与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1

摘要

本发明提供一种与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1，所述人类蛋白ANKHD1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。其是利用酵母双杂交的方法通过转基因植物中外源蛋白对人的cDNA文库进行筛选，获得与外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白，并通过免疫共沉淀的方法对互作进行阳性验证。本发明可在转基因生物安全评价研究领域用于预测Bt蛋白对人体的潜在风险。

权利要求

1.与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1在转基因生物安全评价领域中Bt蛋白对人体非致病性潜在风险的预测中的应用，其中，所述人类蛋白ANKHD1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，当外源Bt蛋白进入人体内时，通过监测蛋白ANKHD1及其信号通路的下游蛋白，从而评价转基因植物安全性。

说明书

与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1

技术领域

[0001] 本发明涉及转基因生物食品安全和基因工程领域，具体地说，涉及一种与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1。

背景技术

[0002] 按照联合国粮农组织（FAO）的定义，生物安全是指“避免由于对具有感染能力的有机体或者遗传修饰有机体的研究和商品化生产而对人类的健康和安全以及环境的保护带来的风险”，可归纳为生态风险、食品安全和非预期效应三个方面。转基因生物中由于外源蛋白的引入在受体生物中表达而引起的生物安全问题引起了科学和民众的普遍关注。在转基因生物安全性评价的诸多项目中，食品的安全性问题是目前全球公众争论的热点之一，其原因在于转基因生物食用安全性评价具有显著的难以预测性和特异性。转基因食品可能产生的安全性问题主要包括：1）转基因食品中的外源基因及其表达产物对人体产生毒性；2）导入受体中的外源基因序列或其表达的蛋白质的氨基酸序列与已知的致敏原具有同源性、甚至产生出新的致敏原，使转基因食品具有过敏性；3）由于目前在遗传操作过程中选用的载体大多数具有抗生素抗性标记，因此抗生素抗性基因可能被转移到人和动物体内外的微生物中，从而产生耐药性的微生物；4）转基因食品的营养质量下降。由于外源基因的来源不同和导入位点的随机性，极有可能产生基因缺失、错码等突变，使所表达的蛋白质产物的性状、数量及在生物中的表达部位与期望值不符，导致转基因食品的营养质量下降或无法被人体有效地吸收利用。人类是转基因食品的直接或间接的消费者，而且是最终的消费者，因此公众必然会对转基因食品的安全性问题十分关注。因此，加强转基因植物的安全评价，特别是食用安全评价具有十分重要的意义。

[0003] 在转基因生物食品安全评价中，目前采用的传统方法都是将转基因植物及其产品用于饲喂实验动物，来观察实验动物各项生理指标的改变，以此评估转基因生物的安全性。但是，由于转基因生物在经过实验动物消化道时面临消化与吸收的问题，并不一定会进入实验动物体内，因此很难得到明确的结论，这也是公众对转基因生物安全评价质疑较多的地方。因此，如何评价转基因生物的潜在风险成为亟待解决的问题。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1。

[0005] 为了实现本发明目的，本发明提供一种与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1，所述人类蛋白ANKHD1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

[0006] 所述人类蛋白ANKHD1为人类锚定蛋白重叠片段和KH结构域内含蛋白1（ANKHD1）（自命名为M11），由人的ANKHD1基因编码，蛋白结构包括多个锚定蛋白重复结构域和一个KH结构域两个部分，具有支架蛋白的作用。全基因转录时，与相邻的下游基因EIF4EBP3通读（readthrough）形成共转录本MASK-BP3，最终编码一个融合蛋白，由MASK蛋白和不同的C-末端序列组成，前者占该融合蛋白的主要部分，后者的异同是由于下游基因EIF4EBP3的选择性剪接的结果。

[0007] 应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白ANKHD1的突变序列。

[0008] 其是利用酵母双杂交的方法通过转基因植物中外源蛋白对人的cDNA文库进行筛选，获得与外源蛋白相互作用的人类蛋白，并通过免疫共沉淀的方法对互作进行阳性验证，从而筛选得到与转基因植物中外源蛋白发生相互作用的人类蛋白。

[0009] 本发明还提供编码上述蛋白ANKHD1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0010] 本发明还提供含有编码上述蛋白ANKHD1的基因的载体。

[0011] 本发明还提供含有编码上述蛋白ANKHD1的基因的转基因细胞系。

[0012] 本发明还提供含有编码上述蛋白ANKHD1的基因的工程菌。

[0013] 本发明还提供上述蛋白ANKHD1在转基因生物安全评价领域中Bt蛋白对人体潜在风险的预测中的应用，即如果外源Bt蛋白通过某种途径进入人体内部，则会影响ANKHD1正常的生理功能，在研究转基因植物安全时，可以将蛋白ANKHD1及其信号通路的下游蛋白作为监测指标。

[0014] 本发明进一步提供筛选与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1的方法：利用酵母双杂交的方法通过转基因植物中外源Bt蛋白对人的cDNA文库进行筛选，获得与外源蛋白相互作用的人类蛋白，并通过免疫共沉淀的方法对互作进行阳性验证，从而筛选得到与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1，所述人类蛋白ANKHD1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

[0015] 具体包括以下步骤：

[0016] 1）编码外源蛋白Bt的基因的克隆与鉴定：从转基因植物中通过PCR或基因分离的方法获得外源蛋白Bt的基因序列，转化至宿主菌中克隆扩增，再通过PCR、琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析鉴定目的片段；

[0017] 2）含有外源目的片段的诱饵质粒载体的构建：回收目的片段，酶切后与载体pGBKT7连接，并转化入大肠杆菌中，筛选阳性克隆，即构建得到可表达BD-Bait融合蛋白的质粒；

[0018] 3）人cDNA文库的构建；

[0019] 4）可表达AD-Library/prey融合蛋白的质粒：构建于pGADT7载体上的人cDNA文库，购自Clontech公司；

[0020] 5）用酵母双杂交的方法筛选人的cDNA文库中与外源蛋白相互作用的候选蛋白；

[0021] 6）用免疫共沉淀的方法进一步验证阳性互作蛋白，从而筛得与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1。

[0022] 其中，步骤6）具体为：将步骤5）中获得的候选蛋白与外源蛋白Bt分别构建到载体pRK-HA和pRK-Flag上，与不同tag标签形成融合蛋白，然后用磷酸钙介导法共转染人胚胎肾细胞HEK293，20-24h后裂解细胞，与protein A偶联的Sepherose孵育沉淀，最后通过Western blot检测分析阳性互作的结果。

[0023] 具体地，本发明的一种筛选与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白ANKHD1的方法，包括以下步骤：

[0024] 1、外源蛋白基因的克隆与鉴定

[0025] 所述外源目的蛋白是指转基因植物中插入的目标性状。从转基因植物或外源目的蛋白的原始来源处通过PCR或基因分离的方法获得目标蛋白的基因序列，转化大肠杆菌克隆扩增，再通过PCR、琼脂糖凝胶电泳、序列测定、序列比对分析等鉴定目的片段。

[0026] 2、外源目的蛋白构建诱饵融合蛋白

[0027] 将上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳分离回收，双酶切消化目的基因片段和质粒载体，并回收纯化线性酶切产物。将载体和目的基因按照1:3的摩尔比进行连接反应，16℃过夜。连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，于抗性培养基上鉴定阳性克隆。摇菌提取重组质粒，经过PCR、双酶切和测序鉴定后，确定为外源目的基因构建的BD-Bait融合蛋白质粒，最后转化酵母鉴定外源蛋白重组子的自激活活性和毒性，即可用于后续分子操作。

[0028] 3、从Clontech公司购买人的cDNA文库，构建于pGADT7载体上。

[0029] 4、用共转化的方法通过酵母双杂交进行文库筛选

[0030] 共转系统转化使用的酵母菌株为Y2H Gold yeast strain，报告基因系统为：-His、-Ade、AUR1-C和MEL1。

[0031] （1）制备酵母感受态细胞

[0032] a.复苏酵母菌株，将冻存的菌液用接种环蘸取少许在YPDA固体培养板上划线培养，30℃倒置培养3天；

[0033] b.挑取直径为2-3mm的新鲜（1～3周）单菌落，接种于3mL的YPDA液体培养基中；

[0034] c.于30℃以250rpm转速培养8-12h；

[0035] d.在250mL的三角瓶中加入50mL的YPDA，转移5μL的上述培养液于其中，过夜培养16-20h至OD600达0.15-0.3；

[0036] e.室温700g离心5min，弃上清，用100mL的YPDA液体培养基重悬细胞沉淀；

[0037] f.30℃下230-270rpm继续培养3-5h，直至OD600达到0.4-0.5；

[0038] g.将酵母菌液转移到50mL离心管中，室温下700g离心5min，弃上清，沉淀用30mL无菌去离子水重悬；

[0039] h.室温下700g再离心5min，弃上清，每管沉淀用1.5mL新鲜制备的无菌1.1×TE/LiAc重悬；

[0040] i.将重悬液全部转移至1.5mLEP管中，最高转速离心15s；

[0041] j.弃上清，沉淀用600μL1.1×TE/LiAc重悬，即为酵母感受态细胞；

[0042] （2）共转化bait和prey于感受态细胞

[0043] k.在15mL的离心管中加入5μg DNA-BD/Bait，10μg AD/prey（AD-Library），20μg Yeastmaker Carrier DNA，600μL刚制备的酵母感受态细胞，轻轻的充分混匀后再加入2.5mL新制备的无菌PEG/LiAc，用枪头反复吹打充分混匀；

[0044] l.于30℃下培养45min，每10min轻弹离心管混匀一下；

[0045] m.加入160μL DMSO，并轻轻颠倒混匀；

[0046] n.42℃水浴中热激20min，每隔5min轻轻摇晃混匀一下；

[0047] o.热激结束后700g离心5min；

[0048] p.弃上清，并用3mL的YPD Plus Medium重悬，在30℃摇床上振荡培养90min;

[0049] q.700g离心5min，用15mL0.9%的NaCl溶液重悬并涂板。

[0050] （3）阳性克隆的筛选

[0051] 实验所用酵母双杂系统共有四个报告基因，即-His、-Ade、AUR1-C和MEL1，因此筛选结果最终确定的阳性克隆应该可以同时将这四个报告基因的表达激活。文库筛选过程首先是将共转化Bait和Prey菌液在加有α半乳糖苷酶(α-galactosidase)显色底物X-α-Gal和抗真菌素金担子素Aba的双缺培养基上初筛，这一步筛选所得到的克隆既可以生长且变蓝的菌落，理论上认为是由于蛋白质之间的相互作用而激活了两个报告基因AUR1-C和MEL1的表达。经过第一轮筛选得到的阳性克隆继续划线培养在含X-α-Gal和Aba的四缺培养基上。在四缺培养基上仍能很好的生长的菌落被认为激活了-His，-Ade基因的表达，这些菌落被认为是初步筛选得到的阳性结果。

[0052] （4）阳性克隆插入片段的测序分析

[0053] 提取所有阳性克隆酵母菌株的质粒，电击法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后菌液涂布LB+Amp的平板，以筛选文库AD质粒。由于表达诱饵蛋白的质粒是Kana抗性，而表达猎物蛋白的质粒是Amp抗性，就可以筛除诱饵质粒，而只保留猎物质粒。每个板上至少随机挑取10个单克隆，菌落PCR去除重复后提取质粒，测序并对序列进行分析。

[0054] （5）阳性克隆结果的验证

[0055] 将上述序列分析得到的阳性蛋白分别与外源蛋白一对一共转化Y2H Gold strain和AH109酵母菌株，进行酵母双杂交以确认其相互作用。

[0056] （6）阳性互作蛋白通过免疫共沉淀实验的进一步验证

[0057] 将获得的阳性蛋白与外源蛋白分别构建到载体pRK-HA和pRK-Flag上，与不同tag标签形成融合蛋白，磷酸钙介导法共转染人胚胎肾细胞HEK293，20-24h后裂解细胞，与protein A偶联的Sepherose孵育沉淀。Western blot检测分析阳性互作的结果。

[0058] 本发明提供一种与转基因植物外源Bt蛋白相互作用的人类蛋白，为转基因生物安全评价领域中预测Bt蛋白对人体潜在风险的研究提供了一个新的研究方法和监测指标，对目前的实质等同性原则基础下的各种方法具有很好的改进和补充作用。本发明具有以下优点：

[0059] （一）确定性：针对传统研究转基因生物安全的各种方法中存在的最大问题，即由因果之间各通路链条的“黑盒子”而导致的不确定性，本发明直接从效应产生的根本原因入手，获得明确的结论。

[0060] （二）高效性：通过酵母双杂交进行的文库筛选和验证即可以获得一些阳性互作蛋白，结果明确且易于分析。

[0061] （三）实用性：酵母双杂交的方法对比于比较分析法和组学技术更为成熟和简单，更易于操作。

[0062] （四）广泛适应性：本发明方法可以用于任何转基因植物外源目标蛋白潜在风险的研究。

附图说明

[0063] 图1为本发明较佳实施例中通过酵母双杂交验证文库筛选的阳性蛋白，图示表明外源蛋白与人的ANKHD1（M11）蛋白有相互作用；其中，A为pGADT7空载体分别与pGBKT7空载体及pGBKT7-BT共转化酵母的结果；B为pGADT7融合蛋白载体分别与pGBKT7空载体及pGBKT7-BT共转化酵母的结果。

[0064] 图2为本发明较佳实施例中通过免疫共沉淀实验验证外源蛋白与人的ANKHD1（M11）蛋白的体内相互作用；其中，A为免疫共沉淀的结果，B为空对照和ANKHD1蛋白全细胞水平表达的检测。

具体实施方式

[0065] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

[0066] 实施例Bt蛋白对人体潜在风险的预测研究

[0067] 1.1外源蛋白Bt基因的克隆鉴定

[0068] 分析目的基因片段序列和连接载体多克隆位点信息，设计引物：

[0069] 5’端引物：5′-CCCATATGATGGATAACAATCCGAACATC-3′，下划线部分为NdeI酶切位点；

[0070] 3’端引物：5′-GCGTCGACATCATATTCTGCCTCAAAGG-3′，下划线部分为SalI酶切位点；

[0071] 对苏云金杆菌HD-1菌株PCR获得Bt基因片段。50μL PCR体系：5’端引物1μL，3’端引物1μL，10×KOD缓冲液5μL，MgSO4缓冲液2μL，dNTP5μL，KOD plus酶1μL，ddH2O35μL；PCR条件：94℃预变性5min，39个循环：94℃30s，58℃30s，72℃2min，最终延伸72℃10min。将PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小并送Invitrogen公司测序，NCBI上Blast比对鉴定序列信息。

[0072] 1.2诱饵质粒载体的构建

[0073] 将上述PCR产物琼脂糖凝胶电泳跑胶回收，用NdeI和SalI双酶切同时分别消化目的基因片段Bt和质粒载体pGBKT7，并回收纯化线性酶切产物。将载体和目的基因按照1:3的摩尔比进行连接反应，16℃过夜。连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，于抗性培养基上鉴定阳性克隆。摇菌提取重组质粒，经过PCR、双酶切和测序鉴定后，转化酵母感受态细胞鉴定其没有自激活活性和毒性，可用于后续分子操作。

[0074] 1.3文库筛选

[0075] 用酵母双杂交的方法筛选人的cDNA文库中与苏云金杆菌杀虫蛋白（CryIAb/Bt）相互作用的候选蛋白。本发明中以Bt作为Bait连接到载体pGBKT7上构成BD-Bait，而文库蛋白则作为prey构建成AD-Library/prey。共转化所用酵母菌株为Y2H Gold yeast strain，报告基因系统为：-His、-Ade、AUR1-C和MEL1。

[0076] ①制备酵母感受态细胞

[0077] a.复苏酵母菌株，将冻存的菌液用接种环蘸取少许在YPDA固体培养板上划线培养，30℃倒置培养3天；

[0078] b.挑取直径为2-3mm的新鲜（1～3周）单菌落，接种于3mL的YPDA液体培养基中；

[0079] c.于30℃以250rpm转速培养8-12h；

[0080] d.在250mL的三角瓶中加入50mL的YPDA，转移5μL的上述培养液于其中，过夜培养16-20h至OD600达0.15-0.3；

[0081] e.室温下700g离心5min，弃上清，用100mL的YPDA液体培养基重悬细胞沉淀；

[0082] f.30℃下230-270rpm继续培养3-5h，直至OD600达到0.4-0.5；

[0083] g.将酵母菌液转移到50mL离心管中，室温下700g离心5min，弃上清，沉淀用30mL无菌的去离子水重悬；

[0084] h.室温下700g再离心5min，弃上清，每管沉淀用1.5mL新鲜制备的无菌1.1×TE/LiAc重悬；

[0085] i.将重悬液全部转移至1.5mLEP管中，最高转速离心15s；

[0086] j.弃上清，沉淀用600μL1.1×TE/LiAc重悬，即为酵母感受态细胞；

[0087] ②共转化bait和prey于感受态细胞

[0088] k.接着进行文库共转化实验；在15mL的离心管中加入5μgDNA-BD/Bait（pGBKT7-Bt），10μg AD/prey（pGADT7-Library），20μgYeastmaker Carrier DNA，600μL刚制备的酵母感受态细胞，轻轻的充分混匀后再加入2.5mL新制备的无菌PEG/LiAc，用枪头反复吹打充分混匀；

[0089] l.于30℃下培养45min，每10min轻弹离心管混匀一下；

[0090] m.加入160μL DMSO，并轻轻颠倒混匀；

[0091] n.42℃水浴中热激20min，每隔5min轻轻摇晃混匀一下；

[0092] o.热激结束后700g离心5min；

[0093] p.弃上清，并用3mL的YPD Plus Medium重悬，在30℃摇床上振荡培养90min；

[0094] q.700g离心5min，用15mL0.9%的NaCl溶液重悬并涂板。

[0095] ③阳性克隆的筛选

[0096] 实验所用酵母双杂系统共有四个报告基因，即-His、-Ade、AUR1-C和MEL1，因此筛选结果最终确定的阳性克隆应该可以同时将这四个报告基因的表达激活。文库筛选过程首先是将共转化DNA-BD/Bait（pGBKT7-BT）和人的cDNA文库（购自Clontech公司）构建的AD/prey（pGADT7-Library）的酵母菌液涂布在加有α半乳糖苷酶(α-galactosidase)显色底物X-α-Gal和抗真菌素金担子素Aba的双缺培养基上初筛，这一步筛选所得到的克隆既可以生长且变蓝的菌落，理论上认为是由于蛋白质之间的相互作用而激活了两个报告基因AUR1-C和MEL1的表达。经过第一轮筛选得到的阳性克隆继续划线培养在含X-α-Gal和Aba的四缺培养基上进行更严谨的阳性筛选。在四缺培养基上仍能很好的生长的菌落被认为又激活了-His、-Ade基因的表达，这些菌落被初步认为是筛选得到的阳性结果。四缺板上筛选的阳性结果见图1，A为pGADT7空载体分别与pGBKT7空载体及pGBKT7-BT共转化酵母，即使用AD+BD和AD+BD-BT共转体系作为实验组的对照实验；B图中第一行也为对照组实验，为AD-ANKHD1+BD的系统对照组；对照实验结果表明，共转的双空载体以及单空载体+单融合蛋白共转组可以在二缺的培养基上生长，表明两个载体均已转入菌体中，但是不能在四缺和四缺加X-α-Gal和抗真菌素金担子素Aba的培养基上生长，说明空载体本身，或空载体+单一的融合蛋白均不能激活报告基因系统的表达，单一融合蛋白不具有自激活活性，进一步说明实验组结果的发生是由于ANKHD1和BT相互作用的结果。

[0097] B图中第二行的3个结果为实验组结果，AD-ANKHD1+BD-BT两个融合蛋白载体共转化酵母菌后在双缺培养基和四缺培养基上都能生长，且在加了X-α-Gal和抗真菌素金担子素Aba的四缺培养基上仍可以生长而且菌斑变蓝。

[0098] 酵母双杂交结果表明ANKHD1蛋白和BT蛋白具有相互作用，并通过这一相互作用能够结合在一起，从而引起后续的一些效应。

[0099] 以上结果表明蛋白ANKHD1可与Bt蛋白产生相互作用。

[0100] ④阳性克隆插入片段的测序分析

[0101] 提取所有阳性克隆酵母菌株的质粒，电击法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化后菌液涂布LB+Amp的平板，以筛选文库AD质粒。由于表达诱饵蛋白的质粒是Kana抗性，而表达猎物蛋白的质粒是Amp抗性，就可以筛除诱饵质粒，而只保留猎物质粒。每个板上至少随机挑取10个单克隆，菌落PCR去除重复后提取质粒，测序并对序列进行分析。

[0102] ⑤阳性克隆结果的验证

[0103] 将上述序列分析得到的有意义的阳性蛋白分别与pGBKT7-Bt一对一共转化Y2H Gold strain和AH109酵母菌株，以确认其相互作用。最终筛选得到与外源Bt蛋白相互作用的蛋白：人类锚定蛋白重叠片段和KH结构域内含蛋白1（ANKHD1）（自命名为M11），由人的ANKHD1基因编码，蛋白结构包括多个锚定蛋白重复结构域和一个KH结构域两个部分，具有支架蛋白的作用。全基因转录时，与相邻的下游基因EIF4EBP3通读（readthrough）形成共转录本MASK-BP3，最终编码一个融合蛋白，由MASK蛋白和不同的C-末端序列组成，前者占该融合蛋白的主要部分，后者的异同是由于下游基因EIF4EBP3的选择性剪接的结果。

[0104] 1.4阳性互作蛋白免疫共沉淀验证

[0105] HEK293细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMED培养基中，在5%二氧化碳培养箱6
中37℃下培养。将细胞接种于10cm培养皿中，18-24h后长至1×10后可用于转染。Bt和ANKHD1分别构建到载体pRK-Flag和pRK-HA上与相关tag标签形成融合蛋白。各取Bt-Flag和ANKHD1-HA质粒10μg通过磷酸钙介导转染293细胞，20-24h后收取细胞，用1mL细胞裂解液（20mM Tris，150mM NaCl，1%Triton，1mM EDTA，10μg/mL蛋白酶抑制剂（aprotinin），
10μg/mL亮抑蛋白酶肽（leupeptin），1mM苯甲基磺酰氟，pH7.5）于4℃或冰浴裂解细胞
30min，14,000rpm离心10min，上清液分2份：50μL用来做全细胞裂解液中蛋白表达的测定，剩余950μL用来做免疫共沉淀和免疫印迹分析。

[0106] 免疫共沉淀：将上一步收集的950μL上清蛋白液加入anti-Flag的抗体，与30μL protein A偶联的Sepherose4℃孵育过夜，12,000rpm离心10min，弃上清，用清洗液洗2次后加入2×SDS上样缓冲液后煮沸10min，迅速移冰上，4℃12,000rpm离心10min，获得共沉淀蛋白样品。

[0107] Western Blot检测：将上一步中获得的蛋白样与全细胞裂解蛋白样同时进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，免疫印迹用αFlag或αHA的单克隆抗体室温孵育2小时，TTBS洗后与HRP偶联二抗孵育1小时后显影检测，结果表明蛋白ANKHD1与Bt蛋白具有明显的相互作用（图2）。在图2中，A和B的第一泳道为空对照实验组，第二泳道为BT和ANKHD1实验组；B图为对照组和ANKHD1蛋白全细胞水平表达的检测，A为IP检测结果，使用BT融合蛋白标签Flag与Sepherose A Beeds孵育，洗脱后免疫印迹，Western使用ANKHD1蛋白融合标签HA显影，结果表明BT-Flag可以免疫沉淀ANKHD1-HA蛋白，两者具有相互作用。

[0108] 最终筛选得到与外源Bt蛋白相互作用的蛋白：人类锚定蛋白重叠片段和KH结构域内含蛋白1（ANKHD1）。如果转基因植物中的外源Bt蛋白通过某种途径进入人体内部，则会与ANKHD1发生相互作用，而影响其正常的生理功能，如影响能量代谢功能，这可视为外源Bt蛋白对人体的潜在风险，当然仍需更多的证据支持。在研究转基因植物安全时，可以ANKHD1及其信号通路的下游蛋白作为监测指标。

[0109] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。