利用Overlap PCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，P1和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段ΔznuA；

③用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段ΔznuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段ΔznuA和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA；

(2)羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选

①将自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA导入羊布鲁氏菌M5-Δbp26的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的TSA-YE平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子；

将PCR鉴定正确的同源重组单交换子在TSB-YE中培养，松弛质粒抗性；

②接着将松弛质粒抗性后的同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物P1和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA；

所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基的组成如下：胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基+终浓度为质量体积比7％的蔗糖。

2.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤(1)①中所述的PCR的条件为94℃2min；98℃10s、56℃30s、68℃1.5min，30个循环；68℃5～10min终延伸。

3.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤(1)②中所述的Overlap PCR的条件为94℃2min预变性；98℃10s、56℃30s、

68℃3min，30个循环；68℃5～10min终延伸。

4.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤(2)①中所述的导入的方式为通过电转化方式导入。

5.根据权利要求4所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法，其特征在于：所述的电转化的条件为1mm电极杯，1.8kv，400Ω。

6.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤(2)①中所述的氯霉素在所述的TSA-YE培养基中的终浓度为5μg/mL。

7.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤(2)①中所述的培养的条件为37℃、200r/min摇床上培养36～48h；

步骤(2)②中所述的培养的条件为37℃培养48～96h。

8.根据权利要求1所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法，其特征在于：步骤(2)①中所述的PCR鉴定为通过引物P1和P4进行鉴定；

所述的PCR鉴定的条件如下：94℃2min预变性；98℃10s、56℃30s、68℃3min，30个循环；68℃5～10min。

9.一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的制备方法得到。

10.权利要求9所述的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA在制备用于预防和/或治疗布鲁氏菌病的疫苗中的应用。

说明书

羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制备方法与应

用

技术领域

[0001] 本发明属于重组细菌疫苗领域，特别涉及一株羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制备方法与应用。该菌株是在羊型5号弱毒菌株（M5）缺失其bp26基因的基础上缺失znuA基因得到。

背景技术

[0002] 布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的以流产和发热为特征的人兽共患传染病，由于布鲁菌胞内寄生的特点，防控该病一直是以弱毒疫苗免疫预防为主。目前用于布鲁菌病防控的减毒菌株主要有国外的牛型19号（S19）弱毒菌株和羊型ReV.1弱毒菌株，国内研制的羊型5号（M5）弱毒菌株和猪型2号（S2）弱毒菌株。这些经典的减毒疫苗株在预防和控制布鲁菌病的蔓延和扩散中起到了重要作用。弱毒苗虽造价便宜，免疫保护持续时间长，免疫保护效率高，但同样存在缺陷，致使人们不敢、不愿也不能对其广泛应用。其主要原因一是弱毒苗在接种后无法区别自然感染和人工免疫，广泛应用将对该病流行病学调查、探查疫源及疾病控制和治疗产生很大的障碍；二是弱毒苗毒性相对较大，返祖现象严重，会对人与动物机体造成伤害，甚至发病。所以研制一种能在临床上区分是自然感染还是人工免疫，免疫保护性能好，毒力弱、安全性能高的布鲁氏菌病弱毒疫苗具有重要的实践意义。

[0003] 此外，布鲁氏菌的生存和增殖必须依赖于环境或宿主之中的多种过渡金属离子。尤其锌离子，是布鲁氏菌结构所必须的金属离子，是菌体内催化反应的辅助因子，因此，获得适当程度的锌对细菌来说非常重要。但是由于宿主体内游离的锌离子含量非常少，为了摄取足够的锌保证细菌自身的新陈代谢，并在宿主体内大量增殖，各种细菌如布鲁氏菌进化出几种类型的蛋白参与摄取和转运锌离子，这些转运锌离子的蛋白操纵系统被命名为ZnuABC，此系统包括znuA、znuB、znuC基因编码的多种蛋白，其中ZnuA是一种细胞周质-溶质结合蛋白，目前对该基因的机理研究仍较少，仅推测该ZnuA蛋白与布鲁菌毒力因子相关。其次，BP26蛋白是一种具有强免疫原性的周质蛋白，且几乎存在于所有布鲁菌菌株中，该蛋白具有良好的免疫活性，自然感染或人工免疫后都可以在血清中检测出针对此抗原的特异性抗体，因此常用来作为血清学检验的靶蛋白。

[0004] 为获得一株既能减低毒力、提高安全性，又能维持疫苗的高效免疫原性，且能在临床应用中可进行区分检测诊断的布鲁氏菌病弱毒疫苗，我们将表达BP26和ZnuA蛋白的基因分别敲除，以获得一株羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA及制备方法和应用，为制备更为安全有效的新型基因工程疫苗奠定基础，为进一步研究布鲁菌外膜蛋白BP26与金属离子转运蛋白ZnuABC的协同作用提供参考。

发明内容

[0005] 为了克服上述现有疫苗的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法。

[0006] 本发明另一目的在于提供通过上述制备方法得到的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA。

[0007] 本发明再一目的在于提供上述羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA在制备用于预防和/或治疗布鲁氏菌病的疫苗中的应用。

[0008] 本发明的目的通过下述方案实现：

[0009] 一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的制备方法，包括以下步骤：

[0010] （1）自杀性同源重组质粒的构建

[0011] ①以羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）M5基因组DNA为模板进行PCR，使用的引物为P1和P2时，得到znuA基因的上游同源臂；使用的引物为P3和P4时，得到znuA基因的下游同源臂；

[0012] P1：5′-GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC-3′（横线部分为KpnI酶切位点）；

[0013] P2：5′-TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3′；

[0014] P3：5′-GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3′；

[0015] P4：5′-AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3′（横线部分为Sac1酶切位点）；

[0016] ②利用Overlap PCR的方法，以步骤①中制备的znuA基因的上游同源臂和znuA基因的下游同源臂为模板，P1和P4为引物对，得到用于同源重组的目的片段ΔznuA；

[0017] ③用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和用于同源重组的目的片段ΔznuA进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段ΔznuA和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA；

[0018] （2）羊布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选

[0019] ①将自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA导入羊布鲁氏菌M5-Δbp26的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSA-YE）平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子；将PCR鉴定正确的同源重组单交换子在胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉汤培养基（TSB-YE）中培养，松弛质粒抗性；

[0020] ②接着将松弛质粒抗性后的同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物P1和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA；

[0021] 步骤（1）①中所述的PCR的条件优选为94℃2min预变性；98℃10s、56℃30s、68℃1.5min，30个循环；68℃5～10min终延伸；

[0022] 步骤（1）②中所述的Overlap PCR的条件优选为94℃2min预变性；98℃10s、56℃30s、68℃3min，30个循环；68℃5～10min终延伸；

[0023] 步骤（2）①中所述的导入的方式优选为通过电转化方式导入；

[0024] 所述的电转化的条件优选为1mm电极杯，1.8kv，400Ω；

[0025] 步骤（2）①中所述的氯霉素在所述的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基中的终浓度优选为5μg/mL；

[0026] 步骤（2）①中所述的培养的条件优选为37℃、200r/min摇床上培养18h；

[0027] 步骤（2）①中所述的PCR鉴定为通过引物P1和P4进行鉴定；

[0028] 步骤（2）①中所述的PCR鉴定的条件优选如下：94℃2min预变性；98℃10s、56℃30s、68℃3min，30个循环；68℃5～10min；

[0029] 步骤（2）②中所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基的组成如下：胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSA-YE）+终浓度为质量体积比（g/mL）7%的蔗糖；

[0030] 所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基优选通过如下步骤制备得到：将配制好的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSA-YE）灭菌后，降温至60～70℃时加入经过滤除菌的浓度为质量体积比（g/mL）50%的蔗糖，使得蔗糖的终浓度为质量体积比（g/mL）7%，混合均匀后分装入灭菌平皿内，凝固后4℃保存。

[0031] 步骤（2）②中所述的培养的条件优选为37℃培养48～96h；

[0032] 一株羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA，通过上述制备方法得到。

[0033] 上述羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA在制备用于预防和/或治疗布鲁氏菌病的疫苗中的应用。

[0034] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

[0035] （1）本发明提供的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA由于bp26基因的缺失可以作为一种标记疫苗株用于临床，从而有效的区分自然感染与人工免疫。由于znuA基因的缺失使得该株较亲本株M5毒力降低、安全性提高；遗传稳定不易返祖；同时，还能保持较好的免疫原性。

[0036] （2）本发明提供的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA这种双缺失疫苗株较单缺失株M5-Δbp26和M5-ΔznuA也均有明显的毒力减弱、安全性高，保持良好免疫原性的优点。

[0037] （3）实验证明本发明提供的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA具有良好的遗传稳定性，其生长特性和免疫保护效果与羊布鲁氏菌M5相比无明显差异。

[0038] （4）本发明提供的羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA为制备更为安全有效的新型基因工程疫苗奠定基础，为进一步研究布鲁菌外膜蛋白BP26与金属离子转运蛋白ZnuA的协同作用提供参考。

附图说明

[0039] 图1是znuA基因的上、下游同源臂基因片段及其上、下游同源臂基因片段Overlap PCR得到的基因片段ΔznuA的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为znuA的上游同源臂基因片段，泳道2为znuA的下游同源臂基因片段，泳道3为znuA基因的上、下游同源臂基因片段相连得到的基因片段ΔznuA。

[0040] 图2是pRE-ΔznuA酶切验证结果的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为未经酶切的pRE-ΔznuA质粒，泳道2为使用KpnI和SacI双酶切pRE-ΔznuA质粒后得到的片段。

[0041] 图3是羊布鲁氏菌基因缺失株M5-Δbp26-ΔznuA同源重组单交换子筛选的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为pRE-ΔznuA阳性对照，泳道2为M5阳性对照，泳道3～8为M5-Δbp26-ΔznuA株同源重组单交换子；泳道9为空白对照。

[0042] 图4是羊布鲁氏菌基因缺失株M5-Δbp26-ΔznuA同源重组双交换子筛选的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为pRE-ΔznuA阳性对照，泳道2为M5阳性对照，泳道3～20为同源重组双交换子，泳道21为空白对照。

[0043] 图5是羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA遗传稳定性的验证结果图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为pRE-ΔznuA阳性对照，泳道2为M5阳性对照，泳道
3～12分别为M5-Δbp26-ΔznuA第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20代菌落，泳道13为空白对照。

[0044] 图6是羊布鲁氏菌亲本株M5和重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA生长曲线的测定结果图。

[0045] 图7 是 羊 布 鲁 氏 菌 亲 本 株M5、重 组 菌 株M5-Δbp26、M5-ΔznuA 和M5-Δbp26-ΔznuA分别免疫小鼠后对小鼠脾脏重量影响的结果图。

[0046] 图8 是 羊 布 鲁 氏 菌 亲 本 株M5、重 组 菌 株M5-Δbp26、M5-ΔznuA 和M5-Δbp26-ΔznuA分别免疫小鼠后对小鼠脾脏菌数量检测的结果图。

[0047] 图9是羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA免疫小鼠后小鼠血清特异性抗体的ELISA检测结果图。

[0048] 图10 是 羊 布 鲁 氏 菌 亲 本 株M5、重 组 菌 株M5-Δbp26、M5-ΔznuA 和M5-Δbp26-ΔznuA免疫小鼠6周后小鼠血清特异性抗体的间接ELISA检测结果图。

具体实施方式

[0049] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0050] 实施例中所涉及的材料：

[0051] ①KOD FX DNA Polymerase高保真酶购自TOYOBO公司；限制性内切酶Kpn I、Sac I、T4DNA连接酶、DNA Marker等购于TaKaRa公司；胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒为Omega公司产品；QIAamp DNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品；胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、琼脂粉购于广东环凯微生物科技有限公司；酵母提取物（Yeast Extract，简称YE）购自OXOID公司。

[0052] 胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉汤培养基（TSB-YE）通过如下步骤制备得到：胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）30g、YE2g，溶解于1000mL三蒸水中，加热搅拌均匀，121℃高压灭菌15min，冷却后置于4℃保存。

[0053] 胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSA-YE）通过如下步骤制备得到：胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）30g、YE2g，溶解于1000mL三蒸水中，加入琼脂粉至终浓度为1.5%（w/v），加热搅拌均匀后，121℃高压灭菌15min，待冷却至60℃左右分装入灭菌平皿内，凝固后4℃保存。

[0054] 含氯霉素的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSA-YE）通过如下步骤制备得到：将配制好的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSA-YE）灭菌后，降温至40～50℃时加入氯霉素（终浓度为5μg/mL），混合均匀后分装入灭菌平皿内，凝固后4℃保存。

[0055] TSA-YE-Sucrose选择培养基通过如下步骤制备得到：将配制好的胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSA-YE）灭菌后，降温至60～70℃时加入经过滤除菌的浓度为质量体积比（g/mL）50%的蔗糖，使得蔗糖的终浓度为质量体积比（g/mL）7%，混合均匀后分装入灭菌平皿内，凝固后4℃保存。

[0056] ②羊布鲁氏菌（Brucella melitensis）M5株购于新疆天康畜牧生物技术股份有限公司。

[0057] ③以下生物材料均已在文献“布鲁氏菌bp26基因缺失株的构建，中国兽医科学，2011,41（03）：280-286”中公开：羊布鲁氏菌基因缺失株M5-Δbp26、大肠杆菌DH5αλpir（基因型为supE44ΔlacU169(φ80lacZΔM15)hsdR17recA1endA1gyrA96thi-relA1λpi）、及pRE112自杀质粒（cat,sacB,oriTRP4,oriVR6K,MCS）。

[0058] ④以下方法均已在专利申请“牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用,201310153715.6”中公开：BL融合蛋白的制备方法。

[0059] 实施例1

[0060] （1）自杀性同源重组质粒的构建

[0061] ①布鲁氏菌基因组DNA的提取：按照QIAamp DNA抽提试剂盒说明提取羊布鲁氏菌M5株基因组DNA。

[0062] ②引物的设计与合成：参考Genbank中羊布鲁氏菌（CP001489.1）的基因序列，根据实验的需求设计引物，如表1所示。其中引物P1和P2用于扩增znuA基因的上游同源臂、引物P3和P4用于扩增znuA基因的下游同源臂，并分别于引物P1和P4的5′端引入KpnI和SacI的酶切位点。上述引物均由上海立菲生物技术有限公司合成。

[0063] 表1用于扩增不同基因片段的PCR引物序列

[0064]引物名称 序列5′→3′
P1 5′-GATGGTACCCGTCCTCGTTTGCTTGTGC-3′
P2 5′-TCGCTGAAAGACTGCCTGT-3′
P3 5′-GCAGTCTTTCAGCGAAGCCAGAAAGGCAGAAGC-3′
P4 5′-AGAGAGCTCCAATGTCCCCTTGGTCCC-3′

[0065] ③不同基因片段的PCR扩增：以羊布鲁氏菌M5株的基因组DNA为模板，用相应的引物（P1/P2、P3/P4）分别扩增znuA基因的上、下游同源臂片段；利用Overlap PCR的方法，以znuA基因的上、下游同源臂为模板，用引物P1和P4进行扩增，获得前后臂相连的缺失znuA基因的片段ΔznuA。扩增znuA基因的上、下游同源臂的PCR反应体系为：2×L Buffer12.5μL，dNTPs5μL，P1（P3）和P2（P4）各1μL，KOD-FX酶0.5μL，DNA模板1.0μL，加入ddH2O使总体积达到25μL；反应程序为：94℃2min；98℃10s、56℃30s、
68℃1.5min，30个循环，68℃5～10min。扩增ΔznuA片段的Overlap PCR反应体系为
2×L Buffer12.5μL，dNTPs5μL，P1和P4各1.0μL，KOD-FX酶1.5μL，znuA基因上游同源臂1.0μL和znuA基因下游同源臂1.0μL，加入ddH2O使总体积达到25μL：反应程序为：
94℃2min；98℃10s、56℃30s、68℃3min，30个循环，68℃5～10min。

[0066] 通过质量体积比（g/mL）1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示，znuA基因的上游同源臂的大小为1149bp，znuA基因的下游同源臂的大小为1098bp，znuA基因的上、下游同源臂基因片段相连获得的基因片段ΔznuA的大小为2247bp，与理论值相符。

[0067] ④自杀性同源重组质粒的构建：用KpnI和SacI分别对自杀性质粒载体pRE112和ΔznuA进行双酶切，其中，质粒pRE112双酶切反应体系为：10×LBuffer2.0μL，KpnI和SacI各2.0μL，pRE112（浓度≤1μg/μL）2.0μL，加入ddH2O使总体积达到20μL；DNA片段ΔznuA双酶切反应体系为：10×L Buffer2.0μL，KpnI和SacI各2.0μL，ΔznuA6.0μL，加入ddH2O使总体积达到20μL。将酶切后纯化回收的片段ΔznuA和载体片段pRE112用T4DNA连接酶（反应体系和反应条件按说明书操作）连接，并将连接产物转化入大肠杆菌DH5αλpir，经PCR（使用引物P1和P4）鉴定正确的阳性克隆进行质粒抽提，KpnI和SacI双酶切验证，结果如图2所示，酶切后获得的片段与目的片段大小相同，进行基因测序，得到的序列与ΔznuA的序列完全一致，表明得到自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA。

[0068] （2）羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的构建及筛选

[0069] ①羊布鲁氏菌基因缺失株M5-Δbp26感受态细胞的制备：接种M5-Δbp26株的单菌落于100mL TSB-YE培养基中，37℃、200r/min摇床上培养，培养至OD600约为0.6，冰上冷却30min。4000r/min离心10min，弃去培养基，用体积百分比10%的甘油水溶液洗涤3次。最后将获得的菌体重悬于2.5mL体积百分比10%的甘油水溶液中，即得到羊布鲁氏菌M5-Δbp26感受态细胞。按100μL/管分装于预冷的微量离心管中，置-80℃冰箱保存备用。

[0070] ②通过电转化，Bio-rad电击杯1mm，1.8kv，400Ω将重组自杀性质粒pRE-ΔznuA导入羊布鲁氏菌基因缺失株M5-Δbp26感受态细胞中，将电转后的菌液涂布于含有氯霉素（5μg/mL）的TSA-YE平板上，37℃培养48h以上，在氯霉素的选择压力下，得到pRE-ΔznuA整合入羊布鲁氏菌缺失株M5-Δbp26基因组上的同源重组单交换子。利用引物P1和P4对菌落进行PCR筛选，PCR反应程序是：94℃2min预变性；98℃10s、56℃30s、68℃4min，30个循环；68℃5～10min。PCR鉴定结果如图3所示，分别在3180bp与2247bp处有条带，证明得到同源重组单交换子。

[0071] ③将菌落PCR鉴定正确的同源重组单交换子在TSB-YE中、37℃、200r/min摇床上培养18h，松弛质粒抗性后，适当稀释涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上，37℃培养48h以上，利用质粒pRE-ΔznuA中sacB基因对蔗糖的敏感性，获得同源重组双交换子。利用引物P1和P4对菌落进行PCR筛选，PCR反应程序是：94℃2min预变性；98℃10s、56℃30s、68℃4min，30个循环；68℃5～10min。在TSA-YE-Sucrose平板上生长的同源重组双交换子存在两种情况：一是pRE-ΔznuA重新从染色体上缺失（回复突变）；二是ΔznuA基因整合到基因组，而亲本znuA基因交换到载体中丢失，对同源重组双交换子做PCR鉴定结果如图
4所示，条带为2247bp（即泳道4、5、7、12）的同源重组双交换子即为所要筛选的羊布鲁氏菌重组菌株，将其命名为羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA。

[0072] （3）羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的遗传稳定性验证

[0073] 将所获得的M5-Δbp26-ΔznuA在TSA-YE平板上连续传至20代，以引物P1、P4对TSA-YE平板上的菌落进行PCR扩增，每两代进行一次菌落PCR和测序鉴定，验证重组菌的遗传稳定性，结果如图5所示，都扩增得到2247bp的条带，表明M5-Δbp26-ΔznuA具有良好的遗传稳定性。

[0074] （4）羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA的生长曲线测定

[0075] 将亲本株M5和重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA分别划线于TSA-YE平板上，待长出单个菌落后，将单个菌落接种到新鲜的TSB-YE培养液中，37℃、220r/min摇菌约20h，至细菌达到对数生长期，收集菌体，将菌液浓度调整为同一数值（OD600=0.6），按照体积比1:100的比例接种于200mL TSB-YE培养液中，37℃、200r/min培养，每隔4h取出一定量的菌液，测定OD值并做10倍系列稀释，涂于TSA-YE平板培上，每个稀释度3个平板。待菌落长出后，计数并统计，绘制生长曲线如图6所示，经统计学分析两种菌株的生长特性均无显著性差异。

[0076] （5）羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA毒力检测试验

[0077] ①羊布鲁氏菌重组菌株M5-ΔznuA的制备：是将步骤（1）得到的自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA转化入羊布鲁氏菌M5株，羊布鲁氏菌M5株感受态细胞的制备以及将自杀性同源重组质粒pRE-ΔznuA转化入羊布鲁氏菌M5株、同源重组单、双交换子的获得方法按步骤（2）操作即可。

[0078] ②将60只5～6周龄的雌性BALB/c小鼠（广东省医学实验动物中心），按每组128
只分成5组。按1×10CFU/只小鼠的接种剂量分别腹腔接种M5、M5-ΔznuA、M5-Δbp26和M5-Δbp26-ΔznuA，同时以10mM、pH7.4的PBS溶液作为空白对照组。在接种后的第2、4、
6、8周将BALB/c小鼠颈部拉断处死，每组3只，眼球静脉采血，离心取血清。无菌取脾脏称重并将脾脏匀浆，匀浆后将其作10倍系列稀释，取100μL涂TSA-YE平板，37℃培养，菌落出现后进行数据统计分析。

[0079] 图7的结果显示，从脾脏重量变化来看，在免疫小鼠2周后，M5-Δbp26-ΔznuA所引起的脾脏肿胀程度即炎症反应强度均明显弱于亲本株M5，二者有显著性差异，同样也明显弱于两个单缺失株M5-ΔznuA和M5-Δbp26，差异显著；同时，如图8所示，从脾脏菌数量变化数据可知，免疫小鼠2周后，M5-Δbp26-ΔznuA菌株在小鼠体内（脾脏中）的菌数量较亲本株M5和单缺失株M5-ΔznuA、M5-Δbp26少，存在显著性差异，并在接下来的免疫期内一直维持较低菌数量状态；在免疫后的4、6、8周，M5-Δbp26-ΔznuA菌株在小鼠脾脏中呈现逐渐减少被排除清理出体外的过程，且该过程中M5-Δbp26-ΔznuA菌株被排除的速度仍快于亲本株M5与两个单缺失株M5-ΔznuA和M5-Δbp26，具有显著性差异，最终在第8周时可观察到小鼠机体将双缺失M5-Δbp26-ΔznuA菌株基本清除干净。以上结果表明M5-Δbp26-ΔznuA较亲本株M5以及单缺失株M5-ΔznuA、M5-Δbp26具有引起机体炎症反应较弱、毒力更小、安全性更佳的优点。

[0080] （6）羊布鲁氏菌重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA特异性抗体水平检测试验[0081] 将60只5～6周龄的雌性BALB/c小鼠（广东省医学实验动物中心），按每组125
只分成5组。按5×10CFU/mice的接种剂量分别腹腔接种M5、M5-ΔznuA、M5-Δbp26和M5-Δbp26-ΔznuA，同时以10mM、pH7.4的PBS溶液作为空白对照组。在接种后的第2、4、
6、8周将BALB/c小鼠颈部拉断处死，每组3只，眼球静脉采血，离心取血清作为待检样本，用本实验室制备的BL融合蛋白作为抗原包被ELISA板，检测血清中抗BL的特异性抗体的水平，并进行统计学分析，步骤如下：

[0082] ①BL融合蛋白的制备：按专利申请201310153715.6实施例1步骤（6）①制备，具体如下：用KpnI和SacI分别对pET32a表达载体和基因测序正确的Δbp26-BL进行双酶切，双酶切的反应体系为：10×L Buffer2.0μL，KpnI和SacI各2.0μL，pET32a（浓度≤1μg/μL）2.0μL，Δbp26-BL6.0μL，加入ddH2O使总体积达到20μL。将纯化回收的片段Δbp26-BL和载体片段pET32a用T4DNA连接酶（反应体系和反应条件按说明书操作）连接，并将连接产物转化入表达菌大肠杆菌BL21(DE3)（购自Novagen公司，产品编号：69449-3）中。挑取BL-pET-Δbp26-BL单菌落接种于含氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB液体培养基中，37℃、200r/min过夜培养后。取上述培养菌按体积比1:50比例接种于新鲜的含氨苄青霉素（终浓度为100μg/mL）的LB培养液中，37℃、200r/min培养3h，加入IPTG（终浓度为1.5mmol/L）诱导时间4h，收集菌体。超声破碎后，经HisTrapFF纯化重组蛋白，获得纯化好的BL融合蛋白。

[0083] ②BL-iELISA方法检测M5-Δbp26-ΔznuA特异性抗体水平：将纯化后的BL融合蛋白作为包被抗原，用包被液（pH=9.60.05mol/L碳酸盐缓冲液：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g加蒸馏水至1L）稀释成100μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜，用洗涤缓冲液PBST（在pH=7.4，0.15M磷酸盐缓冲液加入Tween-20，Tween-20的终浓度为体积百分比0.05%，具体组成如下：KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、NaCl8g、KCl0.2g、Tween-200.5mL，蒸馏水定容至1L）洗涤3次，每次3min，拍干；每孔加入质量体积比（g/mL）1%的脱脂奶粉200μL，37℃封闭3h，洗涤方法同上；分别用上述采集的M5、M5-Δbp26-ΔznuA、M5-Δbp26和M5-ΔznuA菌株免疫小鼠2、4、6、8周后的血清作为待检血清（P值），PBS免疫小鼠的2～8周血清作为空白对照（N值），20μL/孔加入酶标板竖列第一孔，再按第一竖列孔180μL/孔，其余100μL/孔加入二抗稀释液，进行横向10倍倍比稀释，37℃作用1h，洗涤方法同上；每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠HRP-IgG（1:5000）100μL，37℃作用1h，PBST洗涤5次，每次3min，拍干；每孔加入100μL的底物显色液TMB（底物缓冲液：Na2HPO414.6g、柠檬酸
9.33g、0.75%H2O26.4mL，pH=5.4，蒸馏水定容至1L；TMB使用液：TMB200g、无水乙醇100mL；
使用时取底物缓冲液950μL和TMB使用液50μL混合，即为显色液），37℃暗室作用10min，再加入终止液（2mol/L硫酸）50μL终止反应，在2min内用酶标检测仪测定OD450nm值。

[0084] 结果如图9所示，重组菌株M5-Δbp26-ΔznuA实验组中小鼠特异性抗体在免疫第6周，血清稀释比1：80时达到最高。同时，从图10可知，在免疫第6周双缺失菌株M5-Δbp26-ΔznuA较亲本株M5、单缺失株M5-Δbp26和M5-ΔznuA产生的特异性抗体量最高，呈显著差异。从而可以推测，新型疫苗株M5-Δbp26-ΔznuA在降低毒力的同时，仍能刺激机体产生高浓度的抗体，保持高质的免疫效果不减。

[0085] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。