小麦矮缩病毒的快速可视化检测方法

摘要

本发明公开了小麦矮缩病毒的快速可视化检测方法，包括下述步骤：1)提取步骤：从待检查标本提取DNA；2)扩增步骤：使用引物，以步骤1)的DNA为模板，通过环介导等温扩增法进行DNA的扩增反应；3)判断步骤：检测所述扩增步骤中是否包含小麦矮缩病毒碱基序列判断是否存在小麦矮缩病毒。本发明的方法简便，快速，能够高通量提取和检测DNA，进行小麦矮缩病毒的可视化检测。

权利要求

1.小麦矮缩病毒的快速可视化检测方法，其特征在于包括下述步骤：1)提取步骤：从待检查标本提取DNA；2)扩增步骤：使用引物，以所提取的DNA为模板，通过环介导等温扩增法进行DNA的扩增反应；3)判断步骤：检测所述扩增步骤中是否包含小麦矮缩病毒碱基序列判断是否存在小麦矮缩病毒；

其中，所述扩增步骤中使用的引物组如下：

WDV-FIP引物，TCGATGCGACCAAGCACGTTGTACGATGCCTTGGAATCTGC；

WDV-BIP引物，AGGAAGTGGAACGTGAACCTTGCTACCCAGTTGTAGCGTTGG；

WDV-F3引物，GTCCACGATATTCTTGCCGA；

WDV-B3引物，CCAGACGCCACTGACATC。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于扩增步骤的扩增反应将含有提取的DNA、引物组、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液的反应液在等温条件下静置15分钟-60分钟，所述温度为60-65℃。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于判断步骤所用的判断方法为在判断步骤开始前，将SYBR Green I染料加入反应管盖中，并经矿物油物理隔离；经扩增反应后，反应液产生绿色的情况下，判断为存在小麦矮缩病毒；发现反应液保持橙红色的情况下，判断为不存在小麦矮缩病毒。

说明书

小麦矮缩病毒的快速可视化检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及小麦矮缩病毒，尤其涉及小麦矮缩病毒的检测方法，属于农业生物学领域。

背景技术

[0002] 小麦矮缩病毒，即Wheat dwarf virus(WDV)，是属于联体病毒科玉米线条病毒属的DNA病毒。已知小麦矮缩病毒的宿主包括小麦(Triticumaestivum)、大 麦 (Hordeumvulgare)、燕 麦(Avena sativa) 和 多 种 杂 草，由 异 沙 叶 蝉(PsammotettixalienusDahlb)以持久性非增殖方式传播。感染了小麦矮缩病毒的小麦植株矮缩、黄化、条斑。发病严重的植株在拔节前即死亡，发病较轻的植株虽能拔节，但多不抽穗，即使抽穗，籽粒也不实。拔节前的小麦受到WDV侵染会造成植株矮缩，重者仅10cm，且植株不再增高。拔节后的小麦受侵染会造成分蘖长短不一，根部产生众多的小分蘖，因此小麦矮缩病毒会给植株带来上述诸多损害，对小麦矮缩病毒的及时杀灭或拔除感染了小麦矮缩病毒的植株就显得尤为必要，在这之中如何准确、快速的检测、发现小麦矮缩病毒是重中之重。

[0003] 传统的用来检测小麦矮缩病毒的方法包括FLISA法、POR法，采用FLISA法进行小麦矮缩病毒检测包括以下步骤：在固相化有特异性地识别小麦矮缩病毒的一级抗体的微孔板中，使检查标本中所含的小麦矮缩病毒粒子和一级抗体反应的步骤；清洗未与一级抗体结合的检查标本中的成分的步骤；使与一级抗体结合的小麦矮缩病毒粒子和经酶标且特异性地识别小麦矮缩病毒的二级抗体反应的步骤；清洗未与小麦矮缩病毒粒子结合的二级抗体的步骤；使酶标于二级抗体的酶和化学显色底物或化学发光底物进行酶反应的步骤；根据通过酶反应得到的显色或发光的强度，估计小麦矮缩病毒粒子的量的步骤，FLISA法反应时间长，灵敏度低，检测对象为蛋白质，不是核酸，因此并不能准确断定所检测对象是否为小麦矮缩病毒。

[0004] 采用POR法进行小麦矮缩病毒检测包括以下步骤：在POR管中加入反应缓冲液、引物、dNTPs、DNA聚合酶和扩增模板，将混合好的反应液置于POR仪中进行核酸扩增，取部分扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，将琼脂糖凝胶进行溴化乙锭染色和脱色，在UV照射下观察POR扩增条带。采用POR法反应时间长，不适 合高通量检测，需要复杂昂贵的仪器设备，溴化乙锭污染实验室环境。

[0005] 传统技术中，通常采用CTAB法进行小麦组织核酸提取，包括将小麦组织液氮冷却，经冷却的小麦组织研磨破碎，破碎的小麦组织加入提取缓冲液后水浴加热，提取液经离心后采用酚和氯仿进行抽提，抽提后的缓冲液加入乙醇低温沉淀然后离心分离、洗脱、溶解核酸，采用此种方法反应时间长，过程复杂。

[0006] 由上述可见，在现有技术中对于小麦矮缩病毒的提取、检测过程均存在一定缺陷，无法满足应用需要。

发明内容

[0007] 针对现有技术的缺陷，本发明公开了一种小麦矮缩病毒的检测方法，通过将等温的基因扩增反应的环介导等温扩增法(LAMP)应用于扩增小麦矮缩病毒的编码蛋白质基因的特定区域，可以简便、快捷、高通量、高灵敏度地进行小麦矮缩病毒的检测。

[0008] 为实现上述目的的，本发明是通过下述技术方案实现的：

[0009] 小麦矮缩病毒的快速可视化检测方法，包括下述步骤：1)提取步骤：从待检查标本提取DNA；2)扩增步骤：使用引物，以步骤1)的DNA为模板，通过环介导等温扩增法进行DNA的扩增反应；3)判断步骤：检测所述扩增步骤中是否包含小麦矮缩病毒碱基序列判断是否存在小麦矮缩病毒。

[0010] 在本发明中，待检查标本是指可能存在小麦矮缩病毒感染的小麦等植物的机能组织，例如小麦的叶、茎和穗等，获得待检查标本的时间并不受到限制，栽培时、采样时和保存时等均可。

[0011] 在本发明中，提取步骤用来提取存在于被细胞壁包围的植物细胞的小麦矮缩病毒的DNA，可以通过各种方式进行提取，例如可以通过在蒸馏水或具有弱碱性的pH的缓冲液中将待检查标本以物理方式匀浆，从而提取标本的DNA。

[0012] 适用于上述方法的缓冲液，其pH优选pH8.0-9.5，包括但不限于Tris／盐酸缓冲液、Tris／醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、碳酸缓冲液、硼酸缓冲液等。

[0013] 除上述方法外，任何适用于生物学领域从植物中获取DNA的方法均可适用于本发明，这些方法可参考《分子克隆(Molecular donging)》(Maniatis等，1989年，冷泉港实验室出版社)等记载的基因工程实验方案，从而可以高效的从检查标本提取小麦矮缩病毒的DNA。

[0014] 为了有效的扩增所提取的DNA，扩增步骤所用引物为包含下述四种碱基序列构成的4种寡核苷酸的引物组：

[0015] WDV-FIP引物，TCGATGCGACCAAGCACGTTGTACGATGCCTTGGAATCTGC;

[0016] WDV-BIP引物，AGGAAGTGGAACGTGAACCTTGCTACCCAGTTGTAGCGTTGG；

[0017] WDV-F3引物，GTCCACGATATTCTTGCCGA；

[0018] WDV-B3引物，CCAGACGCCACTGACATC。

[0019] 通过上述引物组，以DNA为模板，反复进行采用环介导等温扩增法的等温基因扩增反应。

[0020] 在上述引物中，WDV-FIP引物为FlP引物，基于如下原则进行设计：在3’末端侧具有作为与F2c区域互补的序列的F2区域，在5’末端侧具有作为与B1c区域相同的序列。

[0021] 在上述引物中，WDV-BIP引物为BlP引物，基于如下原则进行设计：在3’末端侧具有作为与B2c区域互补的序列的B2区域，在5’末端侧具有与B1c区域相同的序列。

[0022] 在上述引物中，WDV-F3引物为F3引物，基于如下原则进行设计：具有作为与F3c区域互补的序列的F3区域。

[0023] 在上述引物中，WDV-B3引物为B3引物，基于如下原则进行设计：具有作为与B3c区域互补的序列的B3区域。

[0024] 通过上述引物组，可以快速、有效、大量的扩增所提取的DNA。

[0025] 在本发明的扩增步骤中，采用LAMP法的DNA的扩增反应如下进行即可：将含有提取步骤中所提取的DNA、使用上述包含4种寡核苷酸的引物组、链置换型DNA聚合酶、dNTPs(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)和缓冲液的反应液在等温条件下静置一定时间。

[0026] 上述的温度，为50-75℃，优选60-65℃，最优选是65℃。

[0027] 上述的静置时间在15分钟以上就可检出DNA的扩增，优选15分钟-60分钟，更优选20分钟-40分钟。

[0028] 上述所用的链置换型DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液，是本领域技术人员使用LAMP法进行碱基序列扩增时所通用的，可以使用已有的商业成品，例如Loopamp DNA扩增试剂盒(荣研化学株式会社制)既包含上述各种试剂。

[0029] 在完成DNA的扩增后，小麦矮缩病毒的基因组DNA的靶区域的部分序列的DNA是通过采用上述引物组的LAMP法被反复扩增的核心序列。与此核心序列互补的小麦矮缩病毒的基因组DNA的碱基序列，以及由上述4寡核苷酸分别退火结合的小麦矮缩病毒的基因组DNA的碱基序列，为小麦矮缩病毒的编码蛋白质基因的部分序列，包含这些碱基序列的小麦矮缩病毒的基因组DNA的区域适合作为用于通过LAMP法扩增DNA的靶区域。因此，通过确认是否有被扩增的DNA，可以特异性地检测小麦矮缩病毒的存在。

[0030] 小麦矮缩病毒的有无的判断可以采用如下多种方法进行：

[0031] 1.在用于判断步骤的反应开始前将SYBRGreen I染料加入反应液中，通过肉眼观察进行采样LAMP法的DNA的扩增反应后的反应液，发现反应液产生绿色的情况下，判断为存在小麦矮缩病毒；发现反应液保持橙红色的情况下，判断为不存在小麦矮缩病毒。通过在反应前加入染料，有效避免了反应后开盖，降低了由于开盖而使LAMP扩增产物进入实验室环境导致的假阳性污染。

[0032] 2.在UV照射下发现绿色荧光的情况下，判断为存在小麦矮缩病毒；未发现绿色荧光的情况下，判断为不存在小麦矮缩病毒。

[0033] 3.将所扩增的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，在存在多条梯形条带这种LAMP特征性条带的情况下，判断为存在小麦矮缩病毒；只存在单一条带的情况，或者不存在任何条带的情况下，判断为不存在小麦矮缩病毒。

[0034] 在上述方法中，优选采用方法3，其判断结果更加细致。

[0035] 进一步的，为了快速实现小麦矮缩病毒的扩增和检测，可以将本发明的小麦矮缩病毒的检测方法所需的各种试剂类预先封装而试剂盒化。具体来说，能够以试剂盒的形式提供包含上述4种寡核苷酸的引物组、作为核酸合成的底物的4种dNTPs(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、具有链置换活性的链置换型DNA聚合酶、提供适于酶反应的条件的缓冲液，此外还可以加入作为辅助因子的盐类(镁盐或锰盐等)、根据需要采用的反应生成物的检测所需的试剂类。

[0036] 上述的试剂盒，可以是完全独立生产的，也可以采用现有的试剂盒，例如将上述引物组加入Loopamp DNA扩增试剂盒中即可作为本发明的试剂盒。

[0037] 进一步的，上述试剂盒中可以包含用于确认LAMP反应通过本发明的引物正 常地进行的阳性对照。作为阳性对照，例如可以包含被本发明的引物扩增的区域的DNA。

[0038] 通过本发明提供的检测方法，不仅能够简便，快速，高通量提取DNA，而且能够快速，高灵敏度，高通量检测核酸；本发明提供的试剂盒闭盖，在不污染的LAMP产物的情况下实现了小麦矮缩病毒的可视化检测。

附图说明

[0039] 图1是小麦矮缩病毒的基因组DNA的靶区域的位置关系图。

[0040] 图2为采用本发明的LAMP法和现有技术的POR法进行小麦矮缩病毒的检测的结果；

[0041] 图3为采用本发明检测方法检测存在和不存在小麦矮缩病毒的检测结果图像。

具体实施方式

[0042] 实施例1：采用本发明的发明检测小麦矮缩病毒

[0043] 1)小麦矮缩病毒的检测中使用的小麦组织样品的制备

[0044] 将从感染小麦矮缩病毒的小麦叶片(新鲜或冰冻材料)作为小麦矮缩病毒的检测用标本，将无病毒的小麦叶片(新鲜或冰冻材料)作为对照检测标本，由这些标本分别制备小麦组织样品。

[0045] 取以上小麦组织样品10mg左右，放入200μLPOR管或者POR八连管中。以上步骤应在冰上进行操作。每管中加入70μL缓冲液A，盖上管盖后立刻将POR管或POR八连管放入POR仪中加热到95℃，加热时间为10分钟。加热结束后从POR仪中取出POR管或POR八连管，迅速加入等体积的缓冲液B，振荡混匀后瞬时离心，使叶片等残渣沉淀到管底部，上清即为制备得到的DNA试样。

[0046] 2)引物

[0047] 引物采用作为FIP引物的WDV-RP引物、作为BIP引物的WDV-BIP引物、作为F3引物的WDV-F3引物、作为B3引物的WDV-B3引物。通过使用这4种引物进行采样LAMP法的DNA的扩增反应，可以扩增包含作为小麦矮缩病毒的编码蛋白质基因的DNA的部分序列的碱基序列的DNA。

[0048] 3)DNA的扩增

[0049] 采样LMAP法的DNA的扩增使用Loopamp DNA扩增试剂盒(荣研化学株式会社制)进行。具体来说，按照制造商的实验方案，在200μLPOR管或POR八连 管中进行反应。向反应液中分别加入经梯度稀释的上述DNA试样(2μL)，向其中加入上述引物、链置换型DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。

[0050] 以上各反应成分加好后混合均匀，再滴加2滴矿物油或液体石蜡，覆盖在反应液的表面。然后在管盖内加入10μLSYBRGreen I，小心将POR管或POR八连管盖好，不要让所加入的10μL SYBR Green l向下进入到POR管或POR八连管内。在不使用热盖的POR仪或水浴等仪器中，65℃静置50分钟。

[0051] 4)经扩增的DNA的检测

[0052] 在LAMP反应结束后，将盖好盖子的POR管或POR八连管上下混匀，使管盖的SYBRGreen I进入到反应液中，轻微离心后观察反应液的颜色变化。

[0053] 确认采用LAMP法的DNA的扩增的情况下，SYBRGreen l染料会嵌入到扩增得到的双链DNA的双螺旋结构中间，从而使反应液的颜色发生改变，反应液表现出翠绿色。如果没有发生采用LAMP法的DNA的扩增的情况下，由于没有双链DNA的产生，SYBRGreen I染料不会嵌入其中，反应液的颜色就不会发生改变，依然保持为淡橙色。

[0054] 将反应结束后的各反应管置于紫外灯下照射，发生采用LAMP法的DNA的扩增的情况下，反应液发出强烈的绿色荧光；没有发生采用LAMP法的DNA的扩增的情况下，反应液无特异性荧光的出现。

[0055] 通过上述所扩增的DNA是相当于小麦矮缩病毒的编码蛋白质基因的DNA的部分序列的碱基序列，因此反应液出现翠绿色颜色表现时判断为存在小麦矮缩病毒，其碱基序列如序列表1所示。

[0056] 参考附图2-A，为使用小麦矮缩病毒检测用检查标本的DNA稀释试样和对照检查标本的DNA试样通过POR法进行小麦矮缩病毒的检测的结果。

[0057] 参考附图2-B，为使用小麦矮缩病毒检测用检查标本的DNA稀释试样和对照检查标本的DNA试样通过LAMP法进行小麦矮缩病毒的检测的结果。

[0058] 观察上述附图可知，对照检查标本的DNA试样都未检出小麦矮缩病毒，对于小麦矮缩病毒检测用检查标本的DNA稀释试样，采用POR法和LAMP法均可检出小麦矮缩病毒，但是检查灵敏度不同。根据以上的结果，明确采用LAMP法的检测中，感染了小麦矮缩病毒的小麦矮缩病毒检测用检查标本检出了小麦矮缩病毒，示意检测灵敏度高于后述的采用POR法的检测。

[0059] 综上所述，实施例1中所示的采用LMAP法的小麦矮缩病毒的检测方法灵敏度远高于下述对比实施例采用的POR法，仅通过视觉上判断反应液的颜色就可以容易地判定小麦矮缩病毒的有无的方法，准确、高效。

[0060] 对比实施例：采用POR法进行小麦矮缩病毒检测

[0061] 1)小麦矮缩病毒的检测用POR模板的制作

[0062] 同前述(实施例1)采用LAMP法的小麦矮缩病毒的检测中1)小麦矮缩病毒的检测中使用的小麦组织样品的制备。

[0063] 2)POR法中使用的引物

[0064] 引物采用作为F引物的WDV-F引物(CAACTGGTTGAATAGOGACAGGAC)、作为R引物的WDV-R引物(OGTATAGGCACATACAACATCAAAOG)。采用上述引物进行采用PCR法的DNA的扩增反应，可以扩增重复包含作为小麦矮缩病毒的编码蛋白质基因的DNA的部分序列的碱基序列的DNA。

[0065] 3)采样POR法的DNA的扩增

[0066] 采样POR法的DNA的扩增使用Taq DNA聚合酶(Promegra制)进行。具体来说，按照制造商的实验方案，在200μLPOR管或POR八连管中进行反应。向反应液中分别加入经梯度稀释的上述DNA试样(2μL)，向其中加入上述的2种引物、Taq DNA聚合酶、dNTPs和缓冲液。以上各反应成分加好后混合均匀，采用POR仪进行扩增反应，反应条件为：变性温度95℃反应3分钟，然后进入扩增循环，扩增循环包括3个步骤，首先95℃使DNA变性50秒，然后55℃退火50秒，最后72℃延伸反应1分钟，共30个循环。循环扩增后72℃延伸10分钟，

[0067] 10℃保存反应液。

[0068] 4)经扩增的DNA的检测

[0069] 在POR反应结束后，将POR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳后的凝胶通过在溴化乙锭中浸渍10分钟而将被分离的DNA片段染色，通过紫外线照射，可以观察到DNA条带。确认POR法扩增的情况下，由于引物WDV-F和引物WDV-R扩增得到595bp的核酸片段，琼脂糖凝胶电泳检测在595bp处出现单一的核酸条带。如果没有发生POR扩增的情况下，引物WDV-F和引物WDV-R不能扩增得到595bp的核酸片段，琼脂糖凝胶电泳检测在595bp处不出现单一的核酸条带。通过上述的采用POR法的DNA的扩增所扩增的DNA是相当于小麦矮缩病毒的编 码蛋白质基因的DNA的部分序列的序列表的序列编号8中所示的碱基序列，因此琼脂糖凝胶电泳在595bp处出现单一的核酸条带时判断为存在小麦矮缩病毒。

[0070] 参考附图2-B，使用小麦矮缩病毒检测用检查标本的DNA稀释试样和对照检查标本的DNA试样通过LAMP法进行小麦矮缩病毒的检测的结果。

[0071] 综合附图2可以看到，对照检查标本的DNA试样都未检出小麦矮缩病毒，但对于小4
麦矮缩病毒检测用检查标本的DNA稀释试样，将小麦组织样品稀释1×10倍时，采用POR法
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可以检出小麦矮缩病毒，但是当小麦组织样品稀释1×10倍未检出小麦矮缩病毒。对于小
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麦矮缩病毒检测用检查标本的DNA稀释试样，将小麦组织样品稀释1×10倍时，采用LAMP法仍可以检出小麦矮缩病毒。根据以上的结果，明确采用POR法的检测中，感染了小麦矮缩病毒的小麦矮缩病毒检测用检查标本检出了小麦矮缩病毒，但与本发明的采用LAMP法的检测相比，检测灵敏度低于采用LAMP法的检测10-100倍。

[0072] 参考附图3-A、3-B、3-C,对于待检测标本2中不存在小麦矮缩病毒的情况，SYBRGreen I染料呈红色荧光，在待检测标本1中存在小麦矮缩病毒的情况，SYBRGreen I染料结合双链DNA呈绿色荧光。其中A图为肉眼可见荧光表现，B图为UV照射下荧光表现。此即为本发明实现可视化检测的技术原理。

[0073] 本发明的方法实现了小麦矮缩病毒的可视化检测，便于操作。