胞质的荧光离子指示剂

摘要

用于结合水增溶官能团的荧光离子指示剂的新颖的荧光团。这些荧光团使得具有不溶于水或难溶于水的螯合剂的离子浓度的波长分析可见。该荧光团的绿色版本包括具有羧酸盐附属物的一种假定的荧光素。该荧光团的橙色版本包括也具有羧酸盐附属物的一种假定的碱性玫瑰精。将该荧光团附接到12‑冠醚‑4、15‑冠醚‑5、18‑冠醚‑6、21‑冠醚‑7、或24‑冠醚‑8上从而分别产生锂、钠、钾、铷、和铯指示剂家族。将该荧光团附接到二氮杂[1,1,1]、[1,1,2]、[1,2,2]、[2,2,2]、[2,2,3]、[2,3,3]、或[3,3,3]穴醚上从而分别产生更具选择性的锂、钠、钾、铷、和铯指示剂家族。将该荧光团附接到BAPTA、APTRA、或半‑BAPTA或它们的类似物上，产生强烈地抗自该细胞的泄漏的新的钙、镁以及其他金属离子指示剂家族。

权利要求

1.一种荧光钠离子指示剂ANG-1的盐形式和AM形式：ANG-1TMA+盐，R4＝(CH3)4N+，ANG-1(AM)，R4＝CH2OCOCH3。

2.一种荧光钠离子指示剂ANG-2的盐形式和AM形式：ANG-2TMA+盐，R4＝(CH3)4N+，4

ANG-2(AM)，R＝CH2OCOCH3。

说明书

胞质的荧光离子指示剂

[0001] 相关申请

[0002] 本申请涉及于2010年9月20日提交的美国临时专利申请号61/384,695，并且要求来自这个申请的优先权。本申请涉及于2011年3月17日提交的美国临时专利申请号61/453,664，并且将其通过引用结合在此。
发明领域

[0003] 本发明涉及一种荧光团以及该荧光团与一个螯合部分组合以提供新荧光离子指示剂的用途。

[0004] 发明背景

[0005] 荧光离子指示剂典型地包括一个连接到一个荧光团上的螯合部分，使得激发和/或发射波长的变化，或激发和/或发射强度的变化，或这两者在结合该离子时发生。为了感测水介质中的离子浓度，该荧光离子指示剂应当是水溶的。对于细胞内的测量，该指示剂不应当以将干扰该分析的速率从该细胞泄漏出。为了方便起见，应当将该指示剂以无创性的方式加载，例如，作为一种乙酰氧基甲基酯。

[0006] 许多螯合剂，如冠醚和穴醚，缺点在于很差的水溶解度，由此限制了对有机溶剂的离子测量。然而，如果将这些螯合剂连接到一个水溶性的荧光团上，它们可以产生一种用于水介质的荧光离子指示剂。

[0007] 对于易溶于水的螯合剂，如BAPTA，该水溶性的荧光团可以增强水溶性并且，对于细胞内的测量，可以增强荧光离子指示剂的细胞保留。

[0008] 两种此类水溶性的荧光团，羟基呫吨酮变体和rosamine变体，是Asante Green(绿)TM(I)以及Asante Orange(橙)TM(II)。

[0009] 发明概述

[0010] 本发明披露了新的用于测量金属离子的浓度的荧光离子指示剂。

[0011] 该荧光离子指示剂包括一种结合水增溶官能团的、波长可见的荧光团，使得该指示剂的螯合部分不需要结合相同基团。这样一种荧光团因此使得具有不溶于水或难溶于水的螯合剂的离子浓度的波长分析可见。

[0012] 由于这些指示剂的一个应用包括离子的胞质浓度的测量，该水增溶基团应当是作为可以透过该脂质细胞膜的疏水部分可掩蔽的。这样一个疏水部分典型地易于被细胞组分切割以使得该指示剂回到其水溶性形式。最普及的疏水性掩模是乙酰氧基甲基酯，它可由胞质溶胶中的非特异性酯酶切割。

[0013] 对于相同的细胞应用，该荧光离子指示剂应当在该细胞中保留足够长的时间使得其泄漏不会对实验结果产生不利影响。水增溶羧酸盐有助于将该指示剂保留在细胞中。

[0014] 对于钙离子，该指示剂的BAPTA螯合部分包括四种水增溶的且细胞-保留性的羧酸盐。对于碱土金属，该螯合部分典型地包括不具有羧酸盐官能团的冠醚或穴醚。在这种情况下，该荧光团提供所必需的羧酸盐官能团。

[0015] 在螯合剂是如不包含水增溶的且细胞-保留性的部分的BAPTA的情况下，该荧光团只增加亲水性并增强该指示剂的保留。

[0016] 一些现有技术的UV激发荧光团具有乙酰氧基甲基酯-可掩蔽的、水增溶的官能团；如在Fura-2、Indo-1、SBFI、PBFI或SBFO中的那些。很少有可见的激发荧光团存在有这些特性，并且甚至更少有已经共价连接到螯合剂上的。

[0017] 该荧光团的绿色版本包括一种假定的荧光素，该荧光素是卤代的以确保在生理学pH处的pH不敏感性并且在生理学pH处展示了两种羧酸盐官能。

[0018] 该荧光团的橙色版本包括具有经羧酸盐烷基化的氨基/亚氨基(immino)官能的一种假定的碱性玫瑰精。

[0019] 将该荧光团附接到12-冠醚-4、15-冠醚-5、18-冠醚-6、21-冠醚-7、或24-冠醚-8上从而分别产生锂、钠、钾、铷、和铯指示剂家族。

[0020] 将该荧光团附接到二氮杂[1,1,1]、[1,1,2]、[1,2,2]、[2,2,2]、[2,2,3]、[2,3,3]、或[3,3,3]穴醚上从而分别产生更具选择性的锂、钠、钾、铷、和铯指示剂家族。

[0021] 将该荧光团附接到BAPTA或其类似物上从而产生一种新的、强烈地抗自该细胞的泄漏的钙指示剂家族，这归功于该荧光团上的另外的羧酸盐。这些钙指示剂展示出比现有技术的指示剂(例如Fluo-4)更大的亮度以及动态范围。

[0022] 将该荧光团附接到APTRA或其类似物上从而产生一种新的、强烈地抗自该细胞的泄漏的镁指示剂家族，这归功于该荧光团上的另外的羧酸盐。

[0023] 将该荧光团附接到半-BAPTA或其类似物上从而产生一种新的、强烈地抗自该细胞的泄漏的指示剂家族，这归功于该荧光团上的另外的羧酸盐。

[0024] 附图简要说明

[0025] 图1示出了在一个非细胞的水滴定中，荧光钠指示剂ANG-1对不断增加的钠浓度的响应。

[0026] 图2示出了在一个非细胞的水滴定中，荧光钠指示剂ANG-2对不断增加的钠浓度的响应。

[0027] 图3示出了在一个非细胞的水滴定中，荧光钠指示剂ANG-3对不断增加的钠浓度的响应。

[0028] 图4示出了在一个非细胞的水滴定中，荧光钾指示剂APG-1对不断增加的钾浓度的响应。

[0029] 图5示出了在一个非细胞的水滴定中，荧光钾指示剂APG-2对不断增加的钾浓度的响应。

[0030] 图6示出了在一个非细胞的水滴定中，荧光钙指示剂ACG-1对不断增加的钙浓度的响应。

[0031] 图7示出了在HEK293细胞中，由于TRPV1通道的辣椒素激动作用(capsaicin agonization)，荧光钠指示剂ANG-1对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。

[0032] 图8示出了在REF52细胞中，由于Na+离子载体短杆菌肽-促进的内流，荧光钠指示剂ANG-1对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。

[0033] 图9示出了在星形细胞中，由于钠泵的乌巴苷抑制，荧光钠指示剂ANG-1对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。

[0034] 图10示出了在REF52成纤维细胞中，由于Na+离子载体SQI-Pr-促进的内流，荧光钠指示剂ANG-2对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。

[0035] 图11示出了在REF52成纤维细胞中，荧光钠指示剂ANG-2对细胞内Na+的两性霉素-B消耗，并且然后对不断增加的细胞内Na+浓度的响应。

[0036] 图12示出了在REF52成纤维细胞中，荧光钠指示剂APG-1对细胞内K+的两性霉素-B消耗，并且然后对不断增加的细胞内K+浓度的响应。

[0037] 图13比较了Ca2+-饱和的ACG-1对荧光素的量子效率。

[0038] 图14示出了在大鼠迷走神经的感觉神经元中，荧光钙指示剂ACG-1对从1-1000msec范围的去极化步骤的响应。

[0039] 图15示出了在一个非细胞的水滴定中，荧光钠指示剂(二氮杂-15-冠醚-5螯合剂；Z1＝O-+TMA；Z2＝O；R1＝Cl；R2＝(CH2)nCOO-+TMA，n＝2；R3＝R6＝R7＝R8＝R9＝H)对不断增加的钠浓度的响应。

[0040] 图16示出了在一个非细胞的水滴定中，荧光钠指示剂(二氮杂-15-冠醚-5螯合剂；Z1＝O-+TMA；Z2＝O；R1＝H；R2＝(CH2)nCOO-+TMA，n＝2；R3＝R7＝R8＝R9＝H，R6＝OMe)对不断增加的钠浓度的响应。

[0041] 实施方案的说明

[0042] 将Asante Green(绿)TM和Asante Orange(橙)TM共价连接到某些螯合剂上从而产生水溶性且细胞-保留性的荧光离子指示剂，包括用于锂、钠、钾、铷、铯、镁、钙、和铊的那些。

[0043]

[0044] X＝F、Cl、Br R1＝(CH2)nCOO-，n＝0、1、2、3

[0045] R1＝(CH2)nCOO-，n＝0、1、2、3 R2＝H或(CH2)nCOO-，n＝0、1、2、3

[0046] 在这个实施例中，这些离子指示剂包括经由一个连接物(如图LINKER(连接物)所示)连接到一种螯合剂上的Asante Green(绿)或Asante Orange(橙)荧光团(如图FLUOROPHORE(荧光团)所示)。当该螯合剂包括一种二氮杂冠醚时，该荧光团可以经由一个非环状连接物(如图NON-ANNULATED LINKER(非环状连接物)所示)被连接到该冠醚的一个氮杂或胺官能上，而该冠醚的其他氮杂或胺官能用一个可以包含多个部分的芳香族的官能(如图NON-ANNULATED CAP(非环状帽)所示)进行加帽，从而增加或降低螯合剂亲和性、增强细胞的保留、将该指示剂定位在细胞膜或其他细胞区室处、或激活反应活性部位用于附接到合成的或天然的聚合物上。当该螯合剂包括一种环状二氮杂冠醚或穴醚时，该荧光团可以经由一个环状连接物(如图ANNULATED LINKER(环状连接物)所示)被连接到该冠醚的一个氮杂官能上，然而该冠醚的其他氮杂官能用一个可以包含多个部分的环状芳香族的官能(如图ANNULATED CAP(非环状帽)所示)进行加帽，从而增加或降低螯合剂亲和性、增强细胞的保留、将该指示剂定位在细胞膜或其他细胞区室处、或激活反应活性部位用于附接到合成的或天然的聚合物上。

[0047]

[0048] Z1＝OR4或NR5aR5b

[0049] Z2＝O或NR5aR5b

[0050] R1＝H、F、Cl、Br或(CH2)nCO2R4，n＝0、1、或2

[0051] R2＝H、F、Cl、Br或(CH2)nCO2R4，n＝0、1、或2

[0052] R3＝H、F、Cl、Br

[0053] R4＝H、盐(即，TMA+、K+)或AM(CH2OCOCH3)、或任何其他药学上可接受的盐和酯[0054] R5a＝(CH2)nCO2R4，n＝0、1、或2

[0055] R5b＝(CH2)nCO2R4，n＝0、1、或2

[0056] R50＝到一个非环状连接物、环状连接物或螯合剂上的共价键

[0057]

[0058] R6＝H、OMe、F

[0059] R7＝H、OMe、F

[0060] R8＝H、OMe、F

[0061] R9＝H、OMe、F

[0062] R51＝在R50处到该荧光团上的共价键

[0063] R52＝到一个非环状螯合剂上的共价键

[0064]

[0065] R10＝H、OMe、F

[0066] R11＝H、OMe、F

[0067] R12＝H、Me、F、Br、Cl、I、(CH2)nCO2R4[n＝0、1、或2]、NO2、CHO、

[0068]

[0069] R13＝H、OMe、F

[0070] R14＝H、OMe、F

[0071] R53＝到一个非环状螯合剂上的共价键

[0072]

[0073] N、O是该环状冠醚或穴醚中的杂原子

[0074] R15＝H、OMe、F

[0075] R16＝H、OMe、F

[0076] R17＝H、OMe、F

[0077] R51＝在R50处到该荧光团上的共价键

[0078]

[0079] N、O是该环状冠醚或穴醚中的杂原子

[0080] R18＝H、OMe、F

[0081] R19＝H、OMe、F

[0082] R20＝H、Me、F、Br、Cl、I、(CH2)nCO2R4[n＝0、1、或2]、NO2、CHO、

[0083]

[0084] R21＝H、OMe、F

[0085] 用于锂的螯合剂的实例包括单氮杂-12-冠醚-4、二氮杂-12-冠醚-4、二苯并二氮杂-12-冠醚-4、以及[1,1,1]-二苯并穴醚。

[0086]

[0087]

[0088] R22＝(CH2)nCH3，n＝0、1、或2

[0089]

[0090] 用于钠的螯合剂的实例包括单氮杂-15-冠醚-5、二氮杂-15-冠醚-5、二苯并二氮杂-15-冠醚-5、[1,1,2]-二苯并穴醚、以及[1,2,2]-二苯并穴醚。

[0091]

[0092] 用于钾的螯合剂的实例包括单氮杂-18-冠醚-6、二氮杂-18-冠醚-6、二苯并二氮杂-18-冠醚-6、以及[2,2,2]-二苯并穴醚。

[0093]

[0094] 用于钙的螯合剂的实例包括BAPTA及其衍生物：

[0095]

[0096] R24＝H、F、Br、Cl

[0097] R25＝H、Me、F、Br、Cl、I、NO2、CHO、(CH2)nCO2R4[n＝0、1、或2]、

[0098]

[0099] R26＝H、F、Br、Cl、(CH2)nCO2R4[n＝0、1、或2]、

[0100]

[0101] R51＝在R50处到该荧光团上的共价键

[0102] 用于镁的螯合剂的实例包括APTRA及其衍生物：

[0103]

[0104] R51＝在R50处到该荧光团上的共价键

[0105] 用于铊的螯合剂的实例包括半-BAPTA及其衍生物。

[0106]

[0107] R51＝在R50处到该荧光团上的共价键

[0108] 合成

[0109] 这些合成方案典型地包括该螯合剂/连接物的合成、随后附加该荧光团。该荧光团引起化合物1与该螯合剂/连接物部分上的苯甲醛的缩合

[0110]

[0111] Z＝OH或NR5aR5b

[0112] R1＝H、F、Cl、Br或(CH2)nCO2R4，n＝0、1、或2

[0113] R2＝H、F、Cl、Br或(CH2)nCO2R4，n＝0、1、或2

[0114] R3＝H、F、Cl、Br

[0115] R4＝H、盐(即，TMA+、K+)或AM(CH2OCOCH3)、或任何其他药学上可接受的盐和酯[0116] R5a＝(CH2)nCO2R4，n＝0、1、或2

[0117] R5b＝(CH2)nCO2R4，n＝0、1、或2

[0118] 方案1描绘了在以下情况下的化合物1的合成：Z＝OH，R1＝Cl，R2＝(CH2)2CO2Me，并且R3＝H。

[0119]

[0120] a)NaOCl，KOH b)K2CO3，BnCl，NaI，DMF c)Br-Ph3P+(CH2CO2Me)，K2CO3d)Pd/C/H2AcOH，50psi

[0121] 将可商购的2,4-二羟基苯甲醛在碱性溶液中用次氯酸钠氯化。将这些苯酚保护为苄氧基醚，接着与甲基溴乙酸酯的三苯基膦盐进行维蒂希反应(Wittig reaction)。随后进行催化还原以及脱苄基作用，给出所希望的产物。

[0122] 方案2描绘了在以下情况下的化合物1的合成：Z＝OH，R1＝Cl，R2＝CO2Me，并且R3＝H。

[0123]

[0124] a)NaOCl，KOH b)MnO2，MeOH

[0125] 将可商购的2,4-二羟基苯甲醛在碱性溶液中用次氯酸钠氯化。将该醛在甲醇中用二氧化锰氧化为甲酯。

[0126] 方案3描绘了在以下情况下的化合物1的合成：Z＝OH，R1＝Cl，R2＝CH2CO2Me，并且R3＝H。

[0127]

[0128] a)NaOCl，KOH b)BnCl，NaI，K2CO3c)LAH d)SO2Cl2e)KCN f)1.KOH，2.HCl g)MeOH，H2SO4h)Pd/C/H2AcOH，50psi

[0129] 将可商购的2,4-二羟基苯甲醛在碱性溶液中用次氯酸钠氯化并且然后进行苄基化以保护这些苯酚。进行氢化铝锂还原反应，给出该醇，将该醇用氯化硫酰转化为氯化物。用氰化钾置换该氯化物，给出腈，将该腈水解为羧酸。进行酯化作用，接着进行催化脱苄基作用，给出所希望的产物。

[0130] 方案4描绘了在以下情况下的化合物1的合成：Z＝OH，R1＝(CH2)2CO2Me，R2＝Cl，并且R3＝H。

[0131]

[0132] a)Br-Ph3P+(CH2CO2Me)，K2CO3b)Pd/C/H2c)BBr3d)MeOH，H2SO4e)NCS

[0133] 将可商购的2,6-二甲氧基苯甲醛用甲基溴乙酸酯的三苯基膦盐进行缩合。将该亚烷基进行催化还原，接着进行这些甲醚的三溴化硼切割。将该羧酸再酯化，并且用N-氯代琥珀酰亚胺氯化，给出所希望的产物。

[0134] 方案5描绘了在以下情况下的化合物1的合成：Z＝N(CH2CH2CO2Me)2，R1＝R2＝R3＝H。

[0135]

[0136] a)BrCH2CO2Me，DIPEA b)Pd/C/H2AcOH

[0137] 将可商购的3-苄氧基苯胺用甲基溴乙酸酯进行烷基化，接着进行催化脱苄基作用以给出所希望的产物。

[0138] 钠

[0139] 由于仅冠醚或穴醚大小(size)会变化，为了简单起见，针对螯合剂的钠基团示出了用于该螯合剂/连接物的合成的方案，以便于还表示锂、钾、铷、或铯。

[0140] 方案6示出了化合物2的合成，R6＝R7＝R8＝R9＝H：

[0141]

[0142] a)DMF回流b)Pd/C/H2c)NaNO2/HCl d)H3PO2e)DMF/POCl3f)Z＝OH，MeSO3H或Z＝NR5R6，丙酸g)对氯醌h)TMAOH i)AM-Br，DIPEA

[0143] 在DMF回流下，将商用的氮杂-15-冠醚-5与对氟硝苯反应以产生N-p-硝基苯基-氮杂-15-冠醚-5。将该硝基还原并去重氮化以产生N-苯基-氮杂-15-冠醚-5。进行维尔斯迈尔反应(Vilsmeier reaction)以产生苯甲醛，将该苯甲醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0144] 方案7a示出了化合物2的合成，R6＝R7＝R8＝R9＝H：

[0145]

[0146] a)吡啶回流b)Pd/C/H2c)NaNO2/HCl d)H3PO2e)DMF/POCl3f)Z＝OH，MeSO3H或Z＝5a 5b
NR R ，丙酸g)对氯醌h)TMAOH i)AM-Br，DIPEA

[0147] 在吡啶回流下，将商用的二氮杂-15-冠醚-5与对氟硝苯反应以产生双-N-p-硝基苯基-二氮杂-15-冠醚-5。将这些硝基催化还原并去重氮化以产生双-N-苯基-二氮杂-15-冠醚-5。进行维尔斯迈尔反应(Vilsmeier reaction)以产生二苯甲醛，将该二苯甲醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0148] 方案7b示出了化合物2的合成，R6＝R7＝R8＝R9＝R10＝R11＝R12＝R13＝R14＝H。

[0149]

[0150] e)DMF/POCl3/吡啶，室温f)Z＝OH，MeSO3H或NR5aR5b，丙酸g)对氯醌h)TMAOH i)AM-Br，DIPEA

[0151] 从方案7a，双-N-苯基-二氮杂-15-冠醚-5：进行温和的维尔斯迈尔反应，产生单苯甲醛，将该单苯甲醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0152] 方案8示出了化合物2的合成，R6＝R8＝OMe，R7＝R9＝H。

[0153]

[0154] a)氯仿/甲醇回流b)Pd/C/H2c)Me2SO4，TMAOH d)DMF/POCl3e)Z＝OH，MeSO3H或Z＝NR5aR5b，丙酸f)对氯醌g)TMAOH h)AM-Br，DIPEA

[0155] 将商用的二氮杂-15-冠醚-5与醌反应以给出醌加合物，将其还原并且然后用硫酸二甲酯进行烷基化以给出该四甲氧基化合物。进行维尔斯迈尔甲酰化作用(Vilsmeier formylation)，给出二醛，将该二醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0156] 类似于方案6对比方案7a，用单氮杂-15-冠醚-5通过方案8给出单-氮杂化合物2，R6＝R8＝Ome，R7＝R9＝H。类似于方案7b对比方案7a，进行温和的维尔斯迈尔甲酰化作用，给出单甲酰基化合物而不是二醛，该单甲酰基化合物产生化合物2，R6＝R8＝R10＝R13＝OMe，R7＝R9＝R11＝R12＝R14＝H。

[0157] 方案9示出了化合物2的合成，R6＝OMe，R7＝R8＝R9＝H。

[0158]

[0159] a)1,2-双(2-氯乙氧基)乙烷，DIPEA b)氯化二羟乙酰，吡啶，高稀释度苯c)B2H6d)DMF/POCl3e)Z＝OH，MeSO3H或Z＝NR5aR5b，丙酸f)对氯醌g)TMAOH h)AM-Br，DIPEA[0160] 将可商购的邻茴香胺与1,2-双(2-氯乙氧基)乙烷反应以形成“半冠醚”，通过氯化二羟乙酰的加成将它闭合为“全冠醚”，随后进行二酰胺的还原反应。进行维尔斯迈尔甲酰化作用，给出二醛，将该二醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0161] 一个变体；R1＝Cl；R2＝(CH2)nCOOR4，n＝2；R3＝R7＝R8＝R9＝H；R6＝OMe；给出Asante NaTRIUM Green-3(ANG-3)。

[0162]

[0163] ANG-3TMA+盐，R4＝(CH3)4N+

[0164] ANG-3(AM)，R4＝CH2OCOCH3

[0165] 有趣地是，用甲醇作为唯一的溶剂来代替1:1甲醇/氯仿混合物进行对氯醌的氧化导致不完全氧化，最终产出一种化合物，其中R6＝R10＝OMe，R12＝CHO，R7＝R8＝R9＝R11＝R13＝R14＝H。一个变体，R1＝Cl；R2＝(CH2)nCOOR4，n＝2；R3＝H；给出Asante NaTRIUM Green-1(ANG-1)。

[0166]

[0167] ANG-1TMA+盐，R4＝(CH3)4N+

[0168] ANG-1(AM)，R4＝CH2OCOCH3

[0169] 类似于方案7b对比方案7a，进行温和的维尔斯迈尔甲酰化作用，给出单甲酰基化合物而不是二醛，该单甲酰基化合物产生一种化合物，其中R6＝R10＝OMe，R7＝R8＝R9＝R11＝R12＝R13＝R14＝H。

[0170] 方案10示出了化合物2的合成，R6＝R10＝OMe，R12＝Me，R7＝R8＝R9＝R11＝R13＝R14＝H

[0171]

[0172]

[0173] a)Pd/C/H2b)1,2-双(2-氯乙氧基)乙烷，DIPEA，NaI c)DIPEA，NaI d)氯化二羟乙酰，吡啶，高稀释度苯e)B2H6f)DMF/POCl3g)Z＝OH，MeSO3H或Z＝NR5aR5b，丙酸h)对氯醌i)TMAOH j)AM-Br，DIPEA

[0174] 将可商购的5-甲基-2-硝基苯甲醚催化还原为苯胺，以用于与1,2-双(2-氯乙氧基)乙烷反应来形成“四分之一冠醚”。将其与邻茴香胺反应以转化为“半冠醚”，通过氯化二羟乙酰的加成将它闭合为“全冠醚”，随后进行二酰胺的还原反应。进行维尔斯迈尔甲酰化作用，给出二醛，将该二醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0175] 一个变体；R1＝Cl；R2＝(CH2)n COOR4，n＝2；R3＝R7＝R8＝R9＝R11＝R13＝R14＝H；R6＝R10＝OMe；R12＝Me；给出Asante NaTRIUM Green-2(ANG-2)。

[0176]

[0177] ANG-2TMA+盐，R4＝(CH3)4N+

[0178] ANG-2(AM)，R4＝CH2OCOCH3

[0179] 方案11示出了化合物3的合成，R15＝R16＝R17＝H，R22＝(CH2)nCH3，n＝1、2、或3。

[0180]

[0181] a)氯化二羟乙酰，吡啶，高稀释度DCM b)B2H6c)R23酰基氯(R23＝(CH2)nCH3，n＝0、1、或2)d)B2H6(R22＝(CH2)nCH3，n＝1、2、或3)e)DMF/POCl3f)Z＝OH，MeSO3H或Z＝NR5aR5b，丙酸g)对氯醌h)TMAOH i)AM-Br，DIPEA

[0182] 将1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷(生物化学(Biochemisty)19:2396-2404(1980))与氯化二羟乙酰(dyglycolyl)在高稀释度中反应以产生二酰胺，将二酰胺还原以得到苯并-环状冠醚。与烷基酰基氯在吡啶中反应以产生第二种二酰胺，并且将这些酰胺进行还原以给出N-烷基环状冠醚。进行维尔斯迈尔甲酰化作用，生成二醛，将该二醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0183] 类似于方案7b对比方案7a，进行温和的维尔斯迈尔甲酰化作用，给出单甲酰基化合物而不是二醛，该单甲酰基化合物产生化合物3，R15＝R16＝R17＝R18＝R19＝R20＝R21＝H；R22＝(CH2)nCH3，n＝1、2、或3。

[0184] 通过用1-(2-氨基-5-甲基苯氧基)、2-(2-氨基苯氧基)乙烷(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)260:3440-3450,1985)取代方案11中的1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷，进行维尔斯迈尔甲酰化作用，给出单甲酰基化合物而不是二醛，该单甲酰基化合物产生化合物3，R20＝Me，R15＝R16＝R17＝R18＝R19＝R21＝H；R22＝(CH2)nCH3，n＝1、2、或3。类似地，任何其他前体到BAPTA的变体(生物化学(Biochemisty)19:2396-2404(1980))，包括5-卤素、5,6-二氟、5-硝基，或抵抗二硼烷的还原的任何变体，将产生化合物3的变体，主要是在R20处(即，R20＝F、Br、NO2)。

[0185] 方案12示出了化合物4的合成，R15＝R16＝R17＝H。

[0186]

[0187] a)氯化二羟乙酰，吡啶，高稀释度DCM b)B2H6c)DMF/POCl3d)Z＝OH，MeSO3H或Z＝NR5aR5b，丙酸e)对氯醌f)TMAOH g)AM-Br，DIPEA

[0188] 将来自方案11的苯并环状冠醚与氯化二羟乙酰反应以形成二酰胺，将该二酰胺用二硼烷进行还原以产生[1,1,2]苯并环状穴醚。进行维尔斯迈尔甲酰化作用以产生二醛，将该二醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0189] 类似于方案7b对比方案7a，进行温和的维尔斯迈尔甲酰化作用，给出单甲酰基化合物而不是二醛，该单甲酰基化合物产生化合物4，R15＝R16＝R17＝R18＝R19＝R20＝R21＝H。

[0190] 进入方案12中，用1-(2-氨基-5-甲基苯氧基)、2-(2-氨基苯氧基)乙烷(生物化学杂志(J.Biol.Chem.)260:3440-3450,(1985))取代1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷(方案11)，最终给出单甲酰基化合物而不是二醛，该单甲酰基化合物产生化合物3，R20＝Me，R15＝R16＝R17＝R18＝R19＝R21＝H。类似地，任何其他前体到BAPTA的变体(生物化学(Biochemisty)19:2396-2404(1980))，包括5-卤素、5,6-二氟、5-硝基，或抵抗二硼烷的还原的任何变体，将产生化合物3的变体，主要是在R20处(即，R20＝F、Br、NO2)。

[0191] 用氯化三羟乙酰取代方案12中的氯化二羟乙酰，并且随后用氯化三羟乙酰改变或取代方案12中未取代的方案11中的氯化二羟乙酰，产生该荧光离子指示剂的[1,2,2]苯并环状穴醚变体。

[0192] 用于荧光钠指示剂的实例合成方案可以被修改以提供用于以下锂、钾、铷、以及铯的方案。

[0193] 锂

[0194] 荧光锂指示剂的实例基于12-冠醚-4以及[1,1,1]穴醚螯合剂。

[0195] 方案13示出了用于二氮杂-12-冠醚-4荧光指示剂的前体的合成。

[0196]

[0197] a)氯化二羟乙酰，吡啶b)B2H6

[0198] 将可商购的邻茴香胺与氯化二羟乙酰反应以给出二酰胺，将其还原为产生化合物5的“半-冠醚”，R6＝OMe；R7＝R8＝R9＝H。

[0199] 可以将该“全-冠醚”温和地进行甲酰化以给出产生化合物5的单-甲酰基前体，R6＝R10＝OMe，R7＝R8＝R9＝R11＝R12＝R13＝R14＝H。

[0200] 在方案13中，将邻茴香胺与4-甲基-o-茴香胺用氯化二羟乙酰进行反应以给出二甲基、单甲基、以及非甲基产物的统计分布。由于二甲酰基、单甲酰基/单甲基以及二甲基产物之中的极性的显著差异，这三者在甲酰化作用之后可以容易地分离。该单甲酰基/单甲基化合物最终产生化合物5，R6＝R10＝OMe，R7＝R8＝R9＝R11＝R13＝R14＝H，R12＝Me。

[0201] 方案14示出了用于二苯并环状12-冠醚-4或二苯并-[1,1,1]以及二苯并-[1,1,2]穴醚的前体的合成。

[0202]

[0203] a)1,3-二甲基-2-咪唑啉酮，K2CO3b)Pd/C/H2

[0204] 将可商购的邻硝基苯酚以及1-氯-2-硝基苯在高温下进行缩合以给出二硝基的化合物，将其催化还原为“半-冠醚”。

[0205] 钾

[0206] 荧光钾指示剂的实例基于18-冠醚-6以及[2,2,2]穴醚螯合剂。

[0207] 18-冠醚-6被15-冠醚-5取代。

[0208] 氯化三羟乙酰可以被氯化二羟乙酰取代。它合成自三甘醇到三乙醇酸的硝酸氧化以及三乙醇酸和草酰氯的反应。

[0209] 将这些变化应用于方案9，产生Asante Potassium Green(绿)-3；R1＝Cl；R2＝2 4 3 7 8 9 6
(CH )nCOOR，n＝2；R＝R＝R＝R＝H；R＝OMe：

[0210]

[0211] APG-3TMA+盐，R4＝(CH3)4N+

[0212] APG-3(AM)，R4＝CH2OCOCH3

[0213] 将这些变化应用于方案9，并且用仅在甲醇中而不是在1:1甲醇/氯仿中的对氯醌氧化产生Asante Potassium Green(绿)-1；R1＝Cl；R2＝(CH2)nCOOR4,n＝2；R6＝R10＝OMe；R12＝CHO；R3＝R7＝R8＝R9＝R11＝R13＝R14＝H

[0214]

[0215] APG-1TMA+盐，R4＝(CH3)4N+

[0216] APG-1(AM)，R4＝CH2OCOCH3

[0217] 将这些变化应用于方案10，产生Asante Potassium Green(绿)-2；R1＝Cl；R2＝2 4 3 7 8 9 11 13 14 6 10 12
(CH )n COOR ,n＝2；R＝R＝R＝R＝R ＝R ＝R ＝H；R＝R ＝OMe；R ＝Me

[0218]

[0219] APG-2TMA+盐，R4＝(CH3)4N+

[0220] APG-2(AM)，R4＝CH2OCOCH3

[0221] 铷

[0222] 荧光铷指示剂的实例基于21-冠醚-7以及[2,2,3]和[2,3,3]穴醚螯合剂。

[0223] 21-冠醚-7被15-冠醚-5取代。

[0224] 双[2-(2-氯乙氧基)乙基]醚可以被1,2-双(2-氯乙氧基)乙烷取代。

[0225] 3,6,9-三氧杂十一烷二酰基氯化物可以被氯化二羟乙酰取代。它合成自3,6,9-三氧杂十一烷二元酸以及草酰氯。

[0226] 方案15示出了用于21-冠醚-7以及[2,2,3]和[2,3,3]穴醚的前体的合成。

[0227]

[0228] a)双[2-(2-氯乙氧基)乙基]醚，NaI，K2CO3b)NaI，K2CO3

[0229] 将可商购的邻硝基苯酚与过量的双[2-(2-氯乙氧基)乙基]醚反应以形成单烷基取代的醚。不需要过量的二氯试剂，它直接形成对称的二硝基化合物(二烷基化的醚)。将该单烷基取代的醚进一步与邻硝基苯酚的一个变体(即，5-甲基-2-硝基苯酚)反应以产生该不对称的二硝基化合物。

[0230] 铯

[0231] 荧光铯指示剂的实例基于24-冠醚-8以及[3,3,3]穴醚螯合剂。

[0232] 24-冠醚-8被15-冠醚-5取代。

[0233] 双[2-(2-氯乙氧基)乙基]醚被1,2-双(2-氯乙氧基)乙烷取代。

[0234] 3,6,9-三氧杂十一烷二酰基氯化物被氯化二羟乙酰取代。它合成自3,6,9-三氧杂十一烷二元酸以及草酰氯。

[0235] 方案15给出了用于二苯并环状24-冠醚-8以及[3,3,3]穴醚的前体。

[0236] 钙

[0237] 荧光钙指示剂的实例基于如在生物化学杂志(J.Biol.Chem.)260:3440-3450,(1985)、生物化学(Biochemisty)19:2396-2404(1980)、以及US 5576433中合成的BAPTA及其衍生物。

[0238] 方案16示出了化合物6的合成。

[0239]

[0240] a)Z＝OH，MeSO3H或Z＝NR5aR5b，丙酸b)对氯醌c)1.KOH，TMAOH，或Bu4NOH 2.HCl(如果使用KOH)d)AM-Br，Na2CO3

[0241] 将BAPTA醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0242] 一个变体：R1＝Cl；R2＝(CH2)nCOOR4，n＝2；R24＝R26＝H；R25＝Me；给出Asante Calcium Green-1(ACG-1)。

[0243]

[0244] ACG-1TMA+盐，R4＝(CH3)4N+

[0245] ACG-1(AM)，R4＝CH2OCOCH3

[0246] 镁

[0247] 荧光镁指示剂的实例基于APTRA。

[0248] 方案16示出了化合物7的合成。

[0249]

[0250]

[0251] a)甲基溴乙酸酯，NaI，DIPEA b)DMF/POCl3c)Z＝OH，MeSO3H或Z＝NR5aR5b，丙酸d)对氯醌e)1.KOH 2.HCl f)AM-Br，DIPEA

[0252] 将邻氨基苯酚用甲基溴乙酸酯进行烷基化。进行维尔斯迈尔(Vilsmeir)反应以产生醛，将该醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0253] 一个变体：R1＝Cl；R2＝(CH2)nCOOR4，n＝2；给出Asante Magnesium Green-1(AMG-1)。

[0254]

[0255] AMG-1TMA+盐，R4＝(CH3)4N+

[0256] AMG-1(AM)，R4＝CH2OCOCH3

[0257] 铊

[0258] 荧光铊指示剂的实例基于半-BAPTA。

[0259] 方案17示出了化合物8的合成。

[0260]

[0261] a)甲基溴乙酸酯，NaI，DIPEA b)DMF/POCl3c)Z＝OH，MeSO3H或Z＝NR5aR5b，丙酸d)对氯醌e)1.KOH 2.HCl f)AM-Br，DIPEA

[0262] 将邻茴香胺用甲基溴乙酸酯进行烷基化。进行维尔斯迈尔(Vilsmeir)反应以产生醛，将该醛在甲磺酸或丙酸中分别与间苯二酚或氨基苯酚变体进行偶联，并且随后用对氯醌氧化以给出荧光染料。对酯进行水解，给出盐形式，并且与乙酰氧基甲基反应，给出AM酯形式。

[0263] 一个变体：R1＝Cl；R2＝(CH2)nCOOR4，n＝2；给出Asante Thallium Green-1(AMG-1)。

[0264]

[0265] ATG-1TMA+盐，R4＝(CH3)4N+

[0266] ATG-1(AM)，R4＝CH2OCOCH3

[0267] 实例1到5，方案1

[0268] 实例到，方案9

[0269]

[0270] 将邻茴香胺(362mL)连同二异丙基乙胺(233mL)以及1，2-双(2-氯乙氧基)乙烷(84mL)一起添加。将该反应在120℃搅拌持续3天。将该粗产物放置在具有油浴的旋转蒸发器上并且用高真空加热到>100℃以去除大部分过量的茴香胺。在此之后，将该残余物用乙酸乙酯稀释并且用水洗涤两次，然后用硫酸钠干燥并进行蒸发。将该粗产物在真空下蒸发，并且通过柱层析使用6:1己烷/乙酸乙酯以及逐渐增加的乙酸乙酯含量进行纯化。

[0271]

[0272] 将二甘醇酸(25g)添加到一个干燥的烧瓶中。向其中添加亚硫酰二氯(85mL)并且立即将该反应加热到回流并且在这个温度搅拌持续5小时。同时，将该过量的亚硫酰二氯在85℃以及减压下，随后在室温下通过高真空进行蒸馏直到混合物沉淀出。然后将该粗渣在
40℃、在高真空以及逐渐增高的温度下进行蒸馏直到收集全部液体。

[0273]

[0274] 将化合物103(17mmol)以及104(80mol％，用过的22mmol)分开地用苯(每个150mL)溶解于烧瓶中。经几个小时，将这些以相等的速率同时添加到含有苯(150mL)以及吡啶(46mmol)的烧瓶中。添加完成之后，将烧瓶放置于处于75℃的油浴中的烧瓶里搅拌过夜。然后将苯完全地蒸发并且将残余物溶解于二氯甲烷中。用混合有一些盐水的1M HCl、然后用碳酸氢钠并且最后用盐水洗涤两次，然后用硫酸钠进行干燥。在真空下蒸发之后，通过柱层析，加载有氯仿并且使用在氯仿中的5％甲醇以及在逐渐增加的甲醇含量下进行纯化。

[0275]

[0276] 将化合物107(6.2g)溶解于100mL THF中，并且添加6.0g硼氢化钠。经1小时，添加35mL三氟化硼-二乙基醚合物在70mL THF中的溶液。将该反应混合物倒在冰上，并且将该浆料的pH调节到中性pH。将该浆料用二氯甲烷充分地萃取，并且将这些有机物用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下蒸发。

[0277]

[0278] 将化合物108(6.5g，从前面的步骤中不经纯化地使用)溶解于100mL DMF中并且在冰浴中冷却15分钟。将31mL三氯氧磷以不超过几度地增加该反应混合物的温度的速率添加到所冷却的溶液中。一旦完成该添加，即将该反应混合物在70℃搅拌过夜。然后将该反应混合物倒在冰上，并且将pH用水性KOH调节到中性。将该水性浆料用二氯甲烷充分地萃取，并且将这些有机物用盐水洗涤，用无水硫酸镁干燥，过滤并在真空下蒸发以产生一种黄褐色的固体。将该固体用甲醇进行研磨，以给出一种灰白色固体。

[0279]

[0280] 向溶解于乙腈(30mL)中的4-甲基-o-茴香胺(6g)中添加二异丙基乙胺(15mL)、碘化钠(1.8g)、以及l,2-双(2-氯乙氧基)乙烷(14mL)。将该反应在110℃搅拌过夜。将该混合物稀释于乙酸乙酯中并且用pH2缓冲液洗涤三次并用盐水洗涤一次。将该有机层用硫酸钠干燥并且在真空下进行蒸发。将该粗产物通过柱层析使用3:1己烷/乙酸乙酯进行纯化。

[0281]

[0282] 将化合物101(10.25g)溶解于51mL乙腈中。添加二异丙基乙胺(31mL)、茴香胺(46mL)、以及碘化钠(3.1g)并且将该混合物在120℃搅拌过夜。将该混合物稀释于乙酸乙酯和盐水中并且分离这些层。将该有机层用盐水洗涤两次，用硫酸钠干燥，接着将溶剂在真空下蒸发。将该粗产物通过柱层析使用6:1己烷/乙酸乙酯以及逐渐增加的乙酸乙酯含量进行纯化。

[0283]

[0284] 在45℃，以多个小部分的方式，缓慢地将三甘醇(18mL)添加到70％HNO3(100g，d＝l.4)中，在每次添加之前等待发烟减少。然后加热到80℃搅拌1小时。在70℃、用高真空、在旋转蒸发器上蒸发2小时。添加120mL苯并且再次通过高真空在70℃进行干燥。在冷却过程中，液体不凝固。

[0285]

[0286] 装备有回流冷凝器以及干燥管，将化合物105(32.7g)溶解于氯仿(500mL)中，并且在90℃添加到油浴中。然后添加草酰氯(58mL)并且在这个温度搅拌5小时。让其冷却一些并且在旋转蒸发器上小心地蒸发，在40℃逐渐地增加真空，并且最终旋动烧瓶并且在室温高真空震荡到完全干燥。

[0287] 实例1-钠指示剂ANG-1

[0288] 图1是在517nm处激发的、用1M氯化钠溶液滴定的Asante Natrium Green(钠绿)-1(ANG-1)盐溶液(1M TMACl，10mM MOPS，pH＝7.10)的、钠滴定的荧光发射光谱。

[0289] 图7示出了加载有ANG-1(AM)的HEK293细胞表达TRPV1通道。辣椒素，一种TRPV1通道的激动剂，传导Na+和Ca2+，被用于激发Na+内流。

[0290] 图8示出了加载有ANG-1(AM)的REF52细胞以及应用Na+离子载体短杆菌肽来促进Na+内流。所获得的Na+细胞内浓度的上升导致了ANG-1荧光的相应的增加。

[0291] 图9示出了加载有ANG-1(AM)的星形细胞，示出了由于该钠泵的乌巴苷抑制引起的+Na细胞内浓度的上升导致的自该第一个框到该第二个框的荧光的增加。

[0292] 实例2-钠指示剂ANG-2

[0293] 图2是在517nm处激发的、用氯化钠溶液(1M NaCl，10mM MOPS，pH＝7.10)滴定的Asante Natrium Green(钠绿)-2(ANG-2)盐溶液(140mM TMACl，10mM MOPS，pH＝7.11)的、钠滴定的荧光发射光谱。

[0294] 图10示出了加载有ANG-2(AM)的REF52成纤维细胞以及应用所述Na+离子载体SQI-Pr来促进Na+内流。所获得的Na+细胞内浓度的上升导致了ANG-2荧光的相应的增加。20μM两性霉素B的进一步添加仅给出了微弱的荧光增加。

[0295] 图11示出了将加载有ANG-2(AM)的REF52成纤维细胞维持在145mM NMG-葡萄糖酸酯中。50μM两性霉素-B消耗Na+和K+的这些细胞。细胞内和细胞外钠浓度平衡之后，细胞外地添加增量的NaCl，致使ANG-2荧光的相应的增加。然后添加145mM K+，致使ANG-2荧光的下降。

[0296] 实例3-钠指示剂ANG-3

[0297] 图3是在517nm处激发的、用氯化钠溶液(1M NaCl，10mM MOPS，pH＝7.10)滴定的Asante Natrium Green(钠绿)-3(ANG-3)盐溶液(1M TMACl，10mM MOPS，pH＝7.12)的、钠滴定的荧光发射光谱。

[0298] 实例4-钾指示剂APG-1

[0299] 图4是在517nm处激发的、用1M氯化钾溶液滴定的Asante Potassium Green(钾绿)-1(APG-1)盐溶液(140mM TMACl，10mM MOPS，pH＝7.11)的、钾滴定的荧光发射光谱。

[0300] 图12示出了将加载有APG-1(AM)的REF52成纤维细胞维持在145mM NMG-葡萄糖酸酯中。50μM两性霉素-B消耗Na+和K+的这些细胞。细胞内和细胞外K+浓度平衡之后，细胞外地添加增量的KCl，致使APG-1荧光的相应的增加。然后添加10mM Na+，仅些微地增加APG-1荧光。

[0301] 实例5-钾指示剂APG-2

[0302] 图5是在517nm处激发的、用1M氯化钾溶液滴定的Asante Potassium Green(钾绿)-2(APG-2)盐溶液(140mM TMACl，10mM MOPS，pH＝7.11)的、钾滴定的荧光发射光谱。

[0303] 实例6-钙指示剂ACG(K+盐)

[0304] 图6是在517nm处激发的、用10mM CaEGTA滴定的ACG-1盐溶液(10mM EGTA，10mM MOPS，pH 7.2)的、钙滴定的荧光发射光谱，一旦Ca2+饱和，即示出>200X的荧光增加。

[0305] 图13示出了Asante Calcium Green(钙绿)-1和荧光黄的等吸收溶液的荧光发射光谱，致使0.495的Ca2+-边界ACG-1的量子效率。

[0306] 图14示出了将大鼠迷走神经(结状神经节)神经元经由全细胞膜片电极加载有50μM ACG-1K+盐。该神经元接收在从1-1000msec的持续范围内的、从-70到+10mV的一系列去极化步骤。将通过这些去极化步骤诱发的细胞内Ca2+信号记录为ACG-1荧光的增加，记作ΔF/F0。

[0307] 实例7-钠指示剂ANG-NM

[0308] 图15示出了在130mM TMACl、10mM MOPS、pH 7.0中，用492nm激发的Asante Natrium(钠)NM的滴定。添加1M NaCl溶液的等分部分，以给出所列出的浓度。未对增加的离子强度进行校正。

[0309] 实例8-钠指示剂ANG-TM

[0310] 图16示出了在100mM TMACl、5mM tris碱、pH 9.0中，用500nm激发的Asante Natrium(钠)TM的滴定。添加1M NaCl溶液的等分部分，以给出所列出的浓度。未对稀释或增加的离子强度进行校正。