鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用

摘要

本发明公开了一种鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。本发明所提供的PCR引物对由两条单链DNA组成，所述两条单链DNA是序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的单链DNA。可对样品中H9亚型AIV的HA基因进行特异性扩增，目的片断长度为425bp。该方法对H3、H4、H5等其它亚型AIV以及新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊炎病毒、鸡传染性喉气管炎病毒等无交叉反应；对病毒尿囊液的最低检出量为1×104.25EID50/100μL；与病毒的血凝抑制试验等常规方法相比，鉴定结果符合率为100％。为H9亚型AIV的鉴定提供了一种快速、特异、敏感的检测手段，可用于H9亚型AIV引起疾病的快速诊断，在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

权利要求

1.一种鉴定H9亚型禽流感病毒的RT-PCR检测方法，所述方法为：(1)样品的采集与处理、(2)总RNA的提取、(3)反转录合成cDNA、(4)PCR扩增；其中：所述总RNA的提取步骤为：

1)取感染H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的鸡胚尿囊液300μL于无RNA酶的1.5mL离心管中，加入900μL Trizol试剂，Invitrogen，两者比例为1∶3，轻轻颠倒混匀10次，使核蛋白复合体完全溶解；

2)加入200μL三氯甲烷，颠倒混匀10次，冰浴放置5分钟，期间轻轻颠倒混匀；

4℃12000rpm离心15min；

3)将水相，700μL，移至一个新的无RNA酶1.5mL离心管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀数次，-20℃放置10分钟后，4℃12000rpm离心15分钟，弃去上清；

4)用1mL75％无RNA酶的冰乙醇洗涤，瞬时离心，弃上清，用黄枪头吸干，瞬时离心，再用白枪头吸干，置冰上干燥沉淀5～10min，使乙醇挥发；

5)将干燥的RNA用11μL DEPC水溶解，即用或-80℃保存备用；

所述反转录合成cDNA步骤为：

1)将Oligo引物，20pmol/μL，1μL加到含RNA的11μL DEPC水中，瞬时离心，65℃水浴5min后，置于冰上5min，使RNA线性化；

2)反转录体系共20μL：由Oligo引物1μL；总RNA11μL；5×Reaction，4μL；

10mMdNTP Mix 2μL；RibolockTMRnase Inhibitor，20U/μL，1μL；Revert AidTM M-MuLVReverse Transcriptase，200U/μL，1μL组成；

3)所述的RNA线性化步骤1)完成后，依次加入反转录体系中的其余4种成分，混匀，瞬时离心；

反应条件：37℃水浴1h，65℃5min，4℃保存；

所述PCR扩增步骤为：

1)采用总体积为25μL的反应体系：2×PCR MIX buffer 12.5μL；其中，PCR MIX buffer 的成分为Easy Taq RNA聚合酶、dNTPS及反应缓冲液；浓度为20pmol/μL，序列表SEQ ID NO：1引物1μL；浓度为20pmol/μL，序列表SEQ ID NO：2引物1μL；ddH2O补足至

25μL；

2)双重RT-PCR循环条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火35s，72℃延伸

35s，从第二步开始进行34个循环，然后72℃延伸10min；

3)取PCR产物5μL用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳；H9N2亚型禽流感病毒扩增出

425bp的目的条带，与预期产物大小相符。

说明书

鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。

背景技术

[0002] H9亚型禽流感病毒是一种低致病性的流感病毒，1994年H9N2亚型AIV在我国广东被首次分离，十几年来，H9亚型禽流感在我国呈上升趋势，特别是在并发或继发细菌感染时，可造成严重的经济损失。目前H9亚型AIV在我国广泛存在，是影响我国养禽业的主要AIV亚型。严重影响我国养禽业的发展。H9亚型AIV除了感染禽类以外，还可使人受到感染。因此，建立一种针对H9亚型禽流感病毒的的检测方法，既可以对H9亚型禽流感病毒快速、准确地鉴定，又可以用于H9亚型禽流感病毒的流行病学调查。

[0003] 传统的血凝抑制试验(HI)对H9亚型AIV的鉴定需要多种亚型的血清和抗原，费时费力，不能及时做出诊断或对病毒进行鉴定。目前还没有针对H9亚型流感病毒进行检测的实用的分子生物学方法。本发明所提供的PCR引物对可用于H9亚型AIV引起疾病的快速诊断，在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对及其应用。

[0005] 本发明所提供的PCR引物对，由两条单链DNA组成，所述两条单链DNA是序列表中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示的单链DNA。

[0006] 本发明所提供的PCR引物对，可用于制备鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒试剂或试剂盒，或用于制备诊断或辅助诊断H9亚型禽流感病毒试剂或试剂盒。

[0007] 含有所述的PCR引物对的试剂或试剂盒均属于本发明的保护范围。

[0008] 所述的PCR引物对的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体可包括将所述的PCR引物对中的两条单链DNA分别单独包装的步骤。

[0009] 所述鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。该制备方法具体包括如下步骤：将所述的PCR引物对中所述的两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种物质包装在同一试剂盒内：DNA聚合酶和4种dNTP(dATP，dTTP，dCTP，dGTP)。

[0010] 本发明所提供的引物对的应用中PCR反应体系及最佳循环条件也属于本发明的保护范围。

[0011] 本发明所提供的PCR引物对可用于检测H9亚型禽流感病毒。

[0012] 本发明所提供的PCR引物对可用于检测不同来源的H9亚型禽流感病毒，尤其适合检测鸡源的H9亚型禽流感病毒。

[0013] 本发明所提供的PCR引物对用于检测H9亚型禽流感病毒特异性强，灵敏度可4.25
达1×10 EID50/100μL。与病毒的血凝抑制试验等常规方法相比，鉴定结果符合率为
100％。为H9亚型AIV的鉴定提供了一种快速、特异、敏感的检测手段，可用于H9亚型AIV引起疾病的快速诊断，在临床诊断和流行病学调查方面具有较好的应用前景。

附图说明

[0014] 图1为本发明引物对H9亚型AIV RT-PCR扩增结果。其中，M为Trans DNA MarkerI；1为H9N2亚型禽流感病毒，2为空白对照。

[0015] 图2为本发明引物对H9亚型AIV RT-PCR的特异性。其中，M：Trans DNA MarkerI；1：H9N2亚型禽流感病毒；2：鸡新城疫病毒；3：H3N8亚型禽流感病毒；4：H4N6亚型禽流感病毒；5：H5N1亚型禽流感病毒；6：鸡传染性喉气管炎病毒；7：鸡传染性支气管炎病毒；8：
鸡传染性法氏囊炎病毒。

[0016] 图3为本发明引物对H9亚型AIV RT-PCR的灵敏度试验。M：Trans DNA0 -1 -2 -3 -4
MarkerI；1-5：分别为10、10 、10 、10 、10 稀释度的H9亚型禽流感病毒的样品，病
7.25 6.25 5.25
毒含 量依 次为 1×10 EID50/100μL、1×10 EID50/100μL、1×10 EID50/100μL、
4.25 3.25
1×10 EID50/100μL、1×10 EID50/100μL。

[0017] 图4为本发明所提供引物的应用。M：Trans DNA Marker I；1-10为中国农业大学动物流感研究室分离鉴定的H9N2亚型AIV。11-18为H9N2亚型AIV病鸡组织接种鸡胚所得的尿囊液。

具体实施方式

[0018] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

[0019] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明均可从商业途径得到。

[0020] 下述实施例中所用的毒株均由中国农业大学动物流感研究室保存提供。

[0021] 实施例1、引物的设计、合成与筛选

[0022] 根据H9N2亚型禽流感病毒的HA基因的序列，通过DNAman软件进行比对，找出HA基因的保守区，针对HA基因的保守区序列设计特异性引物，并在Genbank上进行BLAST检测比对分析，用Oligo4.0软件分析上下游引物是否匹配，将分析合格的引物送上海生工生物技术有限责任公司北京合成部合成。合成了针对HA基因的5对引物，用本实验室分离保存的H9N2亚型AIV进行筛选，根据扩增效率确定引物对。确定上游引物H9-F：5′-TGTGGCAACTGAAGAAAT-3′(SEQ ID NO：1)；下游引物H9-R：5′-ACCAACCTCCCTCTATGA-3′(SEQ ID NO：2)；退火温度为53℃。目的片断的长度为
425bp。

[0023] 实施例2、RT-PCR方法的建立

[0024] 1、总RNA的提取

[0025] 1)取感染H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的鸡胚尿囊液300μL于无RNA酶的1.5mL离心管中，加入900μL Trizol试剂(Invitrogen)，两者比例为1∶3，轻轻颠倒混匀10次，使核蛋白复合体完全溶解；

[0026] 2)加入200μL三氯甲烷(氯仿)，颠倒混匀10次，冰浴放置5分钟，期间轻轻颠倒混匀；4℃12000rpm离心15min。

[0027] 3)将水相(约700μL)移至一个新的无RNA酶1.5mL离心管中，加入等量异丙醇，颠倒混匀数次，-20℃放置10分钟后，4℃12000rpm离心15分钟，弃去上清；

[0028] 4)用1mL75％无RNA酶冰乙醇洗涤，瞬时离心，弃上清，注意别把沉淀的RNA倒掉，用黄枪头吸干，瞬时离心，再用白枪头吸干，置冰上干燥沉淀5～10min，使乙醇挥发；

[0029] 5)将干燥的RNA用11μL DEPC水溶解，即用或-80℃保存备用。

[0030] 2、反转录合成cDNA

[0031] 用反转录试剂盒(K1622，Fermentas)将步骤1获得的总RNA样品进行反转录，得到cDNA。

[0032] 1)将0ligo引物(20pmol/μL)1μL加到含RNA的11μL DEPC水中，瞬时离心，65℃水浴5min后，置于冰上5min，使RNA线性化。

[0033] 2) 反 转 录 体 系 20μL：0ligo 引 物 (20pmol/μL)lμL；总 RNAllμL；TM
Reaction(5×)4μL；10mMdNTP Mix2μL；Ribolock Rnase Inhibitor(20U/μL)1μL；
TM
Revert Aid M-MuLVReverse Transcriptase(200U/μL)1μL。

[0034] 3)步骤1)完成后，依次加入反转录体系中的其余4种成分，混匀，瞬时离心。

[0035] 反应条件：37℃水浴1h，65℃5min，4℃保存。

[0036] 3、RT-PCR条件的优化

[0037] 采用总体积为25μL的反应体系：2×PCR MIX buffer(北京全式金生物技术有限公司，其成分为Easy Taq RNA聚合酶、dNTPS及反应缓冲液)12.5μL；浓度为20pmol/μL序列表SEQ ID NO：1引物1μL；浓度为20pmol/μL序列表SEQ ID NO：2引物1μL；ddH2O补足至25μL。

[0038] 对双重RT-PCR的变性、退火、延伸温度和时间、循环次数等进行优化。

[0039] 双重RT-PCR最佳循环条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火35s，72℃延伸35s，从第二步开始进行34个循环，然后72℃延伸10min。

[0040] 4、电泳

[0041] 取PCR产物5μL用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳。结果见图1，H9N2亚型禽流感病毒扩增出425bp的目的条带，与预期产物大小相符。

[0042] 5、PCR产物测序

[0043] 将PCR产物进行回收，送北京华大基因科技股份有限公司进行序列测定。

[0044] 将HA基因扩增片段测序结果在NCBI流感数据库中进行BLAST，HA基因序列与A/Chicken/Shandong/A1/2009(H9N2)、A/Chicken/Zhejiang/611/2011(H9N2)等毒株的第4个片段HA基因的同源性为99％。

[0045] 实施例3、PCR引物对的特异性试验

[0046] 1、总RNA的提取

[0047] 分别对一株H9N2亚型禽流感病毒、一株H3N8亚型禽流感病毒、一株H4N6亚型禽流感病毒、一株H5N1亚型禽流感病毒、一株鸡传染性法氏囊炎病毒、一株鸡新城疫病毒、一株鸡传染性支气管炎病毒、一株鸡传染性喉气管炎病毒的鸡胚尿囊液提取总RNA，方法同实施例2。

[0048] 2、反转录合成cDNA

[0049] 用反转录试剂盒(K1622，Fermentas)分别将步骤1获得的总RNA样品进行反转录，得到cDNA。

[0050] 反应体系、反应条件及方法同实施例2。

[0051] 3、PCR扩增检测RT-PCR方法的特异性

[0052] 以实施例1中所确定的引物对为引物，对步骤2得到的cDNA样品进行PCR扩增。

[0053] 反应体系同实施例2。

[0054] 反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火35s，72℃延伸35s，从第二步开始进行34个循环，然后72℃延伸10min。

[0055] 电泳。分别取PCR产物5μL用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳。结果见图2，H9N2亚型禽流感病毒扩增出425bp的目的条带。而鸡新城疫病毒、H3N8亚型禽流感病毒、H4N6亚型禽流感病毒、H5N1亚型禽流感病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊炎病毒的尿囊液样品均无PCR目的条带。结果表明，本发明所提供的引物对H9亚型禽流感病毒进行RT-PCR检测具有很强的特异性，可以特异性地检出H9亚型禽流感病毒。

[0056] 实施例4、PCR引物对的灵敏度检测

[0057] 1、H9N2亚型AIV病毒含量的测定

[0058] 取感染H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Shandong/ZB/2007的尿囊液，采用Reed-Muench法进行病毒EID50的测定，获得该病毒在鸡胚尿囊液中的含毒量。其病毒含量7.25
为1×10 EID50/100μL。

[0059] 2、不同稀释度尿囊液的制备

[0060] 对上述病毒尿囊液进行100、10-1、10-2、10-3、10-4等不同稀释度稀释，得到病毒7.25 6.25 5.25
含 量 分 别 为 1×10 EID50/100μL、1×10 EIDS0/100μL、1×10 EID50/100μL、
4.25 3.25
1×10 EID50/100μL、1×10 EID50/100μL的样品。

[0061] 3、不同稀释度尿囊液的总RNA提取

[0062] 方法同实施例2。

[0063] 4、反转录合成cDNA

[0064] 反应体系、反应条件及方法同实施例2。

[0065] 5、PCR扩增检测RT-PCR方法的灵敏度

[0066] 反应体系同实施例2。反应条件同实施例3。

[0067] 电泳。分别取PCR产物5μL用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳。结果见图3，-3在10 稀释时仍然可以扩增出明显的目的条带，该方法对病毒尿囊液的最低检出量为
4.25
1×10 EID50/100μL，灵敏度较高，敏感性较强。

[0068] 实施例5、PCR引物对的应用

[0069] 1、样品的采集与处理

[0070] 取经常规方法鉴定的H9N2亚型禽流感病毒感染鸡的组织样品8份，称量，放灭菌的组织研磨器研磨成匀浆，加入含双抗的PBS制成10％-20％(W/V)的悬液。转入灭菌离心管中，经4℃12000r/min离心10min，取上清液接种于10日龄SPF鸡胚尿囊腔，收集24-96h死亡及未死亡的鸡胚尿囊液。

[0071] 2、总RNA的提取

[0072] 对10株H9亚型禽流感病毒感染的尿囊液以及步骤1得到的8个样品分别提取总RNA，方法同实施例2。

[0073] 3、反转录合成cDNA

[0074] 反应体系、反应条件及方法同实施例2。

[0075] 4、PCR扩增

[0076] 反应体系同实施例2。反应条件同实施例3

[0077] 电泳。分别取PCR产物5μL用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳。结果见图4。10株H9亚型禽流感病毒及8个病鸡组织的鸡胚尿囊液样品均扩增出了目的条带，大小与预期相符，鉴定结果与血凝抑制试验等常规方法相比，符合率为100％。