一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法

摘要

本发明涉及测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法，步骤包括：制备特定粒径纳米金粒子的免疫原，将免疫原注射到动物体内，制得高特异性抗体，用吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量，将抗抗体酶标记制得酶标二抗体，用间接竞争酶联免疫法将标准样品与待测样竞争与抗体的反应，酶标二抗体的酶促使底物液发光，测得吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。本发明中特定粒径纳米金粒子抗体的特异性强，交叉反应较少，因此其选择性很高，从而简化了样品前处理过程。

权利要求

1.一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法，步骤包括：

a、制备特定粒径纳米金粒子的免疫原；

b、将免疫原注射到动物体内，制得高特异性抗体；

c、用吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量，将抗抗体酶标记制得酶标二抗体，用间接竞争酶联免疫法使标准样品或待测样中的金纳米粒子和包被抗原中的金纳米粒子竞争与抗体进行反应，酶标二抗体的酶促使底物液发光，测得吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。

2.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于：

所述步骤a中特定粒径纳米金粒子的免疫原的制备方法为：

在搅拌下将巯基乙酸溶液加入到特定粒径纳米金粒子溶液中，在搅拌15-20min后调节溶液在弱酸条件下，分别加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，室温避光下搅拌3-4h，然后再调节pH9～10，加入牛血清白蛋白，4℃下搅拌5-6h后，将反应液装入透析袋，用蒸馏水透析12h以上，避光低温保存。

3.如权利要求2所述的测试方法，其特征在于：所述巯基乙酸溶液浓度为0.001mol/L，特定粒径纳米金粒子溶液浓度为0.4～0.6μg/mL,1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐溶液浓度为0.2mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺溶液浓度为0.05mol/L，牛血清白蛋白浓度为10mg/mL，巯基乙酸、1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的物质的量比1:4:2；纳米金粒子、巯基乙酸和牛血清白蛋白的质量比为1:1:2000。

4.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于：所述步骤b中高特异性抗体的制备方法为：将免疫原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶,对动物进行多次免疫，制得特定粒径纳米金粒子高特异性抗体。

5.如权利要求4所述的测试方法，其特征在于：所述多次免疫方法为：第一次动物免疫将免疫原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，免疫三周后，进行五次加强免疫，加强免疫是将免疫原与弗氏不完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，五次加强免疫免疫间隔为两周，经五次加强免疫后,从动物心脏采血,血清室温20-25℃静置0.5-1h,在冰箱4℃静置2h后吸取上层澄清的血清，制得高特异性抗体。

6.如权利要求1所述的测试方法，其特征在于：所述步骤c中吸光度法具体为：

包被：在酶标板中加入5μg/mL的包被抗原，100μL/孔，8组，每组3孔，37℃温育

1-3h，或4℃过夜12h，PBST洗涤3次；所述包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法，不同处在于使用鸡卵白蛋白代替牛血清白蛋白；

封闭：加10mg/mL的OVA溶液，200μl/孔，37℃温育15-60min，PBST洗涤3次；

竞争：加入50μl/孔不同浓度特定粒径纳米金粒子溶液，加入浓度为30μg/mL抗体，

50μl/孔，37℃温育2-4h，PBST洗涤3次；

加酶：加入100μl/孔稀释度为1:500酶标二抗体溶液，37℃温育2-4h，PBST洗涤3次；

显色：加入底物液100μL/孔，37℃温育15-60min；底物液处理方法为：在加处理后的底物液前15-30min向底物液原液加入OPD，加入量为10mL底物液原液中加入4mg OPD，加处理后的底物液前3-5min向底物液原液加入质量分数为30％的H2O2，加入量为底物液原液体积分数的0.15％；

检测：加入终止液50μL/孔，测定吸光度值，绘制标准曲线；

将待测样用同样方法测定吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。

说明书

一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法

技术领域

[0001] 本发明属于纳米材料检测技术领域，特别涉及一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法。

背景技术

[0002] 纳米材料被认为是21世纪的新材料。纳米结构材料指其基本组成颗粒尺寸为纳米数量级,处于原子簇和宏观物体交接区域内的粒子,颗粒直径一般为1～100nm之间,微粒可以是晶体,亦可以是非晶体。纳米结构材料具有一系列新异的物理、机械、电子、磁学、光学及化学特性。纳米金为直径0.8～250nm的缔合胶体,具有纳米表面效应、量子效应和宏观量子隧道效应,抗氧化性强,生物相容性好,密度高和光电性能优异等,被广泛用于催化、生物、光电子学、信息存储等领域。如今，随着纳米技术的产业化，各种形式的纳米尺度的物质已经以各种不同的途径进入我们的生活。比如，在药物化学、药剂学等领域，一些纳米物质以其特殊的化学结构、表面性质和微小粒径，成为新型药物载体，而出于医学目的，这些颗粒有可能会直接被注射进入人体内；或在生产、使用、废弃过程中，纳米材料必然会通过各种途径以“三废”形式进入环境，并造成一定的生态效应和人群暴露；也或通过大气环境、食物链进入人体，如吸入，摄取以及皮肤途径。总之，人们在工作和生活中接触到纳米材料的机会越来越多，引起人们对其负面生物效应的关注。因此能监测纳米金在日常生活和药物领域中的应用，将其用量控制在安全范围内，就会显得尤为重要。

[0003] 目前，对纳米金的痕量检测方法少之又少，有文献报导使用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)对纳米金进行痕量检测，通过将固态的纳米金变成金原子，再将金原子氧化成金离子，最后通过质谱分析检测金离子的信号，从而实现对纳米材料的定量检测。ICP-MS方法成本高，仪器昂贵，并且需要专门的实验人员，样品前处理复杂，特异性差等缺点。并且ICP-MS只能用于检测使用1%HCl（v/v）制备得到的纳米金样品，对于纳米金常用合成方法1%柠檬酸钠还原氯金酸制备得到的纳米金样品的检测回收率只有10%-40%。

发明内容

[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法，本发明测试方法成本低，操作简便，特异性选择性高，样品前处理简单等优点，同时可以根 据粒子粒径帮助判断纳米金粒子的来源。

[0005] 本发明采用的技术方案是：

[0006] 一种测试痕量特定粒径纳米金粒子的方法，步骤包括：

[0007] a、制备特定粒径纳米金粒子的免疫原；

[0008] b、将免疫原注射到动物体内，制得高特异性抗体；

[0009] c、用吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量，将抗抗体酶标记制得酶标二抗体，用间接竞争酶联免疫法将标准样品与待测样竞争与抗体的反应，酶标二抗体的酶促使底物液发光，测得吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。

[0010] 所述步骤a中特定粒径纳米金粒子的免疫原的制备方法为：

[0011] 在搅拌下将巯基乙酸（TGA）溶液加入到特定粒径纳米金粒子溶液中，在搅拌15-20min后调节溶液在弱酸条件下，分别加入1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶液，室温避光下搅拌3-4h，然后再调节pH9～
10，加入牛血清白蛋白（BSA，sigma公司），4℃下搅拌5-6h后，将反应液装入透析袋，用蒸馏水透析12h以上，避光低温保存。

[0012] 所述弱酸条件为PH=5.5；所述避光低温保存温度为4℃；

[0013] 所述巯基乙酸溶液浓度为0.001mol/L，特定粒径纳米金粒子溶液浓度0.4～0.6μg/mL,EDAC溶液浓度为0.2mol/L，NHS溶液浓度为0.05mol/L，BSA浓度为10mg/mL，TGA、EDAC和NHS的物质的量比1:4:2；纳米金粒子、TGA和BSA的质量比为1:1:2000；

[0014] 所述步骤b中高特异性抗体的制备方法为：

[0015] 将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶,对动物进行多次免疫，制得特定粒径纳米金粒子高特异性抗体。

[0016] 所述多次免疫方法为：第一次动物免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，免疫三周后，进行五次加强免疫，加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，五次加强免疫免疫间隔为两周，经五次加强免疫后,从动物心脏采血,血清室温20-25℃静置0.5-1h,在冰箱4℃静置2h后吸取上层澄清的血清，制得高特异性抗体。

[0017] 所述弗氏佐剂制备方法为：将液体石蜡和羊毛脂按2:1体积比用超声清洗器超声3小时左右，使之完全混匀，制得不完全弗氏佐剂，临用前加杀死的卡介苗即为完全弗氏佐剂。

[0018] 所述步骤c中吸光度法具体为：

[0019] 包被：在酶标板中加入5μg/mL的包被抗原，100μL/孔，8组，每组3孔，37℃温育1-3h，或4℃过夜12h，PBST洗涤3次，包被抗原所用稀释液为包被液CB；所述包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法，不同处在于使用鸡卵白蛋白（OVA，sigma公司）代替BSA；

[0020] 封闭：加10mg/mL的OVA溶液，200μl/孔，37℃温育15-60min，PBST洗涤3次；

[0021] 竞争：加入50μl/孔不同浓度特定粒径纳米金粒子溶液，分别加入浓度为30μg/mL抗体，50μl/孔，37℃温育2-4h，PBST洗涤3次；

[0022] 加酶：加入100μl/孔稀释度为1:500酶标二抗体溶液，37℃温育2-4h，PBST洗涤3次；

[0023] 显色：加入处理后的底物液100μL/孔，37℃温育温育15-60min；底物液处理方法为：在加处理后的底物液前15-30min向底物液原液加入OPD，加入量为10mL底物液原液中加入4mgOPD，加处理后的底物液前3-5min向底物液原液加入质量分数为30%的H2O2，加入量为底物液原液体积分数的0.15%；

[0024] 检测：加入终止液50μL/孔，测定吸光度值，绘制标准曲线；

[0025] 将待测样用同样方法测定吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。

[0026] 酶联免疫方法（Elisa）有成本低，操作简便，特异性选择性高，样品前处理简单等优点，并且适用于各种方法制备的纳米金粒子。将其制成试剂盒，使其操作更加简单方便，更加有利于此方法的商业应用。本发明在多功能酶标仪上应用，操作简便，能进行高通量快速化的样品检测，真正实现了对环境水样，医药样品，化妆品等样品中特定粒径纳米金粒子含量的痕量检测。

[0027] 本发明中特定粒径纳米金粒子抗体的特异性强，交叉反应较少，因此其选择性很高，从而简化了样品前处理过程。本发明最低检测限(3σ)是0.01ng/mL，灵敏度为0.01ng/mL。

具体实施方式

[0028] 实施例1

[0029] 1.16nm金粒子全抗原的合成

[0030] 1）纳米金的合成

[0031] 取0.01%的氯金酸溶液100mL加热至沸腾，搅动下迅速加入1%柠檬酸三钠水溶液5mL，溶液的颜色迅速地变成黑色，在1分钟内变为紫红色，随着加热时间的增长，直到溶液出现透明的酒红色，约需7-10分钟左右。待颜色稳定后继续回流沸腾15分钟，撤热源持续搅拌，冷却至室温，所得液体为16nm金溶胶，4℃保存备用。

[0032] 2）纳米金免疫原(GNP-BSA)的制备

[0033] 在搅拌下将巯基乙酸溶液加入到16nm金粒子溶液中，在磁力搅拌20min后调节溶液在弱酸条件下，分别加入EDAC和NHS溶液，室温避光下搅拌3h，然后再调节pH9～10，加入 BSA，4℃下搅拌5h后，将反应液装入透析袋，用蒸馏水透析12h，避光保存在冰箱内。

[0034] 所述弱酸条件为PH=5.5；所述避光低温保存温度为4℃；

[0035] 所述巯基乙酸溶液浓度为0.001mol/L，特定粒径纳米金粒子溶液浓度为0.5μg/mL,EDAC溶液浓度为0.2mol/L，NHS溶液浓度为0.05mol/L，BSA浓度为10mg/mL，TGA、EDAC和NHS的物质的量比1:4:2；纳米金粒子、TGA和BSA的质量比为1:1:2000；

[0036] 3)纳米金包被抗原(GNP-OVA)的制备

[0037] 包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法，不同处在于使用OVA代替BSA；

[0038] 2.16nm金粒子抗体的制备

[0039] 1)福氏佐剂的制备

[0040] 将液体石蜡和羊毛脂按2:1体积比用超声清洗器超声3小时左右，使之完全混匀，即滴一滴乳化剂到冰水混合液中半分钟之内不扩散才能算混合完全。此乳化剂称之为不完全佐剂。不完全佐剂低温(0-4℃)贮存，临用前加杀死的卡介苗即为完全佐剂。

[0041] 2)抗体的制备方法

[0042] 将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶,对三只新西兰大白兔进行多次免疫，第一次免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，免疫三周后，进行五次加强免疫，加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，五次加强免疫免疫间隔为两周，经五次加强免疫后,从大白兔心脏采血,血清室温25℃静置1h,在冰箱4℃静置2h后吸取上层澄清的血清，制得兔抗16nm金纳米粒子抗体。

[0043] 3.吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量

[0044] 包被：在酶标板中加入5μg/mL的包被抗原，100μL/孔，8组，每组3孔，37℃温育2h，PBST洗涤3次，包被抗原所用稀释液为包被液CB；

[0045] 封闭：加入10mg/mL的OVA溶液，200μL/孔，37℃温育40min，PBST洗涤3次；

[0046] 竞争：加入50μl/孔浓度分别为0.01,0.02,0.1,0.2,1,2,10,20,100ng/mL16nm金粒子溶液，分别加入浓度为30μg/mL抗体，50μL/孔，37℃温育4h，PBST洗涤3次；

[0047] 加酶：加入100μL/孔稀释度为1:500酶标羊抗兔抗抗体溶液，37℃温育3h，PBST洗涤3次；

[0048] 显色：加入处理后的底物液100μL/孔，37℃温育温育40min；底物液处理方法为：在加处理后的底物液前25min向底物液原液加入OPD，加入量为10mL底物液原液中加入
4mgOPD，加处理后的底物液前5min向底物液原液加入质量分数为30%的H2O2，加入量为底物液原液体积分数的0.15%；

[0049] 检测：加入终止液50μL/孔，测定吸光度值，绘制标准曲线；

[0050] 将待测样用同样方法测定吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。

[0051] 标准曲线的线性方程：

[0052] A=0.89332-0.22243logC（A—吸光度值，C—待测液浓度）

[0053] R2=0.985

[0054] 实施例中：

[0055] 氯金酸(HAuCl4·4H2O)，柠檬酸三钠(Na3C6H5O7)·2H2O，巯基乙酸(99%,C2H4O2S)和N-羟基琥珀酰亚胺(98%,C4H5NO3)(NHS)均购买于国药集团化学试剂有限公司；

[0056] 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(98.5%,C8H17N3·HCl)(EDAC)购买于阿拉丁试剂公司；

[0057] 液体石腊(上海试剂有限公司)；

[0058] 羊毛脂(国药集团化学试剂有限公司)；

[0059] 液体卡介苗(新芜区医院)；

[0060] 酶标羊抗兔抗抗体（购于合肥博美生物科技有限责任公司）；

[0061] 包被液CB（碳酸钠缓冲液,0.05mol/L,pH=9.6；Na2CO30.0795g，NaHCO30.147g溶于蒸馏水，定容到50ml），

[0062] 洗涤液PBST（磷酸盐缓冲液,0.01mol/L，加体积分数0.05%吐温），[0063] 底物液原液(柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,pH=5；柠檬酸0.5106g,Na2HPO4·12H2O1.8408g溶于蒸馏水，定容到50mL)

[0064] H2O2(质量分数为30%，实验加底物液前3—5min加入底物液中，加入量为底物液体积分数的0.15%)

[0065] OPD（邻苯二胺，实验加底物液前15-30min前加入底物液中，10mL底物液中加入4mgOPD）

[0066] 终止液（硫酸溶液，2mol/L)

[0067] 实验试剂都为分析纯，实验用水为三蒸去离子水。

[0068] 实施例2

[0069] 1.16nm金粒子全抗原的合成

[0070] 1）纳米金的合成

[0071] 取0.01%的氯金酸溶液100mL加热至沸腾，搅动下迅速加入1%柠檬酸三钠水溶液5mL，溶液的颜色迅速地变成黑色，在1分钟内变为紫红色，随着加热时间的增长，直到溶液出现透明的酒红色，约需7-10分钟左右。待颜色稳定后继续回流沸腾15分钟，撤热源持续搅拌， 冷却至室温，所得液体为16nm金溶胶，4℃保存备用。

[0072] 2）纳米金免疫原(GNP-BSA)的制备

[0073] 在搅拌下将巯基乙酸溶液加入到16nm金粒子溶液中，在磁力搅拌20min后调节溶液在弱酸条件下，分别加入EDAC和NHS溶液，室温避光下搅拌3h，然后再调节pH9～10，加入BSA，4℃下搅拌5h后，将反应液装入透析袋，用蒸馏水透析12h，避光保存在冰箱内。

[0074] 所述弱酸条件为PH=5.5；所述避光低温保存温度为4℃；

[0075] 所述巯基乙酸溶液浓度为0.001mol/L，特定粒径纳米金粒子溶液浓度为0.5μg/mL,EDAC溶液浓度为0.2mol/L，NHS溶液浓度为0.05mol/L，BSA浓度为10mg/mL，TGA、EDAC和NHS的物质的量比1:4:2；纳米金粒子、TGA和BSA的质量比为1:1:2000；

[0076] 4)纳米金包被抗原(GNP-OVA)的制备

[0077] 包被抗原的制备方法基本同免疫原的制备方法，不同处在于使用OVA代替BSA；

[0078] 2.16nm金粒子抗体的制备

[0079] 1)福氏佐剂的制备

[0080] 将液体石蜡和羊毛脂按2:1体积比用超声清洗器超声3小时左右，使之完全混匀，即滴一滴乳化剂到冰水混合液中半分钟之内不扩散才能算混合完全。此乳化剂称之为不完全佐剂。不完全佐剂低温(0-4℃)贮存，临用前加杀死的卡介苗即为完全佐剂。

[0081] 2)抗体的制备方法

[0082] 将免疫抗原与弗氏佐剂以体积比1:1混溶,对三只新西兰大白兔进行多次免疫，第一次免疫将免疫抗原与弗氏完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，免疫三周后，进行五次加强免疫，加强免疫是将免疫抗原与弗氏不完全佐剂混溶，免疫剂量1mL，免疫部位为背部皮下多点注射，五次加强免疫免疫间隔为两周，经五次加强免疫后,从大白兔心脏采血,血清室温20℃静置0.5h,在冰箱4℃静置2h后吸取上层澄清的血清，制得兔抗16nm金纳米粒子抗体。

[0083] 3.吸光度法测定特定粒径纳米金粒子含量

[0084] 包被：在酶标板中加入5μg/mL的包被抗原，100μL/孔，8组，每组3孔，37℃温育3h，PBST洗涤3次，包被抗原所用稀释液为包被液CB；

[0085] 封闭：加10mg/mL的OVA溶液，200μL/孔，37℃温育20min，PBST洗涤3次；

[0086] 竞争：加入50μL/孔浓度分别为0.01,0.02,0.1,0.2,1,2,10,20,100ng/mL16nm金粒子溶液，加入浓度为30μg/mL抗体，50μl/孔，37℃温育2h，PBST洗涤3次；

[0087] 加酶：加入100μL/孔稀释度为1:500酶标羊抗兔抗抗体溶液，37℃温育4h，PBST洗涤3次；

[0088] 显色：加入处理后的底物液100μL/孔，37℃温育温育60min；底物液处理方法为：在加处理后的底物液前15min向底物液原液加入OPD，加入量为10mL底物液原液中加入
4mgOPD，加处理后的底物液前3min向底物液原液加入质量分数为30%的H2O2，加入量为底物液原液体积分数的0.15%；

[0089] 检测：加入终止液50μL/孔，测定吸光度值，绘制标准曲线；

[0090] 将待测样用同样方法测定吸光度值，通过标准曲线求得待测样浓度。

[0091] 标准曲线的线性方程：