一种猪链球菌7型PCR检测试剂盒

摘要

本发明涉及一种试剂盒，更具体的讲是一种猪链球菌7型PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括18μL的PCR缓冲液、30μL超纯水、3μLMarker DL2000，3μL15pmol/μL上引物，3μL浓度为15pmol/μL的下引物，3μL聚合酶，18μL质量浓度为10%的SDS，15μL的TE缓冲液，5μL阴性对照，5μL阳性对照。发明的有益效果是：本发明拥有PCR检测技术的检测快的优点，而且本试剂盒造价低、采用了特殊的引物，可以满足最低为0.00984ng基因片段PCR产物的检测，检测灵敏性高。

权利要求

1.一种猪链球菌7型PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括18μL的PCR缓冲液、30μL超纯水、3μLMarker DL2000，3μL15pmol/μL上引物，3μL浓度为15pmol/μL的下引物，3μL聚合酶，18μL 质量浓度为10%的SDS， 15μL的TE缓冲液，5μL阴性对照，5μL阳性对照，所述上引物的序列为5′-AGCTCTAACACGAAATARRRR-3′，下引物的序列为5-GTCAAACACCCTGGATAGCCG-3′。

2.根据权利要求1所述的一种猪链球菌7型PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阴性对照为非猪链球菌7型的DNA片段。

3.根据权利要求1所述的一种猪链球菌7型PCR检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照为标准猪链球菌7型的PCR产物。

说明书

一种猪链球菌7型PCR检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种试剂盒，更具体的讲是一种猪链球菌7型PCR检测试剂盒。

背景技术

[0002] 猪链球菌(Streptococcus suis, S. suis) 猪链球菌呈圆形或卵圆形，常呈链状排列，长短不一，是革兰氏阳性球菌。在血平板培养基上生长，菌落周围形成溶血环。现已发现其荚膜抗原血清型有35种以上。致病因子有荚膜、溶菌酶释放蛋白(MRP)、细胞外因子(EF)、溶血素。荚膜可以保护细菌，抵抗吞噬。溶菌酶释放蛋白、细胞外因子的存在提高了菌株的致病力。本菌抵抗力不强，对干燥、湿热均较敏感，常用消毒药都可将其杀死，感染己经成为全世界养猪业的主要问题之一。其可引起猪的脑膜炎，败血症，心内膜炎，肺炎及关节炎等，也可引起人的脑膜炎甚至死亡，目前，己发现35 种血清型，即1～34 型及1/2 型，猪链球菌2 型是全世界被最频繁分离到的血清型。而在丹麦，除2 型菌株之外，7 型菌株也是被经常分离到的血清型之一。随着7 型菌株在全世界病猪中的频繁发现，对其各方面特性的研究也就显得非常必要。2006 年入夏以来,我国的浙江、江西、安徽、江苏、湖南等省的部分地区，流行以高热为主要特征的猪病疫情，并迅速蔓延。中国动物疫病预防控制中心医诊断室于2006 年9 月底正式认定“无名高热症”的主要病原为变异猪蓝耳病病毒，但有报道表明猪链球菌是一种重要的细菌性病原。因此，在高热症中是否存在猪链球菌7 型以及7 型所起的作用也值得关注，但是目前并没有一种方便快捷的用于检测猪链球菌7型的试剂盒，这是现有技术中的不足。

发明内容

[0003] 本发明的发明目的在于针对现有技术中的不足，提供一种快速、准确、简便的猪链球菌7型PCR检测试剂盒。

[0004] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0005] 一种猪链球菌7型PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括18μL的PCR缓冲液、30μL超纯水、3μLMarker DL2000，3μL15pmol/μL上引物，3μL浓度为15pmol/μL的下引物，3μL聚合酶，18μL 质量浓度为10%的SDS， 15μL的TE缓冲液，5μL阴性对照，5μL阳性对照。

[0006] 上述PCR缓冲液由25 mmol/L MgCl2 3μL，10×PCR buffer 10μL，10mmol/L dNTPx2μL。

[0007] 上述上引物的序列号为5′-AGCTCTAACACGAAATARRRR-3′，下引物的序列号为5′-GTCAAACACCCTGGATAGCCG-3′。

[0008] 上述阴性对照为非猪链球菌7型的DNA片段。

[0009] 上述阳性对照为标准猪链球菌7型的PCR产物。

[0010] 上述上引物中R为简并引物。

[0011] 反应步骤：第一步50 min 50℃，1个循环；第二步94℃3 min，1个循环；第三步94℃1 min，52℃1 min，72℃2 min，35个循环，第四步72℃延伸7min，1个循环[0012] 取5μL上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，以Marker DL2000作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，以5V/cm电泳1h，凝胶成像系统观察结果;

[0013] 回收目的条带，16℃ 1.5 h连接至PMD19-T Easy Vector，转化感受态DH5α，均匀涂布于含Amp、IPTG和X-gal的LB固体培养基平板，37℃培养16h,挑取白色菌落小量培养，提取质粒作PCR扩增鉴定,将阳性菌液测序，并采用非猪链球菌7型DNA片段作为阴性对照，标准猪链球菌7型DNA片段作为阳性对照。

[0014] 本发明的有益效果是：本发明拥有PCR检测技术的检测快的优点，而且本试剂盒造价低、采用了特殊的引物，可以满足最低为0.00984ng基因片段PCR产物的检测，检测灵敏性高。

附图说明

[0015] 图1为本发明敏感性实验结果图；

[0016] 1-98.4ng基因片段PCR产物，2-9.84 ng基因片段PCR产物，3-0.984ng基因片段PCR产物，4-0.0984ng基因片段PCR产物，5-0.00984ng基因片段PCR产物,6-0.000984ng基因片段PCR产物。

[0017] 图2为本发明电泳实验结果图

[0018] 1-Marker DL2000，2-PCR产物（250bp），3-标准菌株PCR产物（250bp），4-阴性对照。

具体实施方式

[0019] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明，以便本领域技术人员可以更好的了解本发明，但并不因此限制本发明。

[0020] 实施例1

[0021] 一种猪链球菌7型PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括18μL的PCR缓冲液、30μL超纯水、3μLMarker DL2000，3μL15pmol/μL上引物，3μL浓度为15pmol/μL的下引物，3μL聚合酶，18μL 质量浓度为10%的SDS， 15μL的TE缓冲液，5μL阴性对照，5μL阳性对照。

[0022] 上述PCR缓冲液由25 mmol/L MgCl2 3μL，10×PCR buffer 10μL，10mmol/L dNTPx2μL。

[0023] 上述上引物的序列号为5′-AGCTCTAACACGAAATARRRR-3′，下引物的序列号为5′-GTCAAACACCCTGGATAGCCG-3′。

[0024] 上述阴性对照为非猪链球菌7型的DNA片段。

[0025] 上述阳性对照为标准猪链球菌7型的PCR产物。

[0026] 上述上引物中R为简并引物。