抗-B7-H3抗体

摘要

本发明涉及对肿瘤具有治疗效果的抗体。即，本发明涉及结合B7‑H3以表现出抗肿瘤活性的抗体。本发明的一个目的是，提供对肿瘤具有治疗效果的药物。通过得到结合B7‑H3以表现出抗肿瘤活性的抗‑B7‑H3抗体，获得包含所述抗体等的、用于治疗肿瘤的药物组合物。

权利要求

1.一种抗体或抗体功能片段，其特征在于，所述抗体或抗体功能片段具有以下性能：

(a) 特异性地结合B7-H3，其中B7-H3是由SEQ ID NO: 6或10表示的氨基酸序列组成的分子；

(b) 结合IgC1和/或IgC2，所述IgC1和IgC2中的每一个是B7-H3的结构域，其中IgC1是由SEQ ID NO: 6中的氨基酸编号140-244表示的氨基酸序列组成的结构域，且IgC2是由SEQ ID NO: 6中的氨基酸编号358-456表示的氨基酸序列组成的结构域；

(c) 具有抗体依赖性的细胞介导的吞噬(ADCP)活性；和

(d) 具有体内抗肿瘤活性，

其中所述抗体或所述抗体功能片段包含CDRH1、CDRH2和CDRH3作为重链的互补性决定区且包含CDRL1、CDRL2和CDRL3作为轻链的互补性决定区，所述CDRH1由SEQ ID NO: 92表示的氨基酸序列组成，所述CDRH2由SEQ ID NO: 93表示的氨基酸序列组成，所述CDRH3由SEQ ID NO: 94表示的氨基酸序列组成，所述CDRL1由SEQ ID NO: 95表示的氨基酸序列组成，所述CDRL2由SEQ ID NO: 96表示的氨基酸序列组成，所述CDRL3由SEQ ID NO: 97表示的氨基酸序列组成。

2.根据权利要求1所述的抗体或抗体功能片段，其具有抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)活性和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)活性。

3.根据权利要求1所述的抗体或抗体功能片段，其中所述肿瘤是癌症。

4.根据权利要求3所述的抗体或抗体功能片段，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食管癌或肾癌。

5.根据权利要求1所述的抗体或抗体功能片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由SEQ ID NO: 51中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成，所述轻链可变区由SEQ ID NO: 53中的氨基酸编号23-130表示的氨基酸序列组成。

6.根据权利要求1所述的抗体或抗体功能片段，其中恒定区是人-衍生的恒定区。

7.根据权利要求6所述的抗体或抗体功能片段，其包含重链和轻链，所述重链由SEQ ID NO: 63表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 59表示的氨基酸序列组成。

8.根据权利要求1所述的抗体或抗体功能片段，其是人源化的。

9.根据权利要求8所述的抗体或抗体功能片段，其包含：重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：(a) 由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-

141表示的氨基酸序列，(b) 由SEQ ID NO: 87中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列，(c) 由SEQ ID NO: 89中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列，(d) 由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列，(e) 与序列(a)至(d)中的框架区具有至少95%或更多的同源性且与序列(a)至(d)中的互补性决定区具有100%的同源性的氨基酸序列，和(f) 在序列(a)至(d)中的任一个的框架区中缺失、取代或添加一个或几个氨基酸所形成的氨基酸序列；所述轻链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：(g) 由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(h) 由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(i) 由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(j) 由SEQ ID NO: 77中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(k) 由SEQ ID NO: 79中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(l) 由SEQ ID NO: 81中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(m) 由SEQ ID NO: 83中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(n) 与序列(g)至(m)中的框架区具有至少95%或更多的同源性且与序列(g)至(m)中的互补性决定区具有

100%的同源性的氨基酸序列，和(o) 在序列(g)至(m)中的任一个的框架区中缺失、取代或添加一个或几个氨基酸所形成的氨基酸序列。

10.根据权利要求9所述的抗体或抗体功能片段，其包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-

128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 77中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 79中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 81中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 83中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-

141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 77中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区。

11.根据权利要求9所述的抗体或抗体功能片段，其包含选自以下的重链和轻链：由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-

471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 77中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 79中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 81中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 83中的氨基酸编号

21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；和由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 77中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链。

12.根据权利要求9所述的抗体或抗体功能片段，其包含选自以下的重链和轻链：由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 75表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 77表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 79表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 81表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 83表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 75表示的氨基酸序列组成的轻链；

和由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 77表示的氨基酸序列组成的轻链。

13.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-4中的任一项所述的抗体或抗体功能片段。

14.根据权利要求13所述的多核苷酸，其包含由SEQ ID NO: 50中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 52中的核苷酸编号67-390表示的核苷酸序列。

15.根据权利要求13所述的多核苷酸，其包含由SEQ ID NO: 62表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 58表示的核苷酸序列。

16.根据权利要求13所述的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：(a) 由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列，(b) 由SEQ ID NO: 86中的核苷酸编号

58-423表示的核苷酸序列，(c) 由SEQ ID NO: 88中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列，(d) 由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列，和(e) 这样的核苷酸序列，其包含在严谨条件下与由核苷酸序列(a)至(d)中的任一个的互补核苷酸序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸；以及选自以下的核苷酸序列：(f) 由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(g) 由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(h) 由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(i) 由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(j) 由SEQ ID NO: 78中的核苷酸编号

61-384表示的核苷酸序列，(k) 由SEQ ID NO: 80中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(l) 由SEQ ID NO: 82中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，和(m) 这样的核苷酸序列，其包含在严谨条件下与由核苷酸序列(f)至(l)中的任一个的互补核苷酸序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸。

17.根据权利要求16所述的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：由SEQ ID NO: 

84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-

423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 78中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 80中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 82中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 

90中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；和由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-

423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列。

18.根据权利要求16所述的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：由SEQ ID NO: 

84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号

58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；

由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 78中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 80中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 

82中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-

699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；和由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列。

19.根据权利要求16所述的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：由SEQ ID NO: 

84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 

76表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 78表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 80表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 82表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74表示的核苷酸序列；和由SEQ ID NO: 90表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76表示的核苷酸序列。

20.一种表达载体，其包含根据权利要求13-19中的任一项所述的多核苷酸。

21.一种宿主细胞，其用根据权利要求20所述的表达载体转化。

22.根据权利要求21所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。

23.一种生产抗体或抗体功能片段的方法，其特征在于包含：培养根据权利要求21或22所述的宿主细胞的步骤，和从在所述培养步骤中得到的培养产物收集期望的抗体或抗体功能片段的步骤。

24.一种抗体或抗体功能片段，其特征在于，通过根据权利要求23所述的生产方法得到。

25.根据权利要求1-12和24中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其中调节聚糖的修饰以增强抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性。

26.一种药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1-12、24和25所述的抗体或抗体功能片段中的至少一种。

27.根据权利要求26所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤。

28.一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1-12、24和25所述的抗体或抗体功能片段中的至少一种和至少一种癌症治疗剂。

29.根据权利要求27或28所述的药物组合物，其中所述肿瘤是癌症。

30.根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食管癌或肾癌。

31.根据权利要求1-12、24或25所述的抗体或功能片段用于制备药物的用途，所述药物用于治疗肿瘤，其中所述肿瘤是癌症，并且，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食管癌或肾癌。

32.根据权利要求1-12、24或25所述的抗体或功能片段用于制备药物的用途，所述药物用于治疗肿瘤的方法中，其中所述方法包括：将所述药物和至少一种癌症治疗剂同时地、分开地或顺序地施用给个体。

说明书

抗-B7-H3抗体

技术领域

[0001] 本发明涉及结合B7-H3且可用作肿瘤的治疗剂和/或预防剂的抗体，并且也涉及使用所述抗体治疗和/或预防肿瘤的方法。

背景技术

[0002] B7-H3是一种具有单遍跨膜结构的蛋白(非专利文献1)。B7-H3的N-端细胞外结构域含有2种变体。变体1含有分别在2个位点中的每一个处的V-样和C-样Ig结构域，且变体2含有分别在1个位点处的V-样和C-样Ig结构域。B7-H3的C-端细胞内结构域含有45个氨基酸。

[0003] 已经报道了具有单遍跨膜结构的TLT-2作为B7-H3的受体(非专利文献2)。但是，也有报道认为，TLT-2不是B7-H3的受体(非专利文献3)。根据前一报道，当受体与B7-H3结合时，会增强CD8-阳性的T细胞的活化。

[0004] 临床上已经报道，B7-H3在许多癌症类型中、特别是在非小细胞肺癌、肾癌、泌尿道上皮癌、结直肠癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌和胰腺癌中过表达(非专利文献4-11)。此外，已经报道，在前列腺癌中，B7-H3的表达强度与临床病理学恶性（诸如肿瘤体积、前列腺外侵袭或Gleason评分）正相关，且也与癌症进展相关(非专利文献8)。类似地，在多形性胶质母细胞瘤中，B7-H3的表达与无事件存活负相关(非专利文献9)，且在胰腺癌中，B7-H3的表达与淋巴结转移和病理学进展相关(非专利文献11)。在卵巢癌中，B7-H3的表达与淋巴结转移和病理学进展相关。

[0005] 此外，已经报道，通过将针对B7-H3基因的siRNA引入B7-H3-阳性的癌细胞系中，会降低对纤连蛋白的粘着性，由此减少细胞迁移和基质胶侵袭(非专利文献12)。此外，已经报道，在多形性胶质母细胞瘤中，B7-H3的表达允许逃过NK细胞介导的细胞死亡(非专利文献13)。

[0006] 另一方面，已经报道，B7-H3不仅在癌细胞中表达，而且在肿瘤或周围血管中表达(非专利文献5和14)。已经报道，当B7-H3在卵巢癌血管中表达时，存活率降低。

[0007] 已经暗示，B7家族分子与免疫系统有关。已经报道，B7-H3在单核细胞、树突细胞和活化的T细胞中表达(非专利文献15)。已经报道，随着细胞毒性的T细胞被活化，B7-H3共刺激CD4-阳性的或CD8-阳性的T细胞的增殖。但是，也有报道称，B7-H3不起共刺激作用(非专利文献1)。

[0008] 已经报道，B7-H3分子与自身免疫疾病有关。已经报道，在风湿病和其它自身免疫疾病中，B7-H3在成纤维细胞-样滑膜细胞和活化的T-细胞之间的相互作用中起重要作用(非专利文献16)，并且当细胞因子从活化的巨噬细胞释放时，B7-H3作为共刺激因子起作用，因此其与脓毒症的发生有关(非专利文献17)。此外，已经报道，通过在诱导阶段将抗-B7-H3抗体施用给哮喘的小鼠模型，由于通过抗-小鼠B7-H3抗体的施用而抑制了Th2细胞介导的局部淋巴结中的细胞因子产生，会改善哮喘(非专利文献18)。

[0009] 就B7-H3而言，已经报道，针对小鼠B7-H3的抗体会增强瘤内的浸润性的CD8-阳性的T细胞和抑制肿瘤生长(非专利文献14)。此外，有专利公开称，识别B7-H3变体1的抗体会对腺癌表现出体内抗肿瘤作用(专利文献1)。

[0010] 尽管有这些研究，到目前为止尚未阐明表现出体内抗肿瘤作用的抗-B7-H3抗体的表位，并且尚未报道B7-H3的细胞外结构域的特定氨基酸序列可用作用于治疗癌症的单克隆抗体的表位。

[0011] 尽管抗体对相同的抗原是特异性的，但是抗体的性能可能由于表位或抗体序列中的差异而变化。由于抗体性能的差异，当将抗体在临床上施用给人类时，所述抗体会以下方式表现出不同的反应：药物成分的有效性、治疗应答的频率、副作用或药物抗性的发生率等。

[0012] 也关于针对B7-H3的抗体，已经强烈地需求具有空前性能的抗体的制备。

[0013] 相关领域文件

[0014] 专利文献

[0015] 专利文献1: WO 2008/066691

[0016] 非专利文献

[0017] 非专利文献1: The Journal of Immunology, 2004, 第172卷, 第2352-2359页[0018] 非专利文献2: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 第105卷, 第10495-10500页

[0019] 非专利文献3: European Journal of Immunology, 2009, 第39卷第1754-1764页

[0020] 非专利文献4: Lung Cancer, 2009, 第66卷, 第245-249页

[0021] 非专利文献5: Clinical Cancer Research, 2008, 第14卷, 第5150-5157页[0022] 非专利文献6: Clinical Cancer Research 2008, 第14卷, 第4800-4808页[0023] 非专利文献7: Cancer Immunology, Immunotherapy, 2010, 第59卷, 第1163-1171页

[0024] 非专利文献8: Cancer Research, 2007, 第67卷, 第7893-7900页

[0025] 非专利文献9: Histopathology, 2008, 第53卷, 第73-80页

[0026] 非专利文献10: Modern Pathology, 2010, 第23卷, 第1104-1112页

[0027] 非专利文献11: British Journal of Cancer, 2009, 第101卷, 第1709-1716页[0028] 非专利文献12: Current Cancer Drug Targets, 2008, 第8卷, 第404-413页[0029] 非专利文献13: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 第101卷, 第12640-12645页

[0030] 非专利文献14: Modern Pathology, 2010, 第23卷, 第1104-1112页

[0031] 非专利文献15: Nature Immunology, 2001, 第2卷, 第269-274页

[0032] 非专利文献16: The Journal of Immunology, 2008, 第180卷, 第2989-2998页[0033] 非专利文献17: The Journal of Immunology, 2010, 第185卷, 第3677-3684页[0034] 非专利文献18: The Journal of Immunology, 2008, 第181卷, 第4062-4071页。

发明内容

[0035] 本发明要解决的问题

[0036] 本发明的一个目的是，提供要用于对肿瘤具有治疗效果的药物中的抗体和所述抗体的功能片段，使用所述抗体或抗体功能片段治疗肿瘤的方法，等。

[0037] 解决问题的手段

[0038] 为了实现上述目的，本发明的发明人做了深入研究，由此他们发现了特异性地结合B7-H3以表现出抗肿瘤活性的抗体，并从而完成了本发明。即，本发明包括以下发明。

[0039] (1) 一种抗体，其特征在于，具有以下性能：

[0040] (a) 特异性地结合B7-H3；

[0041] (b) 具有抗体依赖性的细胞介导的吞噬(ADCP)活性；和

[0042] (c) 具有体内抗肿瘤活性，

[0043] 或所述抗体的功能片段。

[0044] (2) 根据上面(1)所述的抗体或抗体功能片段，其中B7-H3是包括由SEQ ID NO: 6或10表示的氨基酸序列的分子。

[0045] (3) 根据上面(1)或(2)所述的抗体或抗体功能片段，其结合IgC1和/或IgC2，所述IgC1和IgC2中的每一个是B7-H3的结构域。

[0046] (4) 根据上面(3)所述的抗体或抗体功能片段，其中IgC1是包括由SEQ ID NO: 6中的氨基酸编号140-244表示的氨基酸序列的结构域，且IgC2是包括由SEQ ID NO: 6中的氨基酸编号358-456表示的氨基酸序列的结构域。

[0047] (5) 根据上面(1)至(4)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其对M30抗体具有结合B7-H3的竞争性抑制活性。

[0048] (6) 根据上面(1)至(5)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其具有抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)活性和/或补体依赖性的细胞毒性(CDC)活性。

[0049] (7) 根据上面(1)至(6)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其中所述肿瘤是癌症。

[0050] (8) 根据上面(7)所述的抗体或抗体功能片段，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食管癌或肾癌。

[0051] (9) 根据上面(1)至(8)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其包含CDRH1、CDRH2和CDRH3作为重链的互补性决定区且包含CDRL1、CDRL2和CDRL3作为轻链的互补性决定区，所述CDRH1由SEQ ID NO: 92表示的氨基酸序列组成，所述CDRH2由SEQ ID NO: 93表示的氨基酸序列组成，所述CDRH3由SEQ ID NO: 94表示的氨基酸序列组成，所述CDRL1由SEQ ID NO: 95表示的氨基酸序列组成，所述CDRL2由SEQ ID NO: 96表示的氨基酸序列组成，所述CDRL3由SEQ ID NO: 97表示的氨基酸序列组成。

[0052] (10) 根据上面(1)至(9)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由SEQ ID NO: 51中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成所述轻链可变区由SEQ ID NO: 53中的氨基酸编号23-130表示的氨基酸序列组成。

[0053] (11) 根据上面(1)至(10)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其中恒定区是人-衍生的恒定区。

[0054] (12) 根据上面(11)所述的抗体或抗体功能片段，其包含重链和轻链，所述重链由SEQ ID NO: 63表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 59表示的氨基酸序列组成。

[0055] (13) 根据上面(1)至(12)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其是人源化的。

[0056] (14) 根据上面(13)所述的抗体或抗体功能片段，其包含：重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：(a) 由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列，(b) 由SEQ ID NO: 87中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列，(c) 由SEQ ID NO: 89中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列，(d) 由SEQ ID NO: 
91中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列，(e) 与序列(a)至(d)中的任一个具有至少
95%或更多的同源性的氨基酸序列，和(f) 在序列(a)至(d)中的任一个中缺失、取代或添加一个或几个氨基酸所形成的氨基酸序列；所述轻链可变区由选自以下的氨基酸序列组成：
(g) 由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(h) 由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(i) 由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(j) 由SEQ ID NO: 77中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(k) 由SEQ ID NO: 79中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(l) 由SEQ ID NO: 81中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(m) 由SEQ ID NO: 83中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列，(n) 与序列(g)至(m)中的任一个具有至少95%或更多的同源性的氨基酸序列，和(o) 在序列(g)至(m)中的任一个中缺失、取代或添加一个或几个氨基酸所形成的氨基酸序列。

[0057] (15) 根据上面(14)所述的抗体或抗体功能片段，其包含选自以下的重链可变区和轻链可变区：由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 77中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 79中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 81中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 83中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-
141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区；以及由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列组成的重链可变区和由SEQ ID NO: 77中的氨基酸编号21-128表示的氨基酸序列组成的轻链可变区。

[0058] (16) 根据上面(14)或(15)所述的抗体或抗体功能片段，其包含选自以下的重链和轻链：由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 
77中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 79中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 81中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 83中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-
471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 71中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 73中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 75中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链；和由SEQ ID NO: 91中的氨基酸编号20-471表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 77中的氨基酸编号21-233表示的氨基酸序列组成的轻链。

[0059] (17) 根据上面(14)至(16)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其包含选自以下的重链和轻链：由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 75表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 77表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 79表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 81表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 85表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 83表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 73表示的氨基酸序列组成的轻链；由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 75表示的氨基酸序列组成的轻链；和由SEQ ID NO: 91表示的氨基酸序列组成的重链和由SEQ ID NO: 77表示的氨基酸序列组成的轻链。

[0060] (18) 根据上面(1)至(17)中的任一项所述的抗体功能片段，其中所述功能片段选自：Fab、F(ab)2、Fab’和Fv。

[0061] (19) 一种多核苷酸，其编码根据上面(1)至(18)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段。

[0062] (20) 根据上面(19)所述的多核苷酸，其包含由SEQ ID NO: 50中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 52中的核苷酸编号67-390表示的核苷酸序列。

[0063] (21) 根据上面(19)或(20)所述的多核苷酸，其包括由SEQ ID NO: 62表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 58表示的核苷酸序列。

[0064] (22) 根据上面(19)或(20)所述的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：(a) 由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列，(b) 由SEQ ID NO: 86中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列，(c) 由SEQ ID NO: 88中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列，(d) 由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列，和(e) 这样的核苷酸序列，其包含在严谨条件下与由核苷酸序列(a)至(d)中的任一个的互补核苷酸序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸；以及选自以下的核苷酸序列：(f) 由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(g) 由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(h) 由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(i) 由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(j) 由SEQ ID NO: 78中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(k) 由SEQ ID NO: 80中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，(l) 由SEQ ID NO: 82中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列，和(m) 这样的核苷酸序列，其包含在严谨条件下与由核苷酸序列(f)至(l)中的任一个的互补核苷酸序列组成的多核苷酸杂交的多核苷酸。

[0065] (23) 根据上面(22)所述的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 78中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 80中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 
82中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-
384表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列；和由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-423表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-384表示的核苷酸序列。

[0066] (24) 根据上面(22)或(23)所述的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 78中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 80中的核苷酸编号61-
699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 82中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列；和由SEQ ID NO: 
90中的核苷酸编号58-1413表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76中的核苷酸编号61-699表示的核苷酸序列。

[0067] (25) 根据上面(22)至(24)中的任一项所述的多核苷酸，其包含选自以下的核苷酸序列：由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 78表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 80表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 84表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 82表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 70表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 
90表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 72表示的核苷酸序列；由SEQ ID NO: 90表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 74表示的核苷酸序列；和由SEQ ID NO: 90表示的核苷酸序列和由SEQ ID NO: 76表示的核苷酸序列。

[0068] (26) 一种表达载体，其包括根据上面(19)至(25)中的任一项所述的多核苷酸。

[0069] (27) 一种宿主细胞，其用根据上面(26)所述的表达载体转化。

[0070] (28) 根据上面(27)所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。

[0071] (29) 一种生产抗体或抗体功能片段的方法，其特征在于包括：培养根据上面(27)或(28)所述的宿主细胞的步骤，和从在所述培养步骤中得到的培养产物收集期望的抗体或抗体功能片段的步骤。

[0072] (30) 一种抗体或抗体功能片段，其特征在于，通过根据上面(29)所述的生产方法得到。

[0073] (31) 根据上面(30)所述的抗体功能片段，其中所述功能片段选自：Fab、F(ab)2、Fab’和Fv。

[0074] (32) 根据上面(1)至(18)、(30)和(31)中的任一项所述的抗体或抗体功能片段，其中调节聚糖的修饰以增强抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性。

[0075] (33) 一种药物组合物，其特征在于，包括根据上面(1)至(18)、和(30)至(32)所述的抗体或抗体功能片段中的至少一种。

[0076] (34) 根据上面(33)所述的药物组合物，其用于治疗肿瘤。

[0077] (35) 一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其特征在于，包括根据上面(1)至(18)、和(30)至(32)所述的抗体或抗体功能片段中的至少一种和至少一种癌症治疗剂。

[0078] (36) 根据上面(34)或(35)所述的药物组合物，其中所述肿瘤是癌症。

[0079] (37) 根据上面(36)所述的药物组合物，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食管癌或肾癌。

[0080] (38) 一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，将根据上面(1)至(18)、和(30)至(32)所述的抗体或抗体功能片段中的至少一种施用给个体。

[0081] (39) 一种治疗肿瘤的方法，其特征在于，将根据上面(1)至(18)、和(30)至(32)所述的抗体或抗体功能片段中的至少一种和至少一种癌症治疗剂同时地、分开地或顺序地施用给个体。

[0082] (40) 根据上面(38)或(39)所述的治疗方法，其中所述肿瘤是癌症。

[0083] (41) 根据上面(40)所述的治疗方法，其中所述癌症是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、黑素瘤、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、胃癌、食管癌或肾癌。

[0084] 本发明的优点

[0085] 根据本发明，可以得到针对癌症的治疗剂等，其包含这样的抗体：所述抗体结合B7-H3且具有针对癌细胞的抗肿瘤活性。

附图说明

[0086] [图1] 图1的图显示了抗-B7-H3抗体对NCI-H322细胞的ADCP活性的存在与否。图中的误差棒代表标准误差(n=3)。

[0087] [图2] 图2的图显示了商购可得的抗-B7-H3抗体对NCI-H322细胞的ADCP活性的存在与否。

[0088] [图3] 图3的图显示了M30抗体对空载体转染的293细胞和表达B7-H3的293细胞的ADCC活性的存在与否。图中的误差棒代表标准误差(n=3)。在图中，“假”表示M30对空载体转染的293细胞的ADCC活性，“B7H3”表示M30对表达B7-H3的293细胞的ADCC活性。

[0089] [图4] 图4的图显示了抗-B7-H3抗体对NCI-H322细胞的CDC活性的存在与否。图中的误差棒代表标准误差(n=3)。

[0090] [图5-1] 图5-1的图显示了M30抗体对B7-H3缺陷型突变体(B7-H3 IgV1)的反应性。虚线指示对照抗体的结合特性，实线指示M30抗体的结合特性。

[0091] [图5-2] 图5-2的图显示了M30抗体对B7-H3缺陷型突变体(B7-H3 IgC1)的反应性。虚线指示对照抗体的结合特性，实线指示M30抗体的结合特性。

[0092] [图5-3] 图5-3的图显示了M30抗体对B7-H3缺陷型突变体(B7-H3 IgV2)的反应性。虚线指示对照抗体的结合特性，实线指示M30抗体的结合特性。

[0093] [图5-4] 图5-4的图显示了M30抗体对B7-H3缺陷型突变体(B7-H3 IgC2)的反应性。虚线指示对照抗体的结合特性，实线指示M30抗体的结合特性。

[0094] [图5-5] 图5-5的图显示了M30抗体对B7-H3缺陷型突变体(B7-H3 IgC1-V2-C2)的反应性。虚线指示对照抗体的结合特性，实线指示M30抗体的结合特性。

[0095] [图5-6] 图5-6的图显示了M30抗体对B7-H3缺陷型突变体(B7-H3 IgV2-C2)的反应性。虚线指示对照抗体的结合特性，实线指示M30抗体的结合特性。

[0096] [图6] 图6的图显示了抗-B7-H3抗体对植入了NCI-H322细胞的小鼠的抗肿瘤活性。图中的误差棒代表标准误差(n=10)。

[0097] [图7] 图7的图显示了当在体内除去巨噬细胞时，M30抗体的抗肿瘤活性。图中的误差棒代表标准误差(n=8)。此外，“mm^3”表示“mm3”。

[0098] [图8] 图8的图显示了M30抗体和cM30抗体对NCI-H322细胞的ADCP活性。图中的误差棒代表标准误差(n=4)。

[0099] [图9] 图9的图显示了M30抗体和cM30抗体对植入了MDA-MB-231细胞的小鼠的抗肿瘤活性。图中的误差棒代表标准误差(n=9)。

[0100] [图10-1] 图10-1的图显示了就与B7-H3变体1抗原的细胞外结构域多肽抗原的结合而言，cM30抗体和M30-H1-L4抗体相对于M30的竞争性抑制活性。图中的误差棒代表标准误差(n=3)。

[0101] [图10-2] 图10-2的图显示了就与B7-H3变体2抗原的细胞外结构域多肽抗原的结合而言，cM30抗体和M30-H1-L4抗体相对于M30的竞争性抑制活性。图中的误差棒代表标准误差(n=3)。

[0102] [图11] 图11的图显示了M30抗体、cM30抗体和M30-H1-L4抗体对NCI-H322细胞的ADCP活性。图中的误差棒代表标准误差(n=4)。

[0103] [图12] 图12的图显示了cM30抗体和M30-H1-L4抗体对NCI-H322细胞的ADCC活性。图中的误差棒代表标准误差(n=3)。

[0104] [图13-1] 图13-1显示了B7-H3变体1的核苷酸序列(SEQ ID NO: 5)。

[0105] [图13-2] 图13-2显示了B7-H3变体1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 6)。

[0106] [图14-1] 图14-1显示了B7-H3变体2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 9)。

[0107] [图14-2] 图14-2显示了B7-H3变体2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 10)。

[0108] [图15-1] 图15-1显示了B7-H3 IgV1的核苷酸序列(SEQ ID NO: 20)。

[0109] [图15-2] 图15-2显示了B7-H3 IgV1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 21)。

[0110] [图16-1] 图16-1显示了B7-H3 IgC1的核苷酸序列(SEQ ID NO: 22)。

[0111] [图16-2] 图16-2显示了B7-H3 IgC1的氨基酸序列(SEQ ID NO: 23)。

[0112] [图17-1] 图17-1显示了B7-H3 IgV2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 24)。

[0113] [图17-2] 图17-2显示了B7-H3 IgV2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 25)。

[0114] [图18-1] 图18-1显示了B7-H3 IgC2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 26)。

[0115] [图18-2] 图18-2显示了B7-H3 IgC2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 27)。

[0116] [图19-1] 图19-1显示了B7-H3 IgC1-V2-C2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 28)。

[0117] [图19-2] 图19-2显示了B7-H3 IgC1-V2-C2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 29)。

[0118] [图20-1] 图20-1显示了B7-H3 IgV2-C2的核苷酸序列(SEQ ID NO: 30)。

[0119] [图20-2] 图20-2显示了B7-H3 IgV2-C2的氨基酸序列(SEQ ID NO: 31)。

[0120] [图21-1] 图21-1显示了M30抗体重链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 50)。

[0121] [图21-2] 图21-2显示了M30抗体重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 51)。

[0122] [图22-1] 图22-1显示了M30抗体轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 52)。

[0123] [图22-2] 图22-2显示了M30抗体轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 53)。

[0124] [图23] 图23显示了人κ链分泌信号、人κ链恒定区和人聚腺苷酸额外信号的核苷酸序列(SEQ ID NO: 56)。

[0125] [图24] 图24显示了人IgG1的信号序列和恒定区的核苷酸序列(SEQ ID 57)。

[0126] [图25-1] 图25-1显示了M30抗体嵌合体-型轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 58)。

[0127] [图25-2] 图25-2显示了M30抗体嵌合体-型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 59)。

[0128] [图26-1] 图26-1显示了M30抗体嵌合体-型重链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 62)。

[0129] [图26-2] 图26-2显示了M30抗体嵌合体-型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 63)。

[0130] [图27-1] 图27-1显示了M30-L1-型轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 70)。

[0131] [图27-2] 图27-2显示了M30-L1-型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 71)。

[0132] [图28-1] 图28-1显示了M30-L2-型轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 72)。

[0133] [图28-2] 图28-2显示了M30-L2-型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 73)。

[0134] [图29-1] 图29-1显示了M30-L3-型轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 74)。

[0135] [图29-2] 图29-2显示了M30-L3-型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 75)。

[0136] [图30-1] 图30-1显示了M30-L4-型轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 76)。

[0137] [图30-2] 图30-2显示了M30-L4-型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 77)。

[0138] [图31-1] 图31-1显示了M30-L5-型轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 78)。

[0139] [图31-2] 图31-2显示了M30-L5-型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 79)。

[0140] [图32-1] 图32-1显示了M30-L6-型轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 80)。

[0141] [图32-2] 图32-2显示了M30-L6-型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 81)。

[0142] [图33-1] 图33-1显示了M30-L7-型轻链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 82)。

[0143] [图33-2] 图33-2显示了M30-L7-型轻链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 83)。

[0144] [图34-1] 图34-1显示了M30-H1-型重链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 84)。

[0145] [图34-2] 图34-2显示了M30-H1-型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 85)。

[0146] [图35-1] 图35-1显示了M30-H2-型重链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 86)。

[0147] [图35-2] 图35-2显示了M30-H2-型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 87)。

[0148] [图36-1] 图36-1显示了M30-H3-型重链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 88)。

[0149] [图36-2] 图36-2显示了M30-H3-型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 89)。

[0150] [图37-1] 图37-1显示了M30-H4-型重链的核苷酸序列(SEQ ID NO: 90)。

[0151] [图37-2] 图37-2显示了M30-H4-型重链的氨基酸序列(SEQ ID NO: 91)。

[0152] [图38] 图38的图显示了人源化的M30 (M30-H1-L4) 抗体对植入了MDA-MB-231细胞的小鼠的抗肿瘤活性。图中的误差棒代表标准误差(n=6)。

具体实施方式

[0153] 本文中使用的术语“癌症”和“肿瘤”以相同的含义使用。

[0154] 本文中使用的术语“基因”不仅包括DNA，而且包括其mRNA、其cDNA和其cRNA。

[0155] 本文中使用的术语“多核苷酸”以与核酸相同的含义使用，并且还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸和引物。

[0156] 本文中使用的术语“多肽”和“蛋白”无区别地使用。

[0157] 本文中使用的术语“细胞”也包括动物个体内的细胞和培养的细胞。

[0158] 本文中使用的术语“B7-H3”以与B7-H3蛋白相同的含义使用，并且还表示B7-H3变体1和/或B7-H3变体2。

[0159] 本文中使用的术语“细胞损伤”表示其中以某种形式造成细胞的病理学变化的状态，并且细胞损伤不限于直接损伤，包括对细胞的结构和功能的所有种类的损伤，诸如DNA裂解、碱基-二聚体形成、染色体裂解、对细胞分裂机制的损伤和不同酶促活性的下降。

[0160] 本文中使用的术语“细胞毒性活性”表示造成上述细胞损伤的活性。

[0161] 本文中使用的术语“抗体依赖性的细胞介导的吞噬活性”表示“抗体依赖性的细胞吞噬(ADCP)活性”，且是指由抗体介导的单核细胞或巨噬细胞吞噬靶细胞（诸如肿瘤细胞）的活性。该术语也称为“抗体依赖性的吞噬活性”。

[0162] 本文中使用的术语“抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性”表示“抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)活性”，且是指由抗体介导的NK细胞损害靶细胞（诸如肿瘤细胞）的活性。

[0163] 本文中使用的术语“补体依赖性的细胞毒性活性”表示“补体依赖性的细胞毒性(CDC)活性”，且是指由抗体介导的补体损害靶细胞（诸如肿瘤细胞）的活性。

[0164] 本文中使用的术语“抗体功能片段”表示抗体的具有抗原结合活性的部分片段，其中所述片段具有抗体的完全或部分功能，包括Fab、F(ab’)2、scFv等。该术语也包括Fab’，其为在还原条件下处理F(ab’)2得到的抗体的可变区的单价片段。但是，该术语不限于这些分子，只要所述片段具有与抗原的结合亲和力即可。此外，这些功能片段不仅包括用适当的酶处理抗体蛋白的全长分子得到的片段，而且包括使用遗传修饰的抗体基因在适当宿主细胞中生产的蛋白。

[0165] 本文中使用的术语“Fab’”表示如上所述在还原条件下处理F(ab’)2得到的抗体的可变区的单价片段。但是，本发明的Fab’也包括使用遗传修饰的抗体基因生产的Fab’。

[0166] 本文中使用的术语“表位”表示特定抗-B7-H3抗体所结合的B7-H3的部分肽或部分三级结构。通过本领域技术人员众所周知的方法诸如免疫测定，可以确定作为上述B7-H3的部分肽的表位，并且例如，可以采用下述方法。首先，制备抗原的不同部分结构。在制备部分结构时，可以使用已知的寡肽合成技术。例如，使用本领域技术人员已知的基因重组技术，制备从B7-H3的C末端或N末端顺次缩短所得到的具有适当缩短长度的一系列多肽。此后，检测抗体对这些多肽的反应性，并大致确定识别位点。然后，合成具有更短长度的肽，并检测抗体与这些肽的反应性，由此可确定表位。此外，通过X-射线结构分析描述抗原的邻近抗体的氨基酸残基，可以确定作为抗原的部分三级结构的表位（特定抗体与其结合）。

[0167] 本文中使用的短语“结合相同表位的抗体”表示，结合共同表位的不同抗体。如果第二抗体结合第一抗体所结合的部分肽或部分三级结构，那么可以确定，所述第一抗体和所述第二抗体结合相同表位。此外，通过证实第二抗体与第一抗体竞争结合抗原(即，第二抗体会抑制第一抗体和抗原之间的结合)，可以确定，所述第一抗体和所述第二抗体结合相同表位，即使尚未确定具体表位序列或结构。此外，当第一抗体和第二抗体结合相同表位并且第一抗体还具有特殊活性（诸如抗肿瘤活性）时，可以预期，所述第二抗体也具有相同活性。因此，当第二抗-B7-H3抗体结合第一抗-B7-H3抗体所结合的部分肽时，可以确定，所述第一抗体和所述第二抗体结合B7-H3的相同表位。此外，通过证实第二抗-B7-H3抗体与第一抗-B7-H3抗体竞争结合B7-H3，可以确定，所述第一抗体和所述第二抗体是结合B7-H3的相同表位的抗体。

[0168] 本文中使用的术语“CDR”表示互补性决定区(CDR)，且已知抗体分子的每个重链和轻链具有3个互补性决定区(CDR)。CDR也称作高变区，且存在于抗体的每个重链和轻链的可变区中。它是在它的一级结构中具有非常高的变异性的位点，且在每个重和轻多肽链的一级结构中存在3个单独的CDR。在本说明书中，关于抗体的CDR，重链的CDR由来自重链氨基酸序列的氨基端侧的CDRH1、CDRH2和CDRH3表示，轻链的CDR由来自轻链氨基酸序列的氨基端侧的CDRL1、CDRL2和CDRL3表示。这些位点在三级结构中彼此邻近，并决定抗体所结合的抗原的特异性。

[0169] 本文中使用的短语“在严谨条件下进行杂交”表示这样的过程，其中如下在可实现鉴定的条件下进行杂交：在商购可得的杂交溶液ExpressHyb杂交溶液（由Clontech, Inc.制造）中在68℃进行杂交，或者使用其上固定有DNA的滤器，在有0.7-1.0 M NaCl存在下，在68℃进行杂交，然后使用0.1-2 x SSC溶液（1 x SSC溶液由150 mM NaCl和15 mM柠檬酸钠组成）在68℃进行洗涤，或在与其等同的条件下洗涤。

[0170] 1. B7-H3

[0171] B7-H3是作为共刺激分子在抗原呈递细胞上表达的B7家族的一个成员，并且被认为作用于T细胞上的受体以增强或抑制免疫活性。

[0172] B7-H3是一种具有单遍跨膜结构的蛋白，并且B7-H3的N-端细胞外结构域含有2种变体。B7-H3变体1 (4Ig-B7-H3)含有分别在2个位点处的V-样或C-样Ig结构域，且B7-H3变体2 (2Ig-B7-H3)含有分别在1个位点处的V-样或C-样Ig结构域。

[0173] 关于要在本发明中使用的B7-H3，可以从人或非人哺乳动物(诸如大鼠或小鼠)的表达B7-H3的细胞直接纯化和使用B7-H3，或者可以制备和使用上述细胞的细胞膜级分。此外，通过其体外合成或通过基因工程在宿主细胞中进行其生产，可以得到B7-H3。具体地，在这样的基因工程中，在将B7-H3 cDNA整合进能够表达B7-H3 cDNA的载体中以后，可以如下得到B7-H3：在含有转录和翻译所需的酶、底物和能量物质的溶液中合成它，或者在其它转化的原核或真核宿主细胞中表达B7-H3。

[0174] 人B7-H3变体1基因的开放读码框(ORF)的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 5表示，其氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 6表示。此外，SEQ ID NO: 5和6的序列显示在图13中。

[0175] 人B7-H3变体2基因的ORF的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 9表示，其氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 10表示。此外，SEQ ID NO: 9和10的序列显示在图14中。

[0176] 此外，B7-H3也包括这样的蛋白：其由在任一个上述B7-H3氨基酸序列中取代、缺失和/或添加一个或几个氨基酸所形成的氨基酸序列组成，且也具有与所述蛋白等效的生物活性。

[0177] 已经除去信号序列的成熟人B7-H3变体1对应于由SEQ ID NO: 6.表示的氨基酸序列的氨基酸残基27-534所组成的氨基酸序列。此外，已经除去信号序列的成熟人B7-H3变体2对应于由SEQ ID NO: 10表示的氨基酸序列的氨基酸残基27-316所组成的氨基酸序列。

[0178] 在B7-H3变体1中，各个结构域从N端以IgV1、IgC1、IgV2和IgC2的次序存在，且在序列表中的SEQ ID NO: 6中，IgV1对应于氨基酸编号27-139，IgC1对应于氨基酸编号140-244，IgV2对应于氨基酸编号245-357，且IgC2对应于氨基酸编号358-456。此外，在B7-H3变体2中，各个结构域从N端以IgV1和IgC2的次序存在，且在序列表中的SEQ ID NO: 10中，IgV1对应于氨基酸编号27-140，且IgC2对应于氨基酸编号141-243。

[0179] 可以如下得到B7-H3 cDNA：例如，通过所谓的PCR方法，其中使用表达B7-H3 cDNA的cDNA文库作为模板，并使用特异性扩增B7-H3 cDNA的引物，进行聚合酶链式反应(在下文中称作“PCR”)(Saiki, R. K., 等人, Science, (1988) 239, 487-49)。此外，B7-H3 cDNA也包括这样的多核苷酸：其在严谨条件下与由序列表中的SEQ ID NO: 5或9表示的核苷酸序列的互补核苷酸序列所组成的多核苷酸杂交，并且编码具有与B7-H3等效的生物活性的蛋白。此外，B7-H3 cDNA也包括这样的多核苷酸：其为从人或小鼠B7-H3基因座转录的剪接变体，或者在严谨条件下与由其互补核苷酸序列组成的多核苷酸杂交且编码具有与B7-H3等效的生物活性的蛋白。

[0180] 此外，B7-H3也包括这样的蛋白：其由在序列表中的SEQ ID NO: 6或10表示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸所形成的氨基酸序列组成，或由通过从这些序列中的任一个除去信号序列所得到的氨基酸序列组成，且具有与B7-H3等效的生物活性。此外，B7-H3也包括这样的蛋白：其由从人或小鼠B7-H3基因座转录的剪接变体编码的氨基酸序列组成，或在上述氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸所形成的氨基酸序列，且具有与B7-H3等效的生物活性。

[0181] 2. 抗-B7-H3抗体的制备

[0182] 可以如下获得本发明的抗B7-H3的抗体：根据常规的方法，用B7-H3或选自B7-H3的氨基酸序列的任意多肽免疫动物，并收集和纯化体内产生的抗体。用作抗原的B7-H3的生物物种不限于人，并且可以用从诸如小鼠或大鼠等除人以外的动物衍生出的B7-H3免疫动物。在这种情况下，通过测试抗体与得到的异源B7-H3和人B7-H3的结合之间的交叉反应性，可以选择可适用于人疾病的抗体。

[0183] 此外，根据已知的方法（例如，Kohler和Milstein, Nature, (1975) 256, 第495-497页；Kennet,R.编,Monoclonal Antibody, 第365-367页, Prenum Press,N.Y（.1980）），通过使生产抗B7-H3抗体的抗体生产细胞与骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤，可以得到单克隆抗体。

[0184] 此外，可以如下得到要用作抗原的B7-H3：通过基因工程，在宿主细胞中表达B7-H3基因。

[0185] 具体而言，制备能表达B7-H3基因的载体，将得到的载体转染进宿主细胞中以表达所述基因，然后纯化表达的B7-H3。在下文中具体描述了获得抗B7-H3抗体的方法。

[0186] （1）抗原的制备

[0187] 要用于制备抗-B7-H3抗体的抗原的例子包括：B7-H3，由含有B7-H3的至少6个连续氨基酸的部分氨基酸序列组成的多肽，以及通过向其附加给定的氨基酸序列或载体而得到的衍生物。

[0188] 可从人肿瘤组织或肿瘤细胞直接纯化和使用B7-H3。此外，通过体外合成或通过基因工程在宿主细胞中生产B7-H3，可以得到B7-H3。

[0189] 关于这样的基因工程，具体地，将B7-H3 cDNA整合到能表达B7-H3 cDNA的载体中以后，可以如下得到B7-H3：通过在含有转录和翻译所需的酶、底物和能量物质的溶液中合成它，或者在其它转化的原核或真核宿主细胞中表达B7-H3。

[0190] 此外，通过在适当的宿主-载体系统中表达融合蛋白，所述融合蛋白通过将作为膜蛋白的B7-H3的细胞外结构域连接到抗体的恒定区上而得到，也可以得到作为分泌蛋白的抗原。

[0191] 可以如下得到B7-H3 cDNA：例如，通过所谓的PCR方法，其中使用表达B7-H3 cDNA的cDNA文库作为模板，并使用特异性扩增B7-H3 cDNA的引物，进行聚合酶链式反应(在下文中称作“PCR”) (参见Saiki, R. K., 等人, Science, (1988) 239, 第487-489页)。

[0192] 作为用于体外合成多肽的系统，例如可以例举由Roche Diagnostics, Inc.制造的快速翻译系统（RTS），但不限于此。

[0193] 原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。为了用靶基因转化宿主细胞，使用含有复制子（即源自与所述宿主相容的物种的复制起点）和调节序列的质粒载体转化宿主细胞。此外，所述载体优选具有能给转化的细胞赋予表型选择性的序列。

[0194] 真核宿主细胞的例子包括脊椎动物细胞、昆虫细胞和酵母细胞。作为脊椎动物细胞，经常使用例如猿猴COS细胞(Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, 第175-182页, ATCC CRL-1650)、鼠成纤维细胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞; ATCC: CCL-61)的二氢叶酸还原酶-缺陷株(Urlaub, G.和Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 第4126-4220页) 等，但是所述细胞不限于此。

[0195] 根据常规方法，可以培养这样得到的转化体，并通过培养该转化体，在细胞内或在细胞外生产靶多肽。

[0196] 根据使用的宿主细胞，可以从各种常用的培养基中选择培养所用的合适培养基。如果使用大肠杆菌，则可以使用例如根据需要在其中添加抗生素（诸如氨苄西林或IPMG）的LB培养基。

[0197] 通过多种已知的分离方法中的任一种，利用蛋白的物理性质或化学性质，可以分离和纯化通过这种培养由转化体在细胞内或在细胞外生产的重组蛋白。

[0198] 所述方法的具体例子包括：使用常规的蛋白沉淀剂进行处理、超滤、诸如分子筛色谱法（凝胶过滤）、吸附色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法等不同类型的液相色谱法、透析法、以及它们的组合。

[0199] 此外，通过将6组氨酸残基标签连接到要表达的重组蛋白上，可以使用镍亲和柱有效地纯化蛋白。或者，通过将IgG Fc区连接到要表达的重组蛋白上，可以使用蛋白A柱有效地纯化蛋白。

[0200] 通过组合上述方法，可以高产率、高纯度地容易地制备大量靶多肽。

[0201] （2）抗-B7-H3单克隆抗体的制备

[0202] 特异性地结合B7-H3的抗体的例子包括特异性地结合B7-H3的单克隆抗体，获得该抗体的方法如下所述。

[0203] 单克隆抗体的制备一般需要下述操作步骤：

[0204] （a）纯化要用作抗原的生物聚合物；

[0205] （b）如下制备抗体生产细胞：通过注射抗原来免疫动物，收集血液，测定其抗体滴度，以确定脾摘除时间；

[0206] （c）制备骨髓瘤细胞(在下文中称作“骨髓瘤”)；

[0207] （d）将抗体生产细胞和骨髓瘤融合；

[0208] （e）筛选生产期望抗体的杂交瘤群；

[0209] （f）将杂交瘤分成单细胞克隆（克隆化）；

[0210] （g）任选地，培养杂交瘤，或培育植入了杂交瘤的动物，以制备大量单克隆抗体；

[0211] （h）检测如此制备的单克隆抗体的生物活性和结合特异性，或者测定所述抗体作为标记的抗体试剂的性质等。

[0212] 在下文中，按照上述步骤对单克隆抗体的制备方法进行详述，但是所述方法不限于此，例如，可以使用除了脾细胞和骨髓瘤以外的抗体生产细胞。

[0213] （a）抗原的纯化

[0214] 可以使用按照上述方法制备的B7-H3或其部分肽作为抗原。

[0215] 此外，由表达B7-H3的重组细胞制备的膜级分、或表达B7-H3的重组细胞本身、以及通过本领城技术人员已知的方法化学合成的本发明蛋白的部分肽，也可以用作抗原。

[0216] （b）抗体生产细胞的制备

[0217] 将在步骤（a）中得到的抗原与佐剂（如弗氏完全或不完全佐剂、或硫酸钾铝）混合，将得到的混合物用作免疫原，免疫实验动物。在已知的杂交瘤制备方法中所使用的任何动物，可以无困难地用作实验动物。具体而言，例如，可以使用小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马等。但是，从容易获得与提取的抗体生产细胞融合的骨髓瘤细胞的角度考虑，优选使用小鼠或大鼠作为被免疫的动物。

[0218] 此外，要使用的小鼠和大鼠的品系没有特别限制，在小鼠的情况下，可以使用诸如A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB和129等不同的品系，在大鼠的情况下，可以使用例如Wistar、Low、Lewis、Sprague Dawley、ACI、BN、Fischer等。

[0219] 这些小鼠和大鼠可从实验动物培育商/分销商购得，例如，CLEA Japan, Inc.和Charles River Laboratories Japan, Inc。

[0220] 在它们中，考虑到与下述的骨髓瘤细胞的融合相容性，特别优选地作为被免疫的动物的是：在小鼠的情况下，BALB/c品系；在小鼠的情况下，Wistar和Low品系。

[0221] 此外，考虑到人和小鼠之间的抗原同源性，还优选使用具有降低的生物功能（以除去自身抗体）的小鼠，即具有自身免疫疾病的小鼠。

[0222] 这样的小鼠或大鼠在免疫时的年龄优选为5-12周龄，更优选6-8周龄。

[0223] 为了使用B7-H3或其重组体免疫动物，可以使用例如在下述文献中详述的已知方法：例如，Weir, D.M., Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A.和Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964)等。

[0224] 在这些免疫方法中，本发明优选的具体方法例如如下所述。

[0225] 即，首先，将作为抗原的膜蛋白级分或被造成表达抗原的细胞真皮内地或腹膜内地施用给动物。

[0226] 但是，为提高免疫效率，优选两种施用途径的组合，如果在前半阶段进行真皮内施用，则在后半阶段或只在最后一次给药时进行腹膜内施用，可以特别提高免疫效率。

[0227] 抗原的施用计划随被免疫动物的种类、个体差异等而异。但是，一般而言，优选的施用计划是这样的：其中施用抗原的次数是3-6次，且给药间隔是2-6周；更优选的施用计划是这样的：其中施用抗原的次数是3-4次，且给药间隔是2-4周。

[0228] 此外，抗原剂量随动物的种类、个体差异等而异。但是，剂量通常设定为0.05-5 mg，优选约0.1-0.5 mg。

[0229] 在如上所述施用抗原后1-6周、优选2-4周、更优选2-3周，进行加强免疫。

[0230] 在进行加强免疫时抗原的剂量随动物的种类或大小等而异。但是，在例如小鼠的情况下，剂量通常设定为0.05-5 mg，优选0.1-0.5 mg，更优选约0.1-0.2 mg。

[0231] 加强免疫后1-10天、优选2-5天、更优选2-3天，从被免疫的动物无菌摘取包含抗体生产细胞的脾细胞或淋巴细胞。此时，测定抗体滴度，如果将抗体滴度足够升高的动物作为抗体生产细胞供给源，可以更有效地进行后续操作。

[0232] 这里采用的测定抗体滴度的方法的例子包括RIA法和ELISA法，但所述方法不限于此。

[0233] 例如，如果使用ELISA法，则可以根据如下所述的方法测定本发明中的抗体滴度。

[0234] 首先，将纯化的或部分纯化的抗原吸附于固相（诸如用于ELISA的96孔板）的表面，再用与抗原无关的蛋白（诸如牛血清白蛋白(在下文中称作“BSA”)）覆盖未吸附抗原的固相表面。洗涤表面后，使表面接触作为第一抗体的系列稀释的样品（例如小鼠血清），使样品中的抗体结合抗原。

[0235] 再加入作为第二抗体的用酶标记的针对小鼠抗体的抗体，使之结合小鼠抗体。洗涤后，加入该酶的底物，测量吸光度的变化（其因底物降解等诱导的显色而发生），并基于测量结果，计算抗体滴度。

[0236] 根据已知的方法(例如，Kohler等人, Nature (1975), 256, 第495页; Kohler等人, Eur. J. Immunol. (1977), 6, 第511页; Milstein等人, Nature (1977), 266, 第550页; Walsh, Nature (1977), 266, 第495页)，可以从免疫动物的脾细胞或淋巴细胞分离抗体生产细胞。例如，在脾细胞的情况下，可以采用常规方法，其中通过将脾匀浆化，用不锈钢网过滤，得到细胞，然后使细胞悬浮于Eagle氏最低基础培养基(MEM)中，从而分离抗体生产细胞。

[0237] （c）骨髓瘤细胞(在下文中称作“骨髓瘤”)的制备

[0238] 细胞融合所使用的骨髓瘤细胞没有特别限制，可从已知的细胞系中选择适合的细胞。但是，基于从融合的细胞中选择杂交瘤时的便利性考虑，优选使用其选择方法已经得到确立的HGPRT (次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶) 缺陷株。

[0239] 更具体地，这样的HGPRT-缺陷株的例子包括：源自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-
45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO和BU.1；源自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)；和源自人的U266AR(SKO-007)、GM1500·GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)和
8226AR/NIP4-1(NP41)。这些HGPRT-缺陷株可从例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)等得到。

[0240] 在诸如8-氮杂鸟嘌呤培养基[通过将8-氮杂鸟嘌呤加入添加了谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素和胎牛血清(在下文中称作“FBS”)的RPMI-1640培养基中所得到的培养基]、Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基（在下文中称作“IMDM”）、或Dulbecco氏改良的伊格尔培养基（在下文中称作“DMEM”）等适当的培养基中，继代培养这些细胞株。在该情况下，在进行细胞融合之前3-4天，在正常培养基[例如含有10% FBS的ASF104培养基（Ajinomoto Co., Ltd.制造]中继代培养细胞，以保证在细胞融合当天不少于2×107的细胞。

[0241] （d）细胞融合

[0242] 根据已知的方法(Weir, D.M.Handbook of Experimental Immunology Vol.I.II.III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E.A.和Mayer, M.M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), 等)，在不使细胞存活率过度降低的条件下，可以适当地进行抗体生产细胞与骨髓瘤细胞之间的融合。

[0243] 作为这样的方法，例如，可以使用：在含有高浓度的诸如聚乙二醇等聚合物的溶液中，将抗体生产细胞和骨髓瘤细胞混合的化学方法；利用电刺激的物理方法，等。在这些方法中，化学方法的具体例子如下所述。

[0244] 即，在将聚乙二醇用于含有高浓度聚合物的溶液中的情况下，在分子量为1500-6000、更优选2000-4000的聚乙二醇溶液中，在30-40℃、优选35-38℃的温度，使抗体生产细胞和骨髓瘤细胞混合1-10分钟、优选5-8分钟。

[0245] （e）杂交瘤群的选择

[0246] 选择通过上述细胞融合得到的杂交瘤的方法没有特别限制。通常，采用HAT (次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)选择方法(Kohler等人, Nature (1975), 256, 第495页; Milstein等人, Nature (1977), 266, 第550页)。

[0247] 当使用在氨基蝶呤存在下无法存活的HGPRT-缺陷株的骨髓瘤细胞获得杂交瘤时，该方法是有效的。

[0248] 即，通过在HAT培养基中培养未融合的细胞和杂交瘤，选择性地仅容许对氨基蝶呤有抗性的杂交瘤存活并增殖。

[0249] （f）分成单细胞克隆（克隆化）

[0250] 作为杂交瘤的克隆方法，可以使用已知的方法，例如甲基纤维素法、软琼脂糖法、或有限稀释法等(参见，例如，Barbara, B.M.和Stanley, M.S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W.H.Freeman和Company, San Francisco (1980))。在这些方法中，特别地优选三维培养方法诸如甲基纤维素方法。例如，将通过细胞融合产生的杂交瘤群悬浮于甲基纤维素培养基诸如ClonaCell-HY选择培养基D (StemCell Technologies, inc., #03804制造)中，并培养。然后，收集形成的杂交瘤菌落，由此可以得到单克隆杂交瘤。培养收集的各个杂交瘤菌落，并选择已经被证实在得到的杂交瘤培养物上清液中具有稳定抗体滴度的杂交瘤作为生产B7-H3单克隆抗体的杂交瘤株。

[0251] 如此建立的杂交瘤株的例子包括B7-H3杂交瘤M30。此外，在本说明书中，由B7-H3杂交瘤M30生产的抗体被称作“M30抗体”或简称为“M30”。

[0252] M30抗体的重链具有序列表中的SEQ ID NO: 51表示的氨基酸序列。此外，M30抗体的轻链具有序列表中的SEQ ID NO: 53表示的氨基酸序列。此外，在由序列表中的SEQ ID NO: 51表示的重链氨基酸序列中，由氨基酸残基1-19组成的氨基酸序列是信号序列，由氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列是可变区，且由氨基酸残基142-471组成的氨基酸序列是恒定区。此外，在由序列表中的SEQ ID NO: 53表示的轻链氨基酸序列中，由氨基酸残基1-22组成的氨基酸序列是信号序列，由氨基酸残基23-130组成的氨基酸序列是可变区，且由氨基酸残基131-235组成的氨基酸序列是恒定区。

[0253] 序列表中的SEQ ID NO: 51所表示的重链氨基酸序列是由序列表中的SEQ ID NO: 50所表示的核苷酸序列编码。在由序列表中的SEQ ID NO: 50所表示的核苷酸序列中，由核苷酸1-57组成的核苷酸序列编码所述抗体的重链信号序列，由核苷酸58-423组成的核苷酸序列编码所述抗体的重链可变区，且由核苷酸424-1413组成的核苷酸序列编码所述抗体的重链恒定区。

[0254] 序列表中的SEQ ID NO: 53所表示的轻链氨基酸序列是由序列表中的SEQ ID NO: 52所表示的核苷酸序列编码。在由序列表中的SEQ ID NO: 52所表示的核苷酸序列中，由核苷酸1-66组成的核苷酸序列编码所述抗体的轻链信号序列，由核苷酸67-390组成的核苷酸序列编码所述抗体的轻链可变区，且由核苷酸391-705组成的核苷酸序列编码所述抗体的轻链恒定区。

[0255] （g）通过培养杂交瘤制备单克隆抗体

[0256] 通过培养这样选择的杂交瘤，可以有效地获得单克隆抗体。但是，在培养之前，优选地对生产目标单克隆抗体的杂交瘤进行筛选。

[0257] 在这样的筛选中，可采用已知的方法。

[0258] 通过例如在上述（b）项中解释的ELISA法，可以测量本发明的抗体滴度。

[0259] 在液氮中或在-80℃或以下的冷冻箱中，可以以冷冻状态保存由上述方法得到的杂交瘤。

[0260] 完成克隆化以后，将培养基由HT培养基更换为正常培养基，并培养杂交瘤。

[0261] 通过使用大型培养瓶的旋转培养或通过旋动培养，进行大规模培养。从大规模培养得到的上清液中，通过使用诸如凝胶过滤等本领域技术人员已知的方法进行纯化，可以得到特异性地结合本发明的蛋白的单克隆抗体。

[0262] 此外，向与杂交瘤同品系的小鼠（例如上述的BALB/c）或Nu/Nu小鼠的腹腔内注射杂交瘤，使杂交瘤增殖，由此可以获得含有大量本发明的单克隆抗体的腹水。

[0263] 在腹腔内施用杂交瘤的情况下，如果提前3-7天施用诸如2,6,10,14-四甲基十五烷（姥鲛烷）等的矿物油，则可得到更大量的腹水。

[0264] 例如，预先向与杂交瘤同品系的小鼠的腹腔内注射免疫抑制剂，使T细胞失活。20天后，使106-107个杂交瘤克隆细胞悬浮于不含血清的培养基中（0.5 ml），然后向小鼠腹腔内施用该混悬液。一般而言，当腹部膨胀并充满腹水时，从小鼠收集腹水。通过该方法，可得到比培养液中的浓度高约100倍或更高浓度的单克隆抗体。

[0265] 通过在例如Weir, D.M.: Handbook of Experimental Immunology Vol.I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978)中描述的方法，可以纯化由上述方法得到的单克隆抗体。

[0266] 这样得到的单克隆抗体对B7-H3具有高抗原特异性。

[0267] （h）单克隆抗体的测定

[0268] 可以如下确定这样得到的单克隆抗体的同种型和亚类。

[0269] 首先，鉴定方法的例子包括奥脱洛尼（Ouchterlony）法、ELISA法以及RIA法。

[0270] 奥脱洛尼法是简便的，但是当单克隆抗体浓度较低时，需要浓缩操作。

[0271] 另一方面，当使用ELISA法或RIA法时，通过使培养物上清液与吸附有抗原的固相直接反应，并使用与各种免疫球蛋白同种型和亚类对应的抗体作为第二抗体，可以鉴定单克隆抗体的同种型和亚类。

[0272] 另外，作为更简便的方法，也可以使用市售的鉴定试剂盒（例如，由Bio-Rad Laboratories, Inc.制造的小鼠分型试剂盒）等。

[0273] 此外，通过Folin Lowry法，以及基于在280nm的吸光度的计算方法[1.4 (OD 280) = 1 mg免疫球蛋白/ml]，可以进行蛋白的定量测定。

[0274] 此外，即使当再次通过执行(2)中的(a)至(h)的步骤单独地和独立地得到单克隆抗体时，可能得到具有与M30抗体等效的细胞毒性活性的抗体。作为这样的抗体的一个例子，可以例举结合与M30抗体相同的表位的抗体。M30会识别IgC1或IgC2结构域（其为B7-H3细胞外结构域中的结构域）中的表位，并且结合IgC1结构域或IgC2结构域或二者。因此，作为M30抗体的表位，具体地，可以例举存在于B7-H3的IgC1或IgC2结构域中的表位。如果新生产的单克隆抗体会结合M30抗体所结合的部分肽或部分三级结构，那么可以确定，所述单克隆抗体会结合与M30抗体相同的表位。此外，通过证实所述单克隆抗体与M30抗体竞争结合B7-H3 (即，所述单克隆抗体会抑制M30抗体和B7-H3之间的结合)，可以确定，所述单克隆抗体结合与M30抗体相同的表位，即使尚未确定具体表位序列或结构。当证实所述单克隆抗体结合与M30抗体相同的表位时，强烈地预见到，所述单克隆抗体具有与M30抗体等效的细胞毒性活性。

[0275] （3）其它抗体

[0276] 本发明的抗体不仅包括上述抗B7-H3的单克隆抗体，而且包括以降低对人的异种抗原性为目的而人工修饰得到的重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。使用已知的方法，可以制备这些抗体。

[0277] 作为这样的嵌合抗体，可以例举其中抗体可变区和恒定区源自不同物种的抗体，例如，其中使小鼠-或大鼠-衍生的抗体可变区与人-衍生的恒定区相连的嵌合抗体(参见Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984))。源自小鼠抗-人B7-H3抗体M30的嵌合抗体是这样的抗体：其由重链和轻链组成，所述重链包含重链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO: 51的氨基酸残基20-141组成，所述轻链包含轻链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列由SEQ ID NO: 53的氨基酸残基23-130组成，且其可能具有任意的人-衍生的恒定区。作为这样的嵌合抗体的一个例子，可以例举由重链和轻链组成的抗体，所述重链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 63的氨基酸残基1-471组成，所述轻链的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 59的氨基酸残基1-233组成。此外，在由序列表中的SEQ ID NO: 63所表示的重链序列中，由氨基酸残基1-19组成的氨基酸序列是信号序列，由氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列是可变区，且由氨基酸残基142-471组成的氨基酸序列是恒定区。此外，在由序列表中的SEQ ID NO: 59所表示的轻链序列中，由氨基酸残基1-20组成的氨基酸序列是信号序列，由氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列是可变区，且由氨基酸残基129-233组成的氨基酸序列是恒定区。

[0278] 序列表中的SEQ ID NO: 63所表示的重链氨基酸序列是由序列表中的SEQ ID NO: 62所表示的核苷酸序列编码。在由序列表中的SEQ ID NO: 62所表示的核苷酸序列中，由核苷酸1-57组成的核苷酸序列编码所述抗体的重链信号序列，由核苷酸58-423组成的核苷酸序列编码所述抗体的重链可变区，且由核苷酸424-1413组成的核苷酸序列编码所述抗体的重链恒定区。

[0279] 序列表中的SEQ ID NO: 59所表示的轻链氨基酸序列是由序列表中的SEQ ID NO: 58所表示的核苷酸序列编码。在由序列表中的SEQ ID NO: 58所表示的核苷酸序列中，由核苷酸1-60组成的核苷酸序列编码所述抗体的轻链信号序列，由核苷酸61-384组成的核苷酸序列编码所述抗体的轻链可变区，且由核苷酸385-699组成的核苷酸序列编码所述抗体的轻链恒定区。

[0280] 作为这样的人源化抗体，可以例举：通过只将互补性决定区(CDR)整合到人-衍生的抗体中所得到的抗体(参见Nature (1986) 321, 第522-525页)，以及通过CDR-移植法将构架的氨基酸残基的一部分和CDR序列移植到人抗体中所得到的抗体(WO 90/07861)。

[0281] 但是，源自M30抗体的人源化抗体不限于特定人源化抗体，只要所述人源化抗体具有M30抗体的所有6类CDR序列且具有抗肿瘤活性即可。此外，M30抗体的重链可变区具有：由序列表中的SEQ ID NO: 92表示的氨基酸序列组成的CDRH1 (NYVMH)，由序列表中的SEQ ID NO: 93表示的氨基酸序列组成的CDRH2 (YINPYNDDVKYNEKFKG)，和，由序列表中的SEQ ID NO: 94表示的氨基酸序列组成的CDRH3 (WGYYGSPLYYFDY)。此外，M30抗体的轻链可变区具有：由序列表中的SEQ ID NO: 95表示的氨基酸序列组成的CDRL1 (RASSRLIYMH)，由序列表中的SEQ ID NO: 96表示的氨基酸序列组成的CDRL2 (ATSNLAS)，和，由序列表中的SEQ ID NO: 97表示的氨基酸序列组成的CDRL3 (QQWNSNPPT)。

[0282] 作为小鼠抗体M30的人源化抗体的一个例子，可以例举重链和轻链的任意组合，所述重链包含由以下任一个组成的重链可变区：(1) 由序列表中的SEQ ID NO: 85、87、89或91的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列，(2) 与上述的氨基酸序列(1)具有至少95%或更多同源性的氨基酸序列，和(3) 在上述的氨基酸序列(1)中缺失、取代或添加一个或几个氨基酸所形成的氨基酸序列，所述轻链包含由以下任一个组成的轻链可变区：(4) 由序列表中的SEQ ID NO: 71、73、75、77、79、81或83的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列，(5) 与上述的氨基酸序列(4)具有至少95%或更多同源性的氨基酸序列，和(6) 在上述的氨基酸序列(4)中缺失、取代或添加一个或几个氨基酸所形成的氨基酸序列。

[0283] 此外，本文中使用的术语“几个”表示1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3或1或2。

[0284] 作为氨基酸取代，在本说明书中，保守的氨基酸取代是优选的。保守的氨基酸取代表示，在与氨基酸侧链有关的氨基酸集合内发生的取代。优选的氨基酸集合如下：酸性集合(天冬氨酸和谷氨酸)；碱性集合(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)；非极性集合(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)；和不带电荷的极性家族(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)。更优选的氨基酸集合如下：脂族羟基(丝氨酸和苏氨酸)；含有酰胺的集合(天冬酰胺和谷氨酰胺)；脂族集合(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)；和芳族集合(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)。这样的氨基酸取代优选地在不会损害具有原始氨基酸序列的物质的性能的集合内进行。

[0285] 作为具有上述的重链和轻链的优选组合的抗体，可以例举：由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 71的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 75的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；
由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 77的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 79的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 81的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 83的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 91的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 71的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 91的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 73的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 91的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 75的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区；以及由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含由SEQ ID NO: 91的氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列所组成的重链可变区，所述轻链包含由SEQ ID NO: 77的氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列所组成的轻链可变区。

[0286] 作为具有上述的重链和轻链的更优选组合的抗体：由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 71的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成；由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 73的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成；由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 75的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成；由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 77的氨基酸残基
21-233表示的氨基酸序列组成；由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 79的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成；由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 81的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成；由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 85的氨基酸残基20-
471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 83的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成；由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 91的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 71的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成；由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 91的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 73的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成；由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 91的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 75的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成；和由重链和轻链组成的抗体，所述重链由SEQ ID NO: 91的氨基酸残基20-471表示的氨基酸序列组成，所述轻链由SEQ ID NO: 77的氨基酸残基21-233表示的氨基酸序列组成。

[0287] 此外，作为具有上述的重链和轻链的优选组合的抗体，可以例举由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 71的氨基酸序列；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 75的氨基酸序列；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 77的氨基酸序列；
由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 79的氨基酸序列；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 81的氨基酸序列；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 85的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 83的氨基酸序列；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 91的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 
71的氨基酸序列；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 91的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 73的氨基酸序列；由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 91的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 75的氨基酸序列；以及由重链和轻链组成的抗体，所述重链包含SEQ ID NO: 91的氨基酸序列，所述轻链包含SEQ ID NO: 77的氨基酸序列。

[0288] 通过组合与上述重链氨基酸序列具有高同源性的序列和与上述轻链氨基酸序列具有高同源性的序列，可能选择具有与每种上述抗体等效的细胞毒性活性的抗体。这样的同源性通常是80%或更高的同源性，优选90%或更高的同源性，更优选95%或更高的同源性，最优选99%或更高的同源性。此外，通过组合在重链或轻链氨基酸序列中取代、缺失或添加1个至几个氨基酸残基所形成的氨基酸序列，也可能选择具有与每种上述抗体等效的细胞毒性活性的抗体。

[0289] 使用Blast算法2.2.2版的默认参数(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller,和David J. Lipman (1997), “Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs”, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402)，可以确定
2个氨基酸序列之间的同源性。通过因特网访问站点1334907992153_0，也可以使用Blast算法。

[0290] 此外，在由序列表中的SEQ ID NO: 85、87、89或91表示的重链氨基酸序列中，由氨基酸残基1-19组成的氨基酸序列是信号序列，由氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列是可变区，且由氨基酸残基142-471组成的氨基酸序列是恒定区。

[0291] 此外，在由序列表中的SEQ ID NO: 71、73、75、77、79、81或83表示的轻链氨基酸序列中，由氨基酸残基1-20组成的氨基酸序列是信号序列，由氨基酸残基21-128组成的氨基酸序列是可变区，且由氨基酸残基129-233组成的氨基酸序列是恒定区。

[0292] 由序列表中的SEQ ID NO: 85、87、89或91表示的重链氨基酸序列分别由序列表中的SEQ ID NO: 84、86、88或90表示的核苷酸序列编码。此外，由SEQ ID NO: 84和85表示的序列显示在图34中，由SEQ ID NO: 86和87表示的序列显示在图35中，由SEQ ID NO: 88和89表示的序列显示在图36中，且由SEQ ID NO: 90和91表示的序列显示在图37中。在每个上述核苷酸序列中，由核苷酸1-57组成的核苷酸序列编码抗体的重链信号序列, 由核苷酸
58-423组成的核苷酸序列编码抗体的重链可变区，且由核苷酸424-1413组成的核苷酸序列编码抗体的重链恒定区。

[0293] 由序列表中的SEQ ID NO: 71、73、75、77、79、81或83表示的轻链氨基酸序列分别由序列表中的SEQ ID NO: 70、72、74、76、78、80或82表示的核苷酸序列编码。此外，由SEQ ID NO: 70和71表示的序列显示在图27中，由SEQ ID NO: 72和73表示的序列显示在图28中，由SEQ ID NO: 74和75表示的序列显示在图29中，由SEQ ID NO: 76和77表示的序列显示在图30中，由SEQ ID NO: 78和79表示的序列显示在图31中，由SEQ ID NO: 80和81表示的序列显示在图32中，且由SEQ ID NO: 82和83表示的序列显示在图33中。在每个上述核苷酸序列中，由核苷酸1-60组成的核苷酸序列编码抗体的轻链信号序列，由核苷酸61-384组成的核苷酸序列编码抗体的轻链可变区，且由核苷酸385-699组成的核苷酸序列编码抗体的轻链恒定区。

[0294] 使用Blast算法，也可以确定这些核苷酸序列中的任一个与另一种抗体的核苷酸序列之间的同源性。

[0295] 此外，本发明的抗体包括结合与M30抗体相同的表位的人抗体。抗-B7-H3人抗体表示只具有源自人染色体的抗体基因序列的人抗体。通过使用生产人抗体的小鼠的方法可以获得抗-B7-H3人抗体，所述小鼠具有包含人抗体的重链和轻链基因的人染色体片段(参见Tomizuka, K. 等人, Nature Genetics (1997) 16, 第133-143页; Kuroiwa, Y. 等人, Nucl. Acids Res. (1998) 26, 第3447-3448页; Yoshida, H. 等人, Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects第10卷, 第69-73页(Kitagawa, Y., Matuda, T. 和Iijima, S. 编), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, 第722-727页, 等)。

[0296] 具体地可以如下建立这种生产人抗体的小鼠。通过制备敲除的动物和转基因动物，并使这些动物交配，建立遗传修饰的动物，其中已经破坏了内源免疫球蛋白重链和轻链基因基因座，并替代地，经由酵母人工染色体（YAC）载体等已经导入了人免疫球蛋白重链和轻链基因基因座。

[0297] 此外，根据重组DNA技术，通过使用编码这样的人抗体重链和轻链中的每一种的cDNA，并优选使用包含这样的cDNA的载体，转化真核细胞，培养生产重组人单克隆抗体的转化体细胞，由此也可从培养物上清液获得该抗体。

[0298] 在这里，例如，可以使用真核细胞、优选哺乳动物细胞，诸如CHO细胞、淋巴细胞或骨髓瘤细胞作为宿主。

[0299] 此外，还已知获得从人抗体文库选择出来的噬菌体展示-衍生的人抗体的方法(参见Wormstone, I. M. 等人, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), 第2301-2308页; Carmen, S. 等人, Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), 第189-203页; Siriwardena, D. 等人, Ophthalmology (2002) 109 (3), 第427-431页, 等)。

[0300] 例如，可以使用噬菌体展示法，其中在噬菌体表面上表达人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，并选择结合抗原的噬菌体(Nature Biotechnology (2005), 23, (9), 第1105-1116页)。

[0301] 通过分析基于它与抗原的结合所选择的噬菌体的基因，可以确定编码结合抗原的人抗体的可变区的DNA序列。

[0302] 如果确定了结合抗原的scFv的DNA序列，通过制备包含该序列的表达载体，并将该载体导入适当的宿主中以表达它，可以获得人抗体(WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. 
Immunol. (1994) 12, 第433-455页, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), 第1105-
1116页)。

[0303] 如果新生产的人抗体会结合M30抗体所结合的部分肽或部分三级结构，那么可以确定，所述人抗体会结合与M30抗体相同的表位。此外，通过证实所述人抗体与M30抗体竞争结合B7-H3 (即，所述人抗体会抑制M30抗体和B7-H3之间的结合)，可以确定，所述人抗体结合与M30抗体相同的表位，即使尚未确定具体表位序列或结构。当证实所述人抗体结合与M30抗体相同的表位时，强烈地预见到，所述人抗体具有与M30抗体等效的细胞毒性活性。

[0304] 通过在实施例3中显示的方法或类似方法，评价通过上述方法得到的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体的抗原结合性能，并且可以选择优选的抗体。

[0305] 作为用于比较抗体性能的另一种指标的一个例子，可以例举抗体的稳定性。示差扫描量热仪(DSC) 是能够快速地和准确地测量热变性中点温度(Tm)的装置，所述Tm将用作蛋白的相对构象稳定性的有利指标。通过使用DSC测量Tm值并比较所述值，可以比较热稳定性的差异。已知的是，抗体的储存稳定性显示出与抗体的热稳定性的某种关联性(Lori Burton, 等人, Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, 第265-273页)，使用热稳定性作为指标，可以选择出优选的抗体。用于选择抗体的其它指标的例子包括下述特征：在适当宿主细胞中的产量较高，在水性溶液中的聚集性较低。例如，显示出最高产量的抗体不总是显示出最高热稳定性，因此，通过基于上述指标做出综合性评价来选择最适合施用给人的抗体是必要的。

[0306] 此外，还已知这样的方法，其中使用适当的接头连接抗体的全长重链和轻链序列，由此得到单链免疫球蛋白(Lee, H-S, 等人, Molecular Immunology (1999) 36, 第61-71页; Shirrmann, T.等人, mAbs (2010), 2, (1)第1-4页)。通过二聚化这样的单链免疫球蛋白，得到的二聚体可以具有与本身是四聚体的抗体类似的结构和活性。此外，本发明的抗体可以是具有单个重链可变区且不具有轻链序列的抗体。这样的抗体被称作单结构域抗体(sdAb)或纳米体（nanobody），实际上，在骆驼和羊驼中观察到这样的抗体，且已经报道其具有抗原结合亲和力(Muyldemans S. 等人, Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. 等人, Nature (1993) 363 (6428) 446-8)。还可以将上述抗体理解为根据本发明的抗体的功能片段的类型。

[0307] 在本发明中，还包括抗体或抗体功能片段的经修饰的变体。经修饰的变体表示，通过对本发明的抗体或抗体功能片段进行化学或生物修饰而得到的变体。这样的化学修饰的变体的例子包括：通过将化学部分连接至氨基酸骨架上而化学修饰的变体，用N-连接的或O-连接的碳水化合物链化学修饰的变体，等。这样的生物修饰的变体的例子包括：通过翻译后修饰(诸如N-连接的或O-连接的糖基化、N-或C-端加工、脱酰胺化、天冬氨酸的异构化或蛋氨酸的氧化)而得到的变体，和通过在原核宿主细胞中表达而已经向N端添加蛋氨酸残基所形成的变体。

[0308] 此外，在经修饰的变体的含义中也包括：经过标记从而实现本发明的抗体或抗原的检测或分离的抗体，例如，酶标记的抗体、荧光标记的抗体和亲和力标记的抗体。本发明的抗体或抗体功能片段的这样的经修饰的变体可用于：改善本发明的原始抗体或抗体功能片段的稳定性和血液保留，降低其抗原性，检测或分离这样的抗体或抗原，诸如此类。

[0309] 此外，通过调节与本发明的抗体连接的聚糖的修饰(糖基化、去岩藻糖基化等)，可能增强抗体依赖性的细胞的细胞毒性活性。WO 99/54342、WO 00/61739、WO 02/31140等公开了已知的技术作为用于调节抗体的聚糖的修饰的技术。但是，所述技术不限于此。在本发明的抗体和抗体功能片段中，也包括在其中调节聚糖的修饰的抗体或抗体功能片段。

[0310] 在首先分离抗体基因、然后将该基因导入适当宿主中来制备抗体的情况下，可以使用适当宿主和适当表达载体的组合。抗体基因的具体例子包括编码抗体的重链序列的基因和编码在本说明书中描述的其轻链序列的基因的组合。当转化宿主细胞时，可能将重链序列基因和轻链序列基因插入相同的表达载体中，且也可能分别插入不同的表达载体中。

[0311] 在使用真核细胞作为宿主的情况下，可以使用动物细胞、植物细胞和真核微生物。作为这样的动物细胞，可以例举哺乳动物细胞，例如，猿猴COS细胞(Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, 第175-182页, ATCC CRL-1650)、鼠成纤维细胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞; ATCC: CCL-61)的二氢叶酸还原酶-缺陷株(Urlaub, G.和Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 第4126-4220页)。

[0312] 在使用原核细胞的情况下，例如，可以例举大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

[0313] 通过转化向这些细胞中导入期望的抗体或抗体功能片段的基因，并在体外培养这样转化的细胞，可得到该抗体。在上述的培养方法中，产率有时可能随抗体的序列而变化，因此，可能通过使用产率作为指标，在具有等效的结合活性的抗体中选择可以容易地生产为药物的抗体。因此，在本发明的抗体和抗体功能片段中，还包括通过生产抗体或抗体功能片段的方法所得到的抗体或抗体功能片段，所述方法的特征在于包括：培养转化的宿主细胞的步骤，和从培养步骤所得到的培养产物中收集期望的抗体或抗体功能片段的步骤。

[0314] 此外，已知的是，缺失在培养的哺乳动物细胞中生产的抗体的重链的羧基端的赖氨酸残基(Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995))，还已知的是，缺失在培养的哺乳动物细胞中生产的抗体的重链的羧基端的2个氨基酸残基(甘氨酸和赖氨酸)，并且新位于羧基端处的脯氨酸残基被酰胺化(Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007))。但是，重链序列的这样的缺失和修饰不会影响抗体的抗原结合亲和力和效应子功能(补体的活化、抗体依赖性的细胞的细胞毒性等)。因此，在本发明中，也包括经过这样的修饰的抗体和抗体功能片段，并且可以例举：其中已经在重链的羧基端缺失了1或2个氨基酸的缺失变体，通过缺失变体的酰胺化得到的变体(例如，其中羧基端脯氨酸残基已经被酰胺化的重链)等。在根据本发明的抗体的重链的羧基端处具有缺失的缺失变体的类型不限于上述的变体，只要保留抗原结合亲和力和效应子功能即可。构成根据本发明的抗体的2个重链可以是选自全长重链和上述缺失变体的一种类型，或者可以是从其中选择的相组合的2种类型。每种缺失变体的量的比例可以受生产根据本发明的抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件影响，但是，可以例举这样的情况：在作为主要组分被包含在根据本发明的抗体中的2个重链中，已经缺失了在羧基端处的一个氨基酸残基。本发明的抗体的同种型没有限制，且其例子包括：IgG (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA (IgA1、IgA2)、IgD和IgE，且其优选的例子包括IgG和IgM，进一步，其更优选的例子包括IgG1和IgG2。

[0315] 此外，本发明的抗体可以是具有抗体的抗原结合部位的抗体功能片段或其修饰的片段。通过用诸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白酶处理抗体，或根据基因工程技术修饰抗体基因，并在适当的培养细胞中表达修饰的基因，可以得到抗体的片段。在这些抗体片段中，具有抗体的全部或部分功能的片段可以称为所述抗体的功能片段。

[0316] 作为抗体的功能，通常可以例举抗原结合活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性的细胞的细胞毒性(ADCC)活性和补体依赖性的细胞毒性(CDC)活性。根据本发明的抗体和抗体功能片段的功能是对B7-H3的结合活性，优选抗体依赖性的细胞介导的吞噬(ADCP)活性，更优选由针对肿瘤细胞的ADCP活性介导的细胞毒性活性(抗肿瘤活性)。此外，本发明的抗体除了具有ADCP活性以外，还可以具有ADCC活性和/或CDC活性。具体地，已经报道，含有目前可得到的抗肿瘤抗体的药物直接作用于肿瘤细胞以阻断增殖信号、直接作用于肿瘤细胞以诱导细胞死亡信号、抑制血管生成、诱导由NK细胞介导的ADCC活性和诱导由补体介导的CDC活性，由此抑制肿瘤细胞的生长(J Clin Oncol 28: 4390-
4399. (2010), Clin Cancer Res; 16 (1); 11-20. (2010))，但是，至少本发明的发明人没有知道，根据本申请的发明的抗-B7-H3抗体的ADCP活性被报告为含有目前可得到的抗肿瘤抗体的药物的活性。

[0317] 抗体片段的例子包括Fab、F(ab’)2、Fv、单链Fv (scFv，其中重链和轻链的Fv分子通过适当的接头相连)、双特异抗体、线性抗体、以及由抗体片段组成的多特异性抗体。此外，抗体片段也包括Fab’，它是通过在还原条件下处理F(ab’)2而得到的抗体可变区中的单价片段。

[0318] 此外，本发明的抗体可以是对至少两种不同类型的抗原具有特异性的多特异性抗体。通常，这样的抗体结合两种类型的抗原（即，双特异性抗体），但是，本文中使用的“多特异性抗体”包括具有对两种或更多种（例如，3种）类型的抗原的特异性的抗体。

[0319] 本发明的多特异性抗体可以是全长抗体或这样的抗体的片段（例如，F(ab’)2双特异性抗体）。通过连接两类抗体的重链和轻链（HL对），可以制备双特异性抗体，或者通过融合生产不同单克隆抗体的杂交瘤，以制备生产双特异性抗体的融合细胞，也可以制备双特异性抗体(Millstein等人, Nature (1983) 305, 第537-539页)。

[0320] 本发明的抗体可以是单链抗体（也称为scFv）。通过经由多肽接头连接抗体的重链可变区和轻链可变区，可以获得单链抗体(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (edited by Rosenberg and Moore), Springer Verlag, New York, 第269-315页(1994), Nature Biotechnology (2005), 23, 第1126-1136页)。此外，通过经由多肽接头连接两个scFv分子生成的BiscFv片段，也可用作双特异性抗体。

[0321] 制备单链抗体的方法是在本技术领域中已知的(参见，例如，美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513、5,455,030等)。在该scFv中，通过不形成缀合物的接头，优选通过多肽接头，连接重链可变区和轻链可变区(Huston, J. S. 等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988), 85, 第5879-5883页)。在scFv中，重链可变区和轻链可变区可以源自相同抗体或不同抗体。

[0322] 作为用于连接可变区的多肽接头，例如使用由12-19个残基组成的给定单链肽。

[0323] 可如下获得编码scFv的DNA：使用DNA（其包含选自编码上述抗体的重链或重链可变区的DNA和编码上述抗体的轻链或轻链可变区的DNA的DNA的全部或期望部分）作为模板，并使用限定模板DNA的两端的引物对，通过PCR法进行扩增，并通过组合编码多肽接头部分的DNA和限定所述多肽两端的引物对，从而将其所述两端分别连接至重链和轻链中的每一个，进一步进行扩增。

[0324] 此外，制备编码scFv的DNA以后，根据常规方法，可以获得包含该DNA的表达载体以及用该表达载体转化的宿主。此外，通过使用获得的宿主，根据常规方法，可以获得scFv。通过以与上述相同的方式获得基因并表达该基因，可以在宿主中生产其抗体片段。

[0325] 可以使本发明的抗体多聚化，以增加对抗原的亲和性。待多聚化的抗体可以是一类抗体，或识别相同抗原的多个表位的多个抗体。作为多聚化抗体的方法，可以例举的是使IgG CH3结构域结合两个scFv分子，结合抗生蛋白链菌素，导入螺旋-转角-螺旋基序等。

[0326] 本发明的抗体可以是多克隆抗体，它是具有不同氨基酸序列的多类抗-B7-H3抗体的混合物。作为多克隆抗体的一个例子，可以例举具有不同CDR的多类抗体的混合物。可以使用如下得到的抗体作为这样的多克隆抗体：培养生产不同抗体的细胞的混合物，然后从得到的培养物纯化抗体(参见WO 2004/061104)。

[0327] 也可以使用与诸如聚乙二醇(PEG) 等任意不同类型的分子结合的抗体作为修饰的抗体。

[0328] 此外，本发明的抗体可以是这些抗体中的任一种和另一种药物成分之间形成的缀合物的形式（免疫缀合物）。这样的抗体的例子包括其中将抗体缀合到放射性物质或具有药理作用的化合物上的缀合物（Nature Biotechnology (2005) 23, 第1137-1146页）。其例子包括：铟(111In)-卡罗单抗喷地肽、锝(99mTc)-巯诺莫单抗、铟(111In)-替伊莫单抗、钇(90Y)-替伊莫单抗和碘(131I)-托西莫单抗。

[0329] 可以将所得抗体纯化至同质。使用常规的蛋白分离和纯化方法，可以进行抗体的分离和纯化。例如，通过适当地选择和组合柱色谱法、过滤器过滤、超滤、盐析、透析、制备聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳等，可以分离和纯化抗体（Strategies for protein Purification and Charcterization:A Laboratoy Course Manual,Daniel R.Marshak等人编, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996);Antibodies:A Laboratory Manual.Harlow and David Lane编,Cold Spring Harbor Laboratory（1988）），但是方法不限于此。

[0330] 这些色谱法的例子包括亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法和吸附色谱法。

[0331] 使用液相色谱法，诸如HPLC或FPLC，可以进行这些色谱法。

[0332] 作为用于亲和色谱法的柱子，可以例举蛋白A柱和蛋白G柱。例如，作为使用蛋白A柱的柱子，可以例举Hyper D、POROS、Sepharose FF (Pharmacia)等。

[0333] 此外，通过使用其上固定有抗原的载体，利用抗体对抗原的结合性质，也可纯化抗体。

[0334] 3. 包含抗-B7-H3抗体的药物

[0335] 通过上面“2. 抗-B7-H3抗体的制备”项下描述的方法得到的抗体表现出针对癌细胞的细胞毒性活性，并且因此可以用作药物，特别是癌症的治疗剂和/或预防剂。

[0336] 通过测量细胞生长的抑制活性，可以确定抗体在体外表现出的细胞毒性活性。

[0337] 例如，培养过表达B7-H3的癌细胞系，将不同浓度的抗体加给培养物系统，并可以测量针对灶性形成、集落形成和球状体生长的任何抑制活性。

[0338] 使用实验动物可以确定抗体对癌症的体内治疗效果，例如，将抗体施用给植入了过表达B7-H3的肿瘤细胞系的裸鼠，并测量癌细胞的任何变化。

[0339] 癌症类型的例子包括肺癌、肾癌、泌尿道上皮癌、结直肠癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌和食管癌，但是，癌症的类型不限于此，只要待治疗的癌细胞表达B7-H3即可。

[0340] 要在根据本发明的药物组合物的制备中使用的可接受的物质优选地在其施用量和浓度对施用所述药物组合物的个体没有毒性。

[0341] 本发明的药物组合物可以包含能改变或维持pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等张性、无菌状态、稳定性、溶解度、释放速率、吸收速率及其渗透性的药用物质。这样的药用物质的例子包括、但不限于：氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸；抗微生物剂；抗氧化剂诸如抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠；缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐缓冲剂、碳酸氢钠和Tris-HCl溶液；填充剂诸如甘露醇和甘氨酸；螯合剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)；络合剂诸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精；增量剂诸如葡萄糖、甘露糖和糊精；其它碳水化合物诸如单糖类和二糖类；着色剂；矫味剂；稀释剂；乳化剂；亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷；防腐剂诸如低分子量多肽、成盐抗衡离子、苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢；溶剂诸如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇诸如甘露醇和山梨醇；助悬剂；表面活性剂诸如脱水山梨糖醇酯、包括聚山梨酯20和聚山梨酯80在内的聚山梨酯、曲拉通（Triton）、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇；稳定性增强剂诸如蔗糖和山梨醇；弹性增强剂诸如氯化钠、氯化钾和甘露醇和山梨醇；转运剂；赋形剂；和/或药物佐剂。用于药用的这些物质的量优选为抗-B7-H3抗体重量的0.001-100倍，特别优选0.1-10倍。根据组合物应用的疾病、应用的施用途径等，本领域技术人员可以适当地确定制备物中药物组合物的优选制剂。

[0342] 药物组合物中的赋形剂和载体可以是液体或固体形式。适当的赋形剂或载体可以是注射用水、生理盐水、人工脑脊液或肠胃外施用中常用的其它物质。此外，中性生理盐水或含有血清白蛋白的生理盐水也可以用作载体。药物组合物可以含有pH7.0-8.5的Tris缓冲液、pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液或pH 3.0-6.2的柠檬酸盐缓冲液。此外，这样的缓冲液可以补充山梨醇或另一种化合物。

[0343] 本发明的药物组合物的例子包括含有抗-B7-H3抗体的药物组合物、以及含有抗-B7-H3抗体和至少一种癌症治疗剂的药物组合物。将本发明的药物组合物制成冻干产品或液体形式，作为具有所选择的组成和所需的纯度的药剂。也可以使用适当的赋形剂（如蔗糖），使含有抗-B7-H3抗体的药物组合物以及含有抗-B7-H3抗体和至少一种癌症治疗剂的药物组合物形成冻干产品。

[0344] 在上述药物组合物中，要与抗-B7-H3抗体一起掺入的癌症治疗剂可以与抗-B7-H3抗体同时地、分开地或顺序地施用，或者可以以不同的给药间隔施用治疗剂和抗-B7-H3抗体。这样的癌症治疗剂的例子包括注射用白蛋白结合的紫杉醇（Abraxane）、卡铂、顺铂、吉西他滨、伊立替康(CPT-11)、紫杉醇、培美曲塞、索拉非尼、长春碱、和在WO 2003/038043中描述的药剂，且所述癌症治疗剂的其它例子包括LH-RH类似物(诸如亮丙瑞林和戈舍瑞林)、磷酸雌莫司汀、雌激素拮抗剂(诸如他莫昔芬和雷洛昔芬)和芳香酶抑制剂(诸如阿那曲唑、来曲唑和依西美坦)，但是，所述试剂不限于此，只要所述试剂是具有抗肿瘤活性的药剂即可。

[0345] 要施用药物组合物的个体没有特别限制，但是，优选的是哺乳动物，更优选的是人类。

[0346] 本发明的药物组合物可以制成用于肠胃外施用或用于经口服给药的胃肠道吸收。制剂的组成和浓度可根据施用方法确定。本发明的药物组合物中所含的抗-B7-H3抗体对B7-H3的亲和力越高，也就是说，其对B7-H3的解离常数(Kd值)越低，则抗-B7-H3抗体可以表现出的药物效能越多（甚至在减少给人的剂量时）。因此，基于该结果，也可以确定本发明的药物组合物对人的剂量。对于剂量，在给人施用人抗-B7-H3抗体的情况下，可以以约0.001-
100 mg/kg（每1-180天一次或几次）的剂量施用抗体。本发明的药物组合物的剂型的例子包括：包括输注在内的注射剂、栓剂、经鼻剂、舌下剂和经皮吸收剂。
实施例

[0347] 在下文中，将参考实施例更具体地描述本发明，但是，本发明不限于此。

[0348] 应当指出，除非另有说明，在下述实施例中的与基因操作有关的各个操作均根据在“Molecular Cloning”（Sambrook, J., Fritsch, E.F.和Maniatis, T.著, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年出版）中所述的方法进行，或在使用商购可得的试剂或试剂盒的情况下，根据附随的说明书使用它们。

[0349] 实施例1. 质粒的制备

[0350] 1)-1  人B7-H3表达载体的制备

[0351] 1)-1-1  全长人B7-H3变体1的表达载体的制备

[0352] 使用从LNCaP细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC))的总RNA合成的cDNA作为模板，并且也使用下述引物集合，进行PCR反应，由此扩增编码人B7-H3变体1的cDNA：

[0353] 引物1：

[0354] 5’-ctatagggagacccaagctggctagcatgctgcgtcggcggggcag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 1)；和

[0355] 引物2：

[0356] 5’-aacgggccctctagactcgagcggccgctcaggctatttcttgtccatcatcttctttgctgtcag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 2)。

[0357] 随后，使用MagExtractor PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.)，纯化如此得到的PCR产物。然后，用限制性酶(NheI和NotI)消化PCR产物，随后使用MagExtractor PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.)进行纯化。用相同的限制性酶(NheI和NotI)消化pcDNA3.1(+) 质粒DNA，随后使用MagExtractor PCR & Gel cleanup (TOYOBO, Co., Ltd.)进行纯化。

[0358] 混合得到的经纯化的DNA溶液，并进一步向其中加入Ligation high (TOYOBO, Co., Ltd.)，并将得到的混合物在16℃温育8小时以实现连接。将得到的反应混合物加给大肠杆菌DH5α感受态细胞(Invitrogen Corporation) 以实现转化。

[0359] 使用PCR引物和BGH反向引物，对得到的菌落进行菌落直接PCR，并选择候选克隆。

[0360] 在液体培养基(LB/Amp)中培养得到的候选克隆，并使用MagExtractor -Plasmid- (TOYOBO, Co., Ltd.)提取质粒DNA。

[0361] 通过使用得到的质粒DNA作为模板，通过序列分析确定下述引物3和引物4之间的序列，并在得到的克隆和提供的CDS序列之间比较序列：

[0362] 引物3 (CMV启动子引物)：

[0363] 5’-cgcaaatgggcggtaggcgtg-3’(序列表中的SEQ ID NO: 3)；和

[0364] 引物4 (BGH反向引物)：

[0365] 5’-标签aaggcacagtcgagg-3’(序列表中的SEQ ID NO: 4)。

[0366] 在证实序列以后，在200 ml LB/Amp培养基中培养得到的克隆，并使用Plasmid Midi V-100试剂盒(VioGene, Inc.)提取质粒DNA。

[0367] 将如此得到的载体命名为“pcDNA3.1-B7-H3”。在该载体中克隆的B7-H3变体1基因的ORF区域的序列由序列表中的SEQ ID NO: 5中的核苷酸编号1-1602表示。此外，B7-H3变体1的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 6表示。

[0368] 1)-1-2  全长人B7-H3变体2的表达载体的制备

[0369] 使用从LNCaP细胞的总RNA合成的cDNA作为模板，并且也使用下述引物集合，进行PCR，由此扩增编码人B7-H3变体2的cDNA：

[0370] 引物5

[0371] 5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcaccatgctgcgtcggcggggcagccctg-3’(序列表中的SEQ ID NO: 7)

[0372] 引物6

[0373] 5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcggctatttcttgt-3’(序列表中的SEQ ID NO: 8)。

[0374] 以与在实施例1)-1-1中相同的方式进行纯化，并通过Gateway BP反应将纯化后的PCR产物整合进pDONR221载体(Invitrogen Corporation)中，由此转化大肠杆菌TOP10 (Invitrogen Corporation)。

[0375] 对于转化以后得到的克隆，通过菌落PCR证实插入片段的大小。对于8个其中证实了插入片段大小的克隆，通过针对两端从载体侧向插入片段侧进行一个测序反应，证实在插入片段的3’末端和5’末端处的DNA序列。进行入门克隆（entry clone）（其序列经过证实）和Gateway目标载体pcDNA-DEST40 (Invitrogen Corporation) 之间的Gateway LR反应。对于转化大肠杆菌TOP10以后得到的克隆，通过菌落PCR证实插入片段的大小。对于其中证实了插入片段大小的克隆，分析在插入片段的3’末端和5’末端处的DNA序列，以证实目标插入片段被正确地插入。使用PureLink HiPure Plasmid Megaprep Kit (Invitrogen Corporation)，纯化至少1 mg如此制备的克隆质粒。

[0376] 将如此得到的载体命名为“pcDNA-DEST40-B7-H3变体2”。在该载体中克隆的B7-H3变体2基因的ORF区域的序列由序列表中的SEQ ID NO: 9中的核苷酸编号1-948表示。此外，B7-H3变体2的氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 10表示。

[0377] 1)-2  B7-H3部分蛋白的表达载体的制备

[0378] 使用与实施例1)-1-1的B7-H3变体1有关的B7-H3全长质粒作为模板，通过PCR法扩增每一个下述区域。显示每一个目标区域的编号对应于由SEQ ID NO: 5表示的B7-H3的核苷酸编号。将引物设计成除了含有Gateway att序列以外还含有在3’末端处的终止密码子。

[0379] 如下制备每一个下述区域1)、2)和3)：扩增2个区域，然后通过PCR法连接所述区域以形成一个片段。即，关于区域1)，使用引物7和12、和引物15和11进行扩增，并使用引物7和11进一步扩增得到的PCR产物。关于区域2)，使用引物8和13、和引物15和11进行扩增，并使用引物8和11进一步扩增得到的PCR产物。关于区域3)，使用引物9和14、和引物15和11进行扩增，并使用引物9和11进一步扩增得到的PCR产物。关于区域4)，使用引物10和11进行扩增。关于区域5)，使用引物8和11进行扩增。关于区域6)，使用引物9和11进行扩增。

[0380] 目标区域

[0381] 1) B7-H3变体1 ORF: 79-417和1369-1602 (573 bp)

[0382] 2) B7-H3变体1 ORF: 418-732和1369-1602 (549 bp)

[0383] 3) B7-H3变体1 ORF: 733-1071和1369-1602 (573 bp)

[0384] 4) B7-H3变体1 ORF: 1072-1602 (531 bp)

[0385] 5) B7-H3变体1 ORF: 418-1602 (1185 bp)

[0386] 6) B7-H3变体1 ORF: 733-1602 (870 bp)

[0387] 引物编号和碱基序列

[0388] 引物7

[0389] 5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggagccctggaggtccaggtc-3’(序列表中的SEQ ID NO: 11)

[0390] 引物8

[0391] 5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgctccctactcgaagcccagcatg-3’(序列表中的SEQ ID NO: 12)

[0392] 引物9

[0393] 5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcggagccgtggaggtccaggtc-3’(序列表中的SEQ ID NO: 13)

[0394] 引物10

[0395] 5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgctccctactcgaagcccagcatg-3’(序列表中的SEQ ID NO: 14)

[0396] 引物11

[0397] 5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtctcaggctatttcttgtccatcatc-3’(序列表中的SEQ ID NO: 15)

[0398] 引物12

[0399] 5’-gggaatgtcataggctgcccggccacctgcaggctgacggcag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 16)

[0400] 引物13

[0401] 5’-gggaatgtcataggctgccctgtggggcttctctggggtgtg-3’(序列表中的SEQ ID NO: 17)

[0402] 引物14

[0403] 5’-gggaatgtcataggctgcccggccacctgcaggctgacggcag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 18)

[0404] 引物15

[0405] 5’-gggcagcctatgacattccccccagag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 19)

[0406] 以与实施例1)-1-1中相同的方式进行纯化，并通过Gateway BP反应将纯化后的每一种扩增产物整合进pDONR221载体中，由此转化大肠杆菌TOP10。对于转化后得到的克隆，通过菌落PCR证实插入片段的大小。

[0407] 对于其中证实了插入片段的大小的每个克隆，通过针对两端从载体侧向插入片段侧进行一个测序反应，证实在插入片段的3’末端和5’末端处的DNA序列。

[0408] 对于经证实具有目标插入片段的克隆，还使用下述引物证实了插入片段的总DNA序列。作为序列分析的结果，证实了所有序列与目标序列的信息完全相同。

[0409] 进行每个入门克隆（其序列经过证实）和pFLAG-myc-CMV-19-DEST (Invitrogen Corporation)之间的Gateway LR反应。对于转化大肠杆菌DH10B (Invitrogen Corporation)以后得到的克隆，通过菌落PCR证实插入片段的大小。

[0410] 对于其中证实了插入片段的大小的每个克隆，分析在插入片段的3’末端和5’末端处的DNA序列，以证实目标插入片段被正确地插入。在下文中，通过整合每个上述区域1)至6)得到的表达载体分别由“B7-H3 IgV1”、“B7-H3 IgC1”、“B7-H3 IgV2”、“B7-H3 IgC2”、“B7-H3 IgC1-V2-C2”和“B7-H3 IgV2-C2”表示。

[0411] B7-H3 IgV1、B7-H3 IgC1、B7-H3 IgV2、B7-H3 IgC2、B7-H3 IgC1-V2-C2和B7-H3 IgV2-C2基因（它们每个被克隆在该载体中）的ORF区域的核苷酸序列分别由序列表中的SEQ ID NO: 20、22、24、26、28和30表示。此外，B7-H3 IgV1、B7-H3 IgC1、B7-H3 IgV2、B7-H3 IgC2、B7-H3 IgC1-V2-C2和B7-H3 IgV2-C2的氨基酸序列分别由序列表中的SEQ ID NO: 21、23、25、27、29和31表示。此外，由SEQ ID NO: 20和21表示的序列显示在图15中，由SEQ ID NO: 22和23表示的序列显示在图16中，由SEQ ID NO: 24和25表示的序列显示在图17中，由SEQ ID NO: 26和27表示的序列显示在图18中，由SEQ ID NO: 28和29表示的序列显示在图19中，且由SEQ ID NO: 30和31表示的序列显示在图20中。

[0412] 1)-3  B7家族基因的表达载体的制备

[0413] pCMV6-XL-4-B7RP-1、pCMV6-XL-4-B7-H1和pCMV6-XL-4-B7-DC (它们是通过将B7RP-1、B7-H1和B7-DC (它们是B7家族基因)中的每一个整合进表达载体pCMV6-XL-4中所得到的基因表达载体) 都购自OriGene, Inc。

[0414] 如下制备表达CD80、CD86和B7-H4（它们是B7家族基因）中的每一个的载体。

[0415] pENTR/221-CD80、pENTR/221-CD86和pENTR/221-B7-H4（它们是通过将CD80、CD86和B7-H4中的每一个整合进输入载体pENTR/221中所得到的克隆）购自Invitrogen Corporation。

[0416] 进行每个入门克隆（其序列经过证实）和pcDNA3.1-DEST (Invitrogen Corporation) 之间的Gateway LR反应。对于转化大肠杆菌DH10B以后得到的克隆，通过菌落PCR证实插入片段的大小。对于其中证实了插入片段的大小的每个克隆，分析在插入片段的3’末端和5’末端处的DNA序列，以证实目标插入片段被正确地插入。

[0417] B7RP-1、B7-H1、B7-DC、CD80、CD86和B7-H4基因（它们中的每一个被克隆在该载体中）的ORF区域的核苷酸序列分别由序列表中的SEQ ID NO: 32、34、36、38、40和42表示。此外，B7RP-1、B7-H1、B7-DC、CD80、CD86和B7-H4的氨基酸序列分别由序列表中的SEQ ID NO: 33、35、37、39、41和43表示。

[0418] 实施例2. 单克隆抗体的制备和抗体的筛选

[0419] 2)-1 免疫接种

[0420] 使用4-6周龄的BALB/cAnNCrlCrlj小鼠(Charles River Laboratories Japan, Inc.)、FcgRII KO小鼠(Taconic, Inc., IBL Co., Ltd.)或GANP小鼠(Transgenic, 6
Inc.)。在第0、7、15和24天，以5 x 10个细胞/小鼠的剂量，将用乙二胺四乙酸(Invitrogen Corporation)脱离的LNCaP细胞、MCF7细胞(ATCC)或AsPC1细胞(ATCC)皮下地施用至每只小鼠的背部区域。在第31天，以5 x 106个细胞的剂量，将相同细胞静脉内地施用给每只小鼠。
在第34天，从每只小鼠切离脾，并用于制备杂交瘤。

[0421] 2)-2  杂交瘤的制备

[0422] 使用PEG 4000 (IBL Co., Ltd.制造)，对脾细胞和小鼠骨髓瘤P3X63Ag8U.1细胞(ATCC) 进行细胞融合，由此制备杂交瘤。

[0423] 作为结果，建立下述克隆作为杂交瘤：得自被LNCaP细胞免疫的小鼠的9639个克隆，得自被MCF7细胞免疫的小鼠的4043个克隆，和得自被AsPC1细胞免疫的小鼠的3617个克隆。使用得到的每个杂交瘤的培养物上清液，通过CDC测定来筛选生产抗体的杂交瘤。

[0424] 2)-3  通过CDC测定来筛选抗体

[0425] 在第0天，将LNCaP细胞或MCF7细胞稀释至5000个细胞/80 μL，并将得到的溶液以80 μl/孔加给96-孔板。然后，将细胞培养过夜。以20 μl/孔，将杂交瘤培养物上清液加入接种了细胞的平板中，并将平板在4℃静置1小时。向稀释的且低压冻干的兔补体(Cedarlane Laboratories)中，将1 mL无菌水加入在冰上的每个瓶中，并将瓶静置1分钟，随后混合，然后将得到的混合物与19 mL 0.1% BSA/RPMI 1640培养基(BSA, Sigma Co., Ltd.)混合。使反应在37℃进行1小时。

[0426] 将平板在室温放置30分钟以恢复至室温。将120 μL CellTiter-Glo试剂(Promega Corporation) 加入每个孔中，并使反应在室温进行10分钟。使用平板读数器(ARVO HTS, PerkinElmer, Inc.)，测量发光的量。在表现出低发光的孔中，确定了补体依赖性的细胞死亡被诱导。选择这样的杂交瘤：其生产的培养物上清液诱导这类补体依赖性的细胞死亡。

[0427] 作为结果，通过筛选得到以下克隆作为阳性克隆：24个克隆得自从LNCaP免疫接种衍生出的克隆，36个克隆得自从MCF7免疫接种衍生出的克隆，且3个克隆得自从AsPC1免疫接种衍生出的克隆。

[0428] 实施例3. 抗原的鉴定

[0429] 3)-1  免疫沉淀的物质的鉴定

[0430] 3)-1-1  免疫沉淀

[0431] 以5-10 x 108个细胞，培养MCF7细胞。用细胞刮器使这些细胞脱离，并收集脱离的细胞，在-80℃冷冻保存。向冷冻保存的细胞中，加入10 ml被冷却至4℃的裂解缓冲液，其含有1% NP-40 (Sigma-Aldrich Co., Ltd.)和蛋白酶抑制剂(F. Hoffmann-La Roche, Ltd.)，并用移液器在冰上以避免气泡形成的方式裂解细胞沉淀物。在完全裂解以后，将沉淀物在冰上放置30分钟。将溶解的样品在10000-15000 rpm在4℃离心20分钟，并将得到的上清液转移至15 ml Falcon试管。

[0432] 将500 μl蛋白G-Sepharose 4FF珠子(Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd.) 洗涤3次，并用裂解缓冲液进行缓冲液更换。将500 μl蛋白G-Sepharose 4FF珠子加入在冰上的溶解的样品上清液中，并将得到的混合物在4℃旋转搅拌过夜。

[0433] 使样品穿过Poly-Prep色谱柱(Bio-Rad Laboratories, Inc.)，并将穿过的级分用作免疫沉淀样品。

[0434] 将3 μg要用于免疫沉淀的抗体溶液加给50 μl用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行了缓冲液更换的蛋白G-Sepharose 4FF珠子(1.5 ml试管)，并将得到的混合物在4℃旋转搅拌1-16小时，由此使抗体与珠子结合。向免疫沉淀样品中，加入结合了抗体的珠子，并将得到的混合物在4℃旋转搅拌3小时。

[0435] 将柱转移至空15 ml Falcon试管，并向其中加入6.5 ml裂解缓冲液。将该操作重复4次。

[0436] 将柱的出口盖上帽，并用500 μl裂解缓冲液执行移液，将珠子收集在1.5 ml试管中。将该操作重复2次。

[0437] 在5000 rpm在4℃离心1分钟以后，小心地除去上清液。然后，向其中加入90 μl洗脱缓冲液(10 mM甘氨酸-HCl, pH 2.0)，随后涡旋和离心。分离1.5 ml旋转柱的柱，并向其中加入10 μl 1 M Tris-HCl (pH 8.5)，将柱返回原始位置。向其中转移洗脱级分，并在10000 rpm离心1分钟，由此得到100 μl样品。

[0438] 通过如以下3)-1-2所示的液相消化技术，对得到的样品进行MS分析。

[0439] 3)-1-2  通过质谱法分析来鉴定抗原

[0440] 根据常规方法，通过加入从液相消化技术得到的胰蛋白酶(改性的胰蛋白酶, Promega Corporation)，将通过免疫沉淀方法得到的级分在37℃进行消化反应16小时。对得到的经消化的肽进行液相色谱法(LC)/串联质谱法(MS/MS) (Thermo Fisher Scientific K.K.)。使用数据库检索软件(Mascot, Matrix Science K.K.)，分析得到的质谱数据。使用International Protein Index (IPI)作为数据库。作为结果，鉴定出34类抗原。

[0441] 从鉴定的抗原的特征，执行著录信息检索，基于此，B7-H3为细胞膜蛋白，并通过聚焦于B7-H3 (CD276) 抗原(B7-H3变体1)，执行在以下3)-2和3)-3中描述的实验。

[0442] 3)-2  表达抗原基因的细胞的制备

[0443] 以5 x 104个细胞/cm2，将NIH-3T3细胞(ATCC) 接种在胶原I型包被的烧瓶(IWAKI Co., Ltd.制造)中，并在37℃和5% CO2条件下在含有10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培养基(Invitrogen Corporation)中培养过夜。

[0444] 次日，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen Corporation)，用以下的每一种转染NIH-3T3细胞：在实施例1)-1-1中制备的pcDNA3.1-B7-H3，在1)-1-2中制备的pcDNA-DEST40-B7-H3变体2，和作为空载体的pcDNA-DEST40，并在37℃和5% CO2条件下进一步培养过夜。

[0445] 次日，用胰蛋白酶处理转染的NIH-3T3细胞，并用含有10% FBS的DMEM洗涤，此后悬浮于含有5% FBS的PBS中。将如此得到的细胞混悬液用于流式细胞计数分析。

[0446] 3)-3  流式细胞计数分析

[0447] 通过流式细胞计数法，证实由杂交瘤生产的抗体对B7-H3的结合特异性，所述抗体将通过MS鉴定的B7-H3变体1免疫沉淀。将在实施例3)-2中制备的细胞混悬液离心，并取出上清液。然后，将杂交瘤培养物上清液加给用每种载体转染的NIH-3T3细胞以悬浮所述细胞，并将细胞在4℃静置1小时。

[0448] 在用含有5% FBS的PBS洗涤细胞2次以后，向其中加入荧光素缀合的山羊IgG级分和小鼠IgG (完整分子) (ICN Pharmaceuticals, Inc.制造, #55493) （用含有5% FBS的PBS稀释至1000倍）以悬浮所述细胞，并将细胞在4℃静置1小时。

[0449] 在用含有5% FBS的PBS洗涤细胞2次以后，将细胞再悬浮于补充了2 μg/ml 7-氨基放线菌素D (Invitrogen Corporation (Molecular Probes)制造)的、含有5% FBS的PBS中，并使用流式细胞计(FC500, Beckman Coulter, Inc.)执行检测。使用Flowjo (Tree Star, Inc.)分析数据。

[0450] 使用闸门排除7-氨基放线菌素D-阳性的死细胞。然后，建立活细胞的FITC荧光强度直方图。

[0451] 选择生产这样的样品的杂交瘤作为生产抗-B7-H3抗体的杂交瘤：与在用作对照的空载体转染的NIH-3T3细胞的荧光强度直方图中相比，所述样品在表达B7-H3变体1的NIH-3T3细胞和表达B7-H3变体2的NIH-3T3细胞的荧光强度直方图中产生更高的荧光强度。

[0452] 作为结果，发现了源自5个克隆(L7、L8、L11、M30和M31) 的生产抗-B7-H3抗体的杂交瘤的抗体与B7-H3变体1和B7-H3变体2具有交叉反应性。

[0453] 3)-4  单克隆抗体与癌细胞系的结合特性的确认

[0454] 以与实施例3)-3中相同的方式，通过流式细胞计数法，检验在实施例3)-3中证实了结合B7-H3变体1和B7-H3变体2的单克隆抗体是否结合过表达B7-H3变体1和B7-H3变体2的癌细胞。

[0455] 使用人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231) (ATCC)和人肺癌细胞系(NCI-H322) (ATCC) 替代转染的NIH-3T3细胞。作为结果，证实了建立的单克隆抗体都结合这些癌细胞系。

[0456] 3)-5  单克隆抗体的同种型确定

[0457] 使用小鼠单克隆同种型分型试剂盒(Serotec Co., Ltd.制造)，确定了单克隆抗体的同种型。作为结果，源自生产抗-B7-H3抗体的杂交瘤(L7、L8、L11、M30和M31)的抗体的同种型都被确定为IgG2a。

[0458] 3)-6  单克隆抗体的制备

[0459] 从植入了杂交瘤或杂交瘤培养物上清液的小鼠的腹水(在下文中，被称作“用于抗体纯化的起始原料”)，纯化单克隆抗体。

[0460] 如下制备小鼠腹水。首先，用姥鲛烷(Sigma Co., Ltd.制造)处理7-8周龄的BALB/7
cAJcl-nu/nu (CLEA JAPAN, Inc.)小鼠，并在约3周后，以1 x 10 个细胞/小鼠，将生理盐水洗涤过的杂交瘤植入腹腔内。1-2周后，收集在腹腔中积累的腹水，并穿过0.22 μm过滤器灭菌，将得到的材料用作用于抗体纯化的起始原料。

[0461] 使用CELLine (BD Biosciences, Inc.制造)制备杂交瘤培养物上清液。根据生产商的方案进行培养，但是使用ClonaCell-HY Growth Medium E (StemCell Technologies, Inc.制造, #03805)作为培养基。将收集的培养物上清液穿过0.45 μm过滤器过滤，并将得到的材料用作用于抗体纯化的起始原料。

[0462] 用通过将重组蛋白A rPA50 (RepliGen Corporation制造) 固定化在Formyl-Cellulofine (Seikagaku Corporation制造) (在下文中缩写为“Formyl-Cellulofine蛋白A”)或Hitrap MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation制造)上所得到的亲和柱纯化抗体。在Formyl-Cellulofine 蛋白A的情况下，用结合缓冲液(3 M NaCl, 1.5 M甘氨酸, pH 8.9)将用于抗体纯化的起始原料稀释至3倍，并将得到的溶液加入柱，然后，用结合缓冲液洗涤柱，随后用0.1 M柠檬酸(pH 4.0)洗脱。另一方面，在Hitrap MabSelect SuRe (GE Healthcare Corporation)的情况下，将用于抗体纯化的起始原料加入柱，并用PBS洗涤柱，随后用2 M精氨酸-HCl (pH 4.0)洗脱。

[0463] 在中和洗脱的抗体溶液以后，用PBS更换缓冲液。

[0464] 如下得到抗体的浓度：洗脱与POROS G 20 μm柱PEEK, 4.6 mm×100 mm, 1.7 ml (Applied Biosystems, Inc.)结合的抗体，并测量洗脱液的吸光度(O.D. 280 nm)。具体地，将用PBS稀释过的抗体样品加入用平衡缓冲液(30.6 mM十二水合磷酸二氢钠, 19.5 mM磷酸一钾, 0.15 M NaCl, pH 7.0)平衡的POROS G 20 μm。然后，用平衡缓冲液洗涤柱，然后用洗脱液(0.1% (v/v) HCl, 0.15 M NaCl)洗脱与柱结合的抗体。测量洗脱液的吸光度(O.D. 280 nm)的峰面积，并根据下述方程式计算浓度：

[0465] 抗体样品的浓度(mg/ml) = (抗体样品的峰面积)/(参比标准(人IgG1)的峰面积) ×参比标准的浓度(mg/ml) ×样品的稀释因子。

[0466] 此外，使用Endospecy ES-50M Set (Seikagaku Corporation, #020150)和内毒素参比标准CSE-L Set (Seikagaku Corporation, #020055)，测量在得到的抗体中含有的内毒素的浓度，并证实为1 EU/mg或更低。在随后的实验中使用得到的抗体。

[0467] 实施例4. 抗-B7-H3抗体的性能

[0468] 4)-1 ADCP活性

[0469] 将1.5 mL硫胶质施用给Balb/c-nu/nu小鼠(雌性，6-10周龄) (Charles River Laboratories Japan, Inc.)的腹腔。此后5天，从腹腔收集巨噬细胞。将巨噬细胞以500 μL/孔(1 x 105个细胞/孔)加给24-孔板，并在37℃培养过夜。将如此制备的巨噬细胞用作效应细胞。

[0470] 使用PKH26染料标记试剂盒(Sigma Co., Ltd.)，进行要用作靶细胞的NCI-H322细胞的标记。用TrypLE (Invitrogen Corporation)脱离靶细胞，并用PBS洗涤2次。以1 x 107个细胞/ml，将细胞悬浮于稀释剂C中。用稀释剂C将PKH26染料储备液(1 mM)稀释至8 μM，并在此后立即向其中加入稀释的染料溶液，其量等于细胞混悬液的量。将得到的混合物在室温放置5分钟。然后，向其中加入1 ml血清并进一步向其中加入含血清的培养基，并洗涤2次。将如此制备的细胞用作靶细胞。

[0471] 用培养溶液将在实施例3)-6中得到的抗体稀释至20 μg/ml。随后，以2 x 106个细胞/100 μl/试管，分配在实施例4)-1-1中得到的靶细胞，并混合。将得到的混合物在冰上静置30分钟。除去上清液，并用培养溶液洗涤细胞2次，悬浮于500 μl培养溶液中。从效应细胞除去上清液，向其中加入已经用抗体处理过并悬浮于培养溶液中的细胞，并与其混合。然后，将细胞在CO2培养箱中培养3小时。此后，用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱离，并收集。向收集的细胞中，加入FITC标记的抗-小鼠CD11b抗体(Becton, Dickinson and Company, Ltd.)，并将得到的混合物在冰上静置30分钟。除去上清液，并用培养溶液洗涤细胞2次。将收集的细胞悬浮于300 μl培养溶液，并通过FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.)进行分析。在CD11b-阳性的巨噬细胞中，将PKH26-阳性的级分评价为吞噬阳性的细胞(n=3)。

[0472] 作为结果，如图1所示，L7、L8、L11、M30和M31会诱导巨噬细胞对NCI-H322细胞的吞噬，以分别产生48.0±0.9%、52.3±1.1%、57.1±2.5%、61.9±2.1%和57.7±3.0%的吞噬百分比。因此，证实了L7、L8、L11、M30和M31抗体具有针对NCI-H322细胞的ADCP活性。

[0473] 以相同的方式，得到商购可得的抗-B7-H3抗体，并测量其ADCP活性。得到大鼠抗-人B7-H3抗体MIH35 (eBioscience Company)、小鼠抗-人B7-H3抗体185504 (R&D Systems, Inc.)、MIH42 (Serotec Co., Ltd.)和DCN70 (Biolegend Company)。证实了这些抗体以与实施例3)-3中相同的方式结合B7-H3。使用这些抗体，通过上述方法测量ADCP活性。

[0474] 作为结果，如图2所示，当以1 μg/ml加入时，MIH35、MIH42和DCN70会诱导巨噬细胞对NCI-H322细胞的吞噬，以分别产生4.2%、8.2%和10.8%的吞噬百分比。因此，揭示了MIH35、MIH42和DCN70几乎没有表现出ADCP活性。

[0475] 这些结果证实了通过筛选得到的识别B7-H3的M30克隆具有比商购可得的B7-H3抗体显著更高的ADCP活性。

[0476] 4)-2  ADCC活性

[0477] 4)-2-1  效应细胞的制备

[0478] 从裸鼠CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj (Charles River Laboratories Japan, Inc.)无菌地切离脾。用2个载物玻璃片将切离的脾匀浆化，并使用BD Pharm Lyse (BD Biosciences Ltd.制造，#555899)进行溶血处理。将如此得到的脾细胞悬浮于含有10% 胎牛血清、Ultra-low IgG (Invitrogen Corporation制造) 的、不含酚红的RPMI 1640 (Invitrogen Corporation制造)(在下文中缩写为“ADCC培养基”)中，并使细胞混悬液穿过细胞过滤网(孔径: 40 μm, BD Biosciences, Ltd.制造)。然后，通过台盼蓝染料排除测定来计数活细胞。在将脾细胞混悬液离心以后，除去培养基，并将细胞以1.5 x 107个细胞/ml的活细胞密度再悬浮于ADCC培养基中，并用作效应细胞。

[0479] 4)-2-2  靶细胞的制备

[0480] 用胰蛋白酶处理以与实施例3)-3中相同的方式制备的表达B7-H3的293细胞(ATCC)和空载体转染的293细胞，并用含10% FBS的RPMI 1640 (Invitrogen Corporation)6
洗涤处理过的每类细胞，然后再悬浮于含10% FBS的RPMI 1640中。将每类细胞(4 x 10 细胞)与穿过0.22 μm过滤器灭菌的铬-51 (5550 kBq)混合，并在37℃和5% CO2条件下标记1小时。将经标记的细胞用含10% FBS的RPMI 1640 (Invitrogen Corporation)洗涤3次，并将细胞以2 x 105个细胞/ml再悬浮在ADCC培养基中，并用作靶细胞。

[0481] 4)-2-3  51Cr释放测定

[0482] 以2 x 105个细胞/ml的细胞密度，以50 μl/孔，将靶细胞分配在96-孔U形底微量培养板中。向其中加入50 μl M30或同种型对照抗体(mIgG2a) (eBioscience Company)，用ADCC培养基稀释，使得加入效应细胞以后的抗体终浓度为2.5 μg/ml。然后，将平板在4℃静置1小时。此后，以1.5 x 107个细胞/ml的细胞密度，向其中加入100 μl效应细胞，并将细胞在37℃和5% CO2条件下培养过夜。次日，将上清液收集在LumaPlate (PerkinElmer, Inc.制造)中，并使用γ计数器测量从其中发射的γ辐射。根据下述方程式，计算由ADCC活性造成的细胞裂解百分比。

[0483] 细胞裂解百分比(%) = (A-B)/(C-B) x 100

[0484] A: 得自样品孔的辐射计数

[0485] B: 平均自发辐射发射计数(得自未向其中加入抗体和效应细胞的孔) (n=3)。进行与样品孔相同的操作，但是在加入抗体时加入50 μl量的ADCC培养基，并在加入效应细胞时加入100 μl量的ADCC培养基。

[0486] C: 平均最大辐射发射计数(得自在其中用表面活性剂溶解靶细胞的孔) (n=3)。进行与样品孔相同的操作，但是在加入抗体时加入50 ml ADCC培养基，并在加入效应细胞时加入100 ml含有2% (v/v) Triton X-100的ADCC培养基。

[0487] 显示的数据是一式三份测量结果的平均值，且误差棒代表标准差。使用学生t-检验来计算P值。测量结果显示在图3中。

[0488] 作为结果，M30表现出细胞裂解活性，对表达B7-H3的293细胞的细胞裂解百分比为31.6±3.3%，并因此证实了M30抗体具有针对表达B7-H3的293细胞的ADCC活性。

[0489] 4)-3  CDC活性

[0490] 以与实施例2)-3中相同的方式进行实验。使用NCI-H322细胞作为用于评价的细胞。加入用含10% FBS的RPMI 1640 (含有抗生素：青霉素和链霉素) 稀释的在实施例3)-6中得到的每种抗-B7-H3抗体(L7、L8、L11、M30和M31) 和同种型对照抗体(mIgG2a)，使得加入补体以后的抗体终浓度为25 μg/ml，并将得到的混合物在4℃静置1小时。向其中加入用RPMI 1640稀释至30% 的兔补体(Cedarlane Laboratories制造, #CL3051)，使得补体的终浓度为5%，并将得到的混合物在37℃和5% CO2条件下温育1小时。然后，将混合物在室温静置30分钟。为了测量细胞生存力，向其中加入CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay (Promega Corporation制造)，其量等于培养溶液的量，并将得到的混合物在室温搅拌10分钟。此后，使用平板读数器测量发光的量。根据下述方程式计算细胞生存力。

[0491] 细胞生存力(%) = (a-b)/(c-b) x 100

[0492] a：得自样品孔的发光的量

[0493] b：背景的平均发光量(得自未向其中加入细胞和抗体的孔) (n=3)。进行与样品孔相同的操作，但是在细胞接种时加入等量的含10% FBS的RPMI 1640 (含有抗生素：青霉素和链霉素)来替代细胞混悬液，并在加入抗体时加入含10% FBS的RPMI 1640 (含有抗生素：青霉素和链霉素)，其量等于抗体稀释溶液的量。

[0494] c：得自未向其中加入抗体的孔的平均发光量(n=3)。进行与样品孔相同的操作，但是在加入抗体时加入含10% FBS的RPMI 1640 (含有抗生素：青霉素和链霉素)，其量等于抗体稀释溶液的量。

[0495] 测量结果显示在图4中。显示的数据是一式三份测量结果的平均值，误差棒代表标准差。作为结果，在有补体存在下，对照抗体L7、L8、L11、M30和M31分别诱导NCI-H322细胞的细胞生存力下降至101.5±3.3%、6.3±4.2%、13.6±9.1%、7.2±1.4%、7.5±1.8%和12.8±2.0%。因此，证实了L7、L8、L11、M30和M31抗体具有针对NCI-H322细胞的CDC活性。

[0496] 4)-4  结合结构域的确定

[0497] 以与实施例3)-3中相同的方式，通过流式细胞计数法检验了M30结合B7-H3的哪个结构域。使用NIH-3T3细胞，其被在实施例1)-1-3中制备的B7-H3部分蛋白的每种表达载体转染。

[0498] 作为结果，如图5所示，证实了M30结合B7-H3 IgC1、B7-H3 IgC2、B7-H3 IgC1-V2-C2和B7-H3 IgV2-C2。M30不会结合B7-H3 IgV1和B7-H3 IgV2。

[0499] 这些结果证实了M30结合B7-H3的C1结构域(由SEQ ID NO: 6中的氨基酸编号140-244表示的氨基酸序列)和C2结构域(由SEQ ID NO: 6中的氨基酸编号358-456表示的氨基酸序列)。以相同的方式，还证实了L8、L11和M31结合C1结构域和C2结构域，且L7结合V1结构域(由SEQ ID NO: 6中的氨基酸编号27-139表示的氨基酸序列)和V2结构域(由SEQ ID NO: 
6中的氨基酸编号245-357表示的氨基酸序列)。

[0500] 因此，证实了M30识别IgC1结构域和/或IgC2结构域（其中的每一个是在B7-H3细胞外结构域中的结构域）中的表位，并且结合IgC1结构域或IgC2结构域或二者。

[0501] 4)-5  抗原特异性

[0502] 以与实施例3)-3中相同的方式，通过流式细胞计数法检验了M30的抗原特异性。

[0503] 使用293T细胞，其被在实施例1)-1-4中制备的CD80、CD86、B7-RP-1、B7-H1、B7-DC和B7-H4蛋白（它们是B7家族蛋白）的每种表达载体转染。

[0504] 作为结果，证实了M30不会结合作为B7家族分子的CD80、CD86、B7-RP-1、B7-H1、B7-DC和B7-H4。

[0505] 实施例5. 体内抗肿瘤作用

[0506] 5)-1  抗-B7-H3抗体的体内抗肿瘤作用

[0507] 通过胰蛋白酶处理，使NCI-H322细胞脱离培养瓶，然后悬浮于含10% FBS的RPMI 1640 (Invitrogen Corporation)中，随后离心，并除去上清液。用相同的培养基洗涤细胞2次，然后悬浮于生理盐水(Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.制造)中。然后，以1 x 107个细胞/小鼠的剂量，将所述细胞皮下地植入6周龄的BALB/cAJcl-nu/nu (CLEA JAPAN, Inc.)小鼠组中的每只小鼠的腋窝区域中。将植入当天视作第0天，在第10、17、24、31和38天，以500 μg/小鼠(约25 mg/kg)的剂量腹膜内地施用L7、L8、L11、M30和M31抗体中的每一种。给对照组腹膜内地施用与抗体等体积(500 μl) 的PBS。在第10、17、24、31、38和45天测量肿瘤体积，并检查抗体的施用的抗肿瘤作用。

[0508] 作为结果，在M30和M31施用组中，与PBS施用组相比，肿瘤生长受到显著抑制(在第45天，以肿瘤体积的方式，M30和M31相对于PBS施用组的P值分别为P<0.05和P<0.01。使用学生t-检验计算所述P值)。此外，在L7、L8、L11、M30和M31的情况下，在第45天的肿瘤生长抑制率(= 100 - (抗体施用组中的平均肿瘤体积)/(PBS施用组中的平均肿瘤体积) x 100)分别为-16.1%、0.2%、25.5%、47.2%和58.2%。因此，观察到M30和M31抗体具有非常强的体内抗肿瘤作用(图6)。

[0509] 上面的结果揭示了M30和M31抗体是识别B7-H3抗原并表现出抗肿瘤作用的抗体。

[0510] 5)-2  在巨噬细胞除尽条件下的体内抗肿瘤作用

[0511] 为了除尽体内巨噬细胞，制备了氯膦酸盐包囊的脂质体。已经报道，通过在体内施用氯膦酸盐包囊的脂质体来除尽体内巨噬细胞(Journal of immunological methods 1994, 第174卷, 第83-93页)。根据在该报道中的方法，在下述实验中制备和使用氯膦酸盐包囊的脂质体。

[0512] 通过胰蛋白酶处理，使NCI-H322细胞脱离培养瓶，然后悬浮于含10% FBS的RPMI 1640 (Invitrogen Corporation)中，随后离心，并除去上清液。用相同的培养基洗涤细胞2次，然后悬浮于生理盐水(PBS，Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.制造)中。然后，以1 x 
7
10 个细胞/小鼠的剂量，将所述细胞皮下地植入每只6周龄的BALB/cAJcl-nu/nu (CLEA JAPAN, Inc.) 小鼠的腋窝区域中。将植入当天视作第-14天，在第0天进行分组。

[0513] 在要除尽小鼠的体内巨噬细胞的组中，在第0、4、7、11、14、18、21、25、28和32天，以0.2 mL/小鼠的剂量，静脉内地注射氯膦酸盐包囊的脂质体。此外，在阴性对照组中，在相同天(第0、4、7、11、14、18、21、25、28和32天)以0.2 mL/小鼠的剂量静脉内地注射PBS[0514] 随后，在第1、8、15、22和29天，将M30抗体以500 μg/小鼠(约25 mg/kg) 的剂量腹膜内地施用给两个组。此外，作为阴性对照，在相同天(第1、8、15、22和29天)，给两个组腹膜内地施用PBS，以等于M30抗体体积的体积(500 μl) 。

[0515] 在第0、8、15、22、29和36天，测量肿瘤体积，并检验抗体的施用的抗肿瘤作用(n=8)。

[0516] 结果显示在表1和表2和图7中。

[0517] [表1]

[0518]

[0519] 与充当阴性对照的PBS静脉内施用+ PBS腹膜内施用(PBS + PBS施用组)组相比，在PBS静脉内施用+ M30抗体腹膜内施用(PBS + M30施用组)组中，肿瘤生长受到显著抑制。更具体地讲，在第36天，以肿瘤体积的方式，PBS + M30施用组相对于PBS + PBS施用组的P值为P<0.05 (使用学生t-检验来计算P值)。此外，在第36天的肿瘤生长抑制率(= 100 - (在PBS + M30施用组中的平均肿瘤体积)/(在PBS + PBS施用组中的平均肿瘤体积) x 
100) 为49.8% (表2)。

[0520] 另一方面，在氯膦酸盐包囊的脂质体静脉内施用+ PBS腹膜内施用(Clod lip + PBS施用组)组和氯膦酸盐包囊的脂质体静脉内施用+ M30抗体腹膜内施用(Clod lip + M30施用组)组中，没有观察到肿瘤生长的抑制。更具体地讲，在第36天，以肿瘤体积的方式，Clod lip + PBS施用组和Clod lip + M30施用组相对于PBS + PBS施用组的P值分别为P=0.52和P=1(使用学生t-检验来计算P值)。此外，在第36天的肿瘤生长抑制率(= 100 - (在Clod lip + PBS施用组或Clod lip + M30施用组中的平均肿瘤体积)/(在PBS + PBS施用组中的平均肿瘤体积) x 100) 分别为-21.2%和-1.4% (表2)。

[0521] [表2] 肿瘤生长抑制率(%) 在第8天 在第15天 在第22天 在第29天 在第36天
Clod lip + PBS施用组 -6.6 -39.4 -12.6 -3.5 -21.2
PBS + M30施用组 17.5 36.4 52.8 49.7 49.8
Clod lip + M30施用组 3.2 -8.6 2.6 -6.6 -1.4

[0522] 以上结果证实了通过施用氯膦酸盐包囊的脂质体来抑制M30抗体的抗肿瘤作用，并因此揭示了M30抗体的抗肿瘤作用主要是由巨噬细胞介导的作用。

[0523] 实施例6. 小鼠抗体M30 cDNA的克隆和序列的确定

[0524] 6)-1  小鼠抗体M30的重链和轻链的N-端氨基酸序列的确定

[0525] 为了确定小鼠抗体M30的重链和轻链的N-端氨基酸序列，通过SDS-PAGE，分离在实施例3)-6中纯化的小鼠抗体M30。分离以后，将凝胶中的蛋白从凝胶转移至PVDF膜(孔径: 0.45 μm, Invitrogen Corporation制造)。将膜用洗涤缓冲液(25 mM NaCl, 10 mM硼酸钠缓冲液pH 8.0)洗涤，此后如下染色：浸入染料溶液(50% 甲醇、20% 乙酸、0.05% 考马斯亮蓝)中保持5分钟，随后用90% 甲醇脱色。切离在PVDF膜上显影的与重链对应的带部分(具有较小迁移率的带)和与轻链对应的带部分(具有较大迁移率的带)。

[0526] 将与轻链对应的带部分在少量0.5% 聚乙烯吡咯烷酮/100 mM乙酸溶液中在37℃温育30分钟，随后用水充分洗涤。随后，将改性的N-末端残基用Pfu 焦谷氨酸氨基酞酶试剂盒 (TaKaRa Bio, Inc.)除去，随后用水洗涤并风干。然后，使用Procise (注册商标) cLC Protein Sequencer Model 492cLC (Applied Biosystems, Inc.)，尝试通过自动的Edman方法鉴定它们各自的N-端氨基酸序列(参见Edman等人(1967) Eur. J. Biochem. 1, 80)。

[0527] 作为结果，与小鼠抗体M30的重链对应的带的N-端氨基酸序列被确定为EVQLQQSGPE (序列表中的SEQ ID NO: 44)，与其轻链对应的带的N-端氨基酸序列被确定为IVLSQSPTILSASP (序列表中的SEQ ID NO: 45)。

[0528] 6)-2  从生产小鼠抗体M30的杂交瘤制备mRNA

[0529] 为了克隆编码小鼠抗体M30的重链和轻链各自的cDNA，使用Quick Prep mRNA纯化试剂盒(GE Healthcare Corporation)，从生产小鼠抗体M30的杂交瘤制备mRNA。

[0530] 6)-3  小鼠抗体M30 cDNA的克隆和序列的确定

[0531] 参考下述发现：小鼠抗体M30的重链和轻链的同种型是在实施例3)-5中发现的γ2a和κ，和在实施例1-1)中确定的重链和轻链的N-端氨基酸序列，和抗体的氨基酸序列的数据库(参见Kabat, E. A. 等人, (1991)，见：Sequences of Proteins of Immunological Interest第I卷和第II卷，美国卫生和人类服务部)，合成了几种与抗体基因编码区的5’-端区域及其包含终止密码子的3’-端区域各自杂交的寡核苷酸引物，并使用在实施例6-2)中制备的mRNA和TaKaRa One Step RNA PCR试剂盒(AMV) (TaKaRa Bio, Inc.)，扩增编码重链的cDNA和编码轻链的cDNA。作为结果，通过下述引物集合，扩增编码抗体重链的cDNA和编码抗体轻链的cDNA。

[0532] 用于重链的引物集合

[0533] 引物16

[0534] 5’-aagaattcatggaatggagttggata-3’(序列表中的SEQ ID NO: 46)

[0535] 引物17

[0536] 5’-aagatatctcatttacccggagtccgggagaa-3’(序列表中的SEQ ID NO: 47)[0537] 用于轻链的引物集合

[0538] 引物18

[0539] 5’-aagaattcatggattttctggtgcag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 48)

[0540] 引物19

[0541] 5’-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3’(序列表中的SEQ ID NO: 49)[0542] 使用pEF6/V5-His TOPO TA Expression Kit (Invitrogen Corporation)，克隆通过PCR法扩增的每个编码重链的cDNA和编码轻链的cDNA，并使用基因序列分析仪(“ABI PRISM 3700 DNA Analyzer; Applied Biosystems”或“Applied Biosystems 3730xl Analyzer; Applied Biosystems”)，确定每个克隆的重链和轻链的核苷酸序列。在测序反应中，使用GeneAmp 9700 (Applied Biosystems, Inc.)。

[0543] 确定的编码小鼠抗体M30的重链的cDNA的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 50表示，其氨基酸序列由SEQ ID NO: 51表示。此外，SEQ ID NO: 50和51的序列显示在图21中。

[0544] 确定的编码小鼠抗体M30的轻链的cDNA的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 52表示，其氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO: 53表示。SEQ ID NO: 52和53的序列显示在图22中。

[0545] 此外，通过使用KabatMan (参见PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 25 (1996), 130-133)进行比较，分析了重链和轻链的氨基酸序列，所述KabatMan是抗体的氨基酸序列的数据库。作为结果，发现在小鼠抗体M30的重链中，由序列表中的SEQ ID NO: 51的氨基酸编号20-141表示的氨基酸序列是可变区。还发现，在小鼠抗体M30的轻链中，由序列表中的SEQ ID NO: 53的氨基酸编号23-130表示的氨基酸序列是可变区。

[0546] 实施例7. 嵌合抗体M30 (cM30抗体)的制备

[0547] 7)-1  嵌合的和人源化的轻链表达载体pEF6KCL的构建

[0548] 使用质粒pEF6/V5-HisB (Invitrogen Corporation)作为模板，并还使用下述引物进行PCR，得到紧邻在BGHpA (序列位置: 2174) 至SmaI (序列位置: 2958) 下游的DNA片段(含有f1复制起点和SV40启动子和起点的DNA片段，在下文中称作“片段A”)：

[0549] 引物20

[0550] 5’-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3’(序列表中的SEQ ID NO: 54)

[0551] 引物21

[0552] 5’-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3’(序列表中的SEQ ID NO: 55)

[0553] 通过重叠延伸PCR，将得到的片段A和含有编码人κ链分泌信号、人κ链恒定区和人聚腺苷酸额外信号的DNA序列的DNA片段(SEQ ID NO: 56，在下文中称作“片段B”，SEQ ID NO: 56的序列也显示在图23中)彼此连接。用限制性酶KpnI和SmaI消化如此得到的其中将片段A和片段B彼此连接的DNA片段，将其连接到用限制性酶KpnI和SmaI消化的质粒pEF6/V5-HisB (Invitrogen Corporation) 上，由此构建嵌合的和人源化的轻链表达载体pEF6KCL，其具有信号序列、克隆位点、人κ链恒定区和和在EF1启动子下游的人聚腺苷酸额外信号序列。

[0554] 7)-2  pEF1KCL的构建

[0555] 通过用限制性酶KpnI和SmaI切割由上述方法得到的pEF6KCL，得到DNA片段，将其连接到用KpnI和SmaI消化的pEF1/myc-HisB (Invitrogen Corporation)上，由此构建质粒pEF1KCL。

[0556] 7)-3  嵌合的和人源化的重链表达载体pEF1FCCU的构建

[0557] 用限制性酶NheI和PmeI消化含有编码人IgG1信号序列和恒定区的氨基酸序列的DNA序列的DNA片段(SEQ ID NO: 57，SEQ ID NO: 57的序列也显示在图24中)，并连接到用NheI和PmeI消化的质粒pEF1KCL上，由此构建嵌合的和人源化的重链表达载体pEF1FCCU，其具有信号序列、克隆位点、人重链恒定区和在EF1启动子下游的人聚腺苷酸额外信号序列。

[0558] 7)-4  M30嵌合体-型轻链表达载体的构建

[0559] 使用编码小鼠抗体M30的轻链的cDNA作为模板，并且还使用KOD-Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.)和下述引物集合，扩增包含编码轻链可变区的cDNA的区域。将通过用限制性酶NdeI和BsiWI切割扩增产物所得到的DNA片段插入通用的嵌合和人源化抗体轻链表达载体(pEF6KCL)中的经限制性酶NdeI和BsiWI切割的位点处，由此构建M30嵌合体-型轻链表达载体。将如此得到的表达载体命名为“pEF6KCL/M30L”。M30嵌合体-型轻链的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 58表示，且其氨基酸序列由SEQ ID NO: 59表示。SEQ ID NO: 58和59的序列显示在图25中。此外，在由序列表中的SEQ ID NO: 59表示的cM30抗体轻链氨基酸序列的位置128处的苏氨酸残基是位于轻链可变区的羧基端，且对应于由序列表中的SEQ ID NO: 53表示的M30抗体轻链的氨基酸序列的位置130处的丙氨酸残基，但是，在由SEQ ID NO: 59表示的氨基酸序列中，所述残基已经被源自人抗体轻链的苏氨酸残基取代。

[0560] 用于轻链的引物集合

[0561] 引物22

[0562] 5’-aaacatatggccaaattgttctctcccagtctccaacaatcc-3’(序列表中的SEQ ID NO: 60)

[0563] 引物23

[0564] 5’-aaacgtacgtttcagctccagcttggtcccagtaccg-3’(序列表中的SEQ ID NO: 61)[0565] 7)-5  M30嵌合体-型重链表达载体的构建

[0566] 使用编码小鼠抗体M30的重链的cDNA作为模板，使用下述引物集合C，通过重叠延伸PCR将使用KOD-Plus- (TOYOBO, Co., Ltd.)和下述引物集合A进行PCR得到的DNA片段连接至使用下述引物集合B进行PCR所得到的DNA片段，由此除去可变区中的BlpI，并且还扩增包含编码重链可变区的cDNA的区域。将通过用限制性酶BlpI切割扩增产物所得到的DNA片段插入通用的嵌合和人源化抗体重链表达载体(pEF1FCCU) 中的经限制性酶BlpI切割的位点处，由此构建M30嵌合体-型重链表达载体。将如此得到的表达载体命名为“pEF1FCCU/M30H”。

[0567] M30嵌合体-型重链的核苷酸序列由序列表中的SEQ ID NO: 62表示，且其氨基酸序列由SEQ ID NO: 63表示。此外，SEQ ID NO: 62和63的序列显示在图26中。

[0568] 引物集合A

[0569] 引物24

[0570] 5’-aaagctgagcgaggtccagctgcagcagtctggacctgag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 64)

[0571] 引物25

[0572] 5’-gaggtcaggctgctgagttccatgtaggctgtgctg-3’(序列表中的SEQ ID NO: 65)[0573] 引物集合B

[0574] 引物26

[0575] 5’-cagcacagcctacatggaactcagcagcctgacctc-3’(序列表中的SEQ ID NO: 66)[0576] 引物27

[0577] 5’-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 67)

[0578] 引物集合C

[0579] 引物28

[0580] 5’-aaagctgagcgaggtccagctgcagcagtctggacctgag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 68)

[0581] 引物29

[0582] 5’-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccag-3’(序列表中的SEQ ID NO: 69)

[0583] 7)-6  嵌合抗体M30的制备

[0584] 7)-6-1  嵌合抗体M30的制备

[0585] 将处于对数生长期的FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corporation)的1.2×109个细胞接种进1.2 L新鲜FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corporation)中，并在8% CO2培养箱中在37℃在90 rpm振荡培养1小时。将3.6 mg聚乙烯亚胺(Polyscience #
24765) 溶解在20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corporation)中。随后，将用PureLink HiPure Plasmid Kit (Invitrogen Corporation)制备的pEF1FCCU/M30H (0.4 mg)和pEF6KCL/M30L (0.8 mg) 悬浮于20 ml Opti-Pro SFM培养基中。然后，将20 ml得到的表达载体/Opti-Pro SFM混合液加入20 ml得到的聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合液中，并将得到的混合物轻轻搅拌，然后放置5分钟。此后，将混合物加给FreeStyle 293F细胞，并在8% CO2培养箱中在37℃在90 rpm振荡培养7天。将得到的培养物上清液穿过一次性的囊式过滤器(Advantec #CCS-045-E1H)进行过滤。

[0586] 将通过pEF1FCCU/M30H和pEF6KCL/M30L的组合得到的嵌合抗体M30命名为“cM30”或“cM30抗体”。

[0587] 7)-6-2  cM30的纯化

[0588] 通过包括rProtein A亲和色谱法(在4-6℃) (GE Healthcare Japan Corporation)和陶瓷羟磷灰石(在室温)的两步法，纯化在实施例7)-6-1中得到的培养物上清液。在通过rProtein A亲和色谱法纯化以后和在通过陶瓷羟磷灰石纯化以后，在室温进行缓冲液更换步骤。首先，将1100-1200 ml培养物上清液应用于经PBS平衡过的MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation制造，2个串联的HiTrap柱(体积：1 ml))。将所有培养溶液倒入柱中以后，用15-30 ml PBS洗涤柱。随后，用2 M精氨酸盐酸盐溶液(pH 4.0)进行洗脱，并收集含有抗体的级分。将所述级分应用于脱盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corporation制造，2个串联的HiTrap脱盐柱(体积：5 ml))，由此用含有5 mM磷酸钠、50 mM MES和20 mM NaCl的缓冲液（在pH 6.5）更换缓冲液。

[0589] 进一步，将进行了缓冲液更换的抗体溶液应用于经含有5 mM NaPi、50 mM MES和20 mM NaCl的缓冲液（在pH 6.5）平衡过的陶瓷羟磷灰石柱(Japan Bio-Rad 
Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1羟磷灰石柱(体积：2 ml))。然后，用氯化钠进行线性浓度梯度洗脱，并收集含有抗体的级分。将所述级分应用于脱盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corporation制造，2个串联的HiTrap脱盐柱(体积：5 ml))，由此用CBS (含有10 mM柠檬酸盐缓冲液和140 mM氯化钠, pH 6.0)更换液体。

[0590] 最后，使用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (分级分子量: 30 K, Sartorius Co., Ltd.，在4℃)，浓缩得到的溶液，并将IgG的浓度调节至1.0 mg/ml或更高，并将如此得到的溶液用作经纯化的样品。

[0591] 实施例8. cM30抗体的活性

[0592] 8)-1  cM30抗体与B7-H3的结合活性

[0593] 通过表面等离子体共振(SPR) 装置(GE Healthcare Corporation)，测量M30抗体或cM30抗体与B7-H3抗原之间的亲和力。根据常规方法，将抗-小鼠IgG或抗-人IgG抗体固定化在传感器芯片上，然后，使M30抗体样品或cM30抗体与其结合。此后，向其中添加不同浓度的重组B7-H3变体2抗原的细胞外结构域多肽(R&D Systems, Inc.制造, #2318-B3-050/CF)，并随时间测量与运行缓冲液(磷酸盐缓冲液, 0.05% SP20)中的抗体结合的抗原的量。用专用软件(Version 4.1, GE Healthcare Corporation)分析测量的量，并计算解离常数。

[0594] 作为结果，发现M30抗体和cM30抗体分别以5.89 nM和3.43 nM的解离常数与重组B7-H3抗原结合。这些结果证实了M30抗体和cM30抗体会结合B7-H3抗原，并且它们的结合亲合力基本上相等。

[0595] 8)-2  cM30抗体的ADCP活性

[0596] 根据常规方法分离健康受试者的外周血单核细胞(PBMC)，并将其悬浮于含10% FBS的RPMI 1640 (Invitrogen Corporation)中，然后接种在烧瓶中。将细胞在CO2培养箱中培养过夜。除去培养物上清液，并给附着于烧瓶的细胞添加补充了M-CSF和GM-CSF的含10% FBS的RPMI 1640 (PeproTech, Inc.)，将细胞培养2周。用TrypLE使细胞脱离，并收集。
5
然后，以500 μl/孔(1 x 10个细胞/孔)，将细胞加入24-孔板中，并在37℃培养过夜。将如此制备的细胞用作效应细胞。

[0597] 使用PKH26染料标记试剂盒(Sigma Co., Ltd.)，标记要用作靶细胞的NCI-H322细胞。用TrypLE使靶细胞脱离，并用PBS洗涤2次。以1 x 107个细胞/ml，将细胞悬浮于稀释剂C中。用稀释剂C将PKH26染料储备液(1 mM) 稀释至8 μM，此后立即向其中加入稀释的染料溶液，其量等于细胞混悬液的量。将得到的混合物在室温放置5分钟。然后，向其中加入1 ml血清，此外，向其中加入含血清的培养基，并洗涤2次。

[0598] 用培养溶液，将每种M30抗体和cM30抗体稀释至20 μg/ml。随后，以2 x 106个细胞/100 μl/试管分配靶细胞，并混合。将得到的混合物在冰上静置30分钟。除去上清液，并用培养溶液洗涤细胞2次，悬浮于500 μl培养溶液。从效应细胞除去上清液，向其中加入已经用抗体处理过并悬浮于培养溶液中的细胞，并与其混合。然后，将细胞在CO2培养箱中培养3小时。此后，用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱离，并收集。向收集的细胞中，加入FITC标记的抗-小鼠CD11b抗体(Becton, Dickinson and Company, Ltd.)，并将得到的混合物在冰上静置30分钟。除去上清液，并用培养溶液洗涤细胞2次。将收集的细胞悬浮于300 μl培养基，并通过FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.)进行分析。在CD11b-阳性的巨噬细胞中，将PKH26-阳性的级分评价为吞噬阳性的细胞。

[0599] 作为结果，如图8所示，当加入10 μg/ml的M30抗体和cM30抗体时，巨噬细胞对NCI-H322细胞的吞噬分别被诱导至33±1%和35±2%。因此，证实了cM30抗体以与M30抗体相同的方式具有针对NCI-H322细胞的ADCP活性。关于针对MDA-MB-231细胞(ATCC)的ADCP活性。也得到了类似的实验结果。

[0600] 8)-3  cM30抗体的体内抗肿瘤作用

[0601] 通过胰蛋白酶处理，使MDA-MB-231细胞脱离培养瓶，然后将其悬浮于含10% FBS的RPMI 1640培养基(Invitrogen Corporation)中，随后离心，并除去上清液。用相同的培养基洗涤细胞2次，然后悬浮于BD Matrigel Basement Membrane Matrix (BD Biosciences, Inc.制造)。然后，将细胞以5 x 106个细胞/小鼠的剂量皮下地植入每只6周龄小鼠(CB17/Icr-Prkdc[scid]/CrlCrlj, Charles River Laboratories Japan, Inc.) 的腋窝区域。将植入当天视作第0天，在第14、21、28、35和42天，以500 μg/小鼠(约25 mg/kg)的剂量腹膜内地施用M30抗体或cM30抗体。在第14、18、21、25、28、32、35、39、42、46、49和52天测量肿瘤体积，并检查抗体的施用的抗肿瘤作用。

[0602] 作为结果，与其中没有施用抗体的未治疗组相比，在M30和cM30抗体施用组中，肿瘤生长显著受到抑制。在第52天，以肿瘤重量的方式，M30抗体和cM30抗体相对于未治疗组的P值都为P<0.001。使用Dunnett氏多重比较检验来计算P值。

[0603] 此外，在第52天，在M30抗体的情况下，肿瘤生长抑制率(= 100 - (抗体施用组中的平均肿瘤体积)/(未治疗组中的平均肿瘤体积) x 100) 为71.3%，在cM30抗体的情况下，为71.7%。因此，观察到cM30抗体以与M30抗体相同的方式具有非常强的体内抗肿瘤作用(图9)。

[0604] 实施例9. 小鼠抗-人B7-H3抗体#M30的人源化抗体的设计

[0605] 9)-1  人源化M30抗体的设计

[0606] 9)-1-1  M30可变区的分子建模

[0607] 根据通常称作同源性建模的方法(Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991))，进行M30可变区的分子建模。将在蛋白数据库(Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))中登记的人免疫球蛋白可变区的基本序列(可以得到从X-射线晶体结构衍生出的三维结构)与在实施例6-3)中确定的M30可变区进行比较。

[0608] 作为结果，在具有框架中的类似缺失的抗体中，选择3BKY作为与M30轻链可变区具有最高序列同源性的序列。此外，选择3DGG作为与M30重链可变区具有最高序列同源性的序列。

[0609] 基于“框架模型”来制备框架区的三维结构，所述“框架模型”通过组合对应于M30轻链的3BKY的坐标和对应于M30重链的3DGG的坐标而得到。关于M30 CDR，根据Thornton等人的分类(J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996))和H3规则(FEBS letters 399, 1-8 (1996))，分别选择2HOJ、1BBD、1Q9O、2FBJ、1LNK和1TET作为限定最类似于CDRH1 (SEQ ID NO: 92)、CDRH2 (SEQ ID NO: 93)、CDRH3 (SEQ ID NO: 94)、CDRL1 (SEQ ID NO: 95)、CDRL2 (SEQ ID NO: 96)和CDRL3 (SEQ ID NO: 97) 的构象的构象的坐标，并整合进框架模型中。

[0610] 最后，为了在能量方面得到M30可变区的可能分子模型，进行能量计算，以排除不利的原子间接触。使用商购可得的蛋白三级结构预测程序Prime和坐标搜索程序MacroModel (Schrodinger, LLC)，进行上述操作。

[0611] 9)-1-2  人源化的M30的氨基酸序列的设计

[0612] 根据通常称作CDR移植的方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))，构建人源化M30抗体。基于框架区内的氨基酸同源性，选择受体抗体。将M30的框架区序列与抗体氨基酸序列的Kabat数据库(Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001))中的所有人框架序列进行比较。作为结果，基于框架区中的70%的序列同源性，选择mAb49'CL抗体(GenBank in NCBI: D16838.1和D16837.1)作为受体。

[0613] 将mAb49'CL的框架区中的氨基酸残基与M30的氨基酸残基相比对，并鉴别出其中使用不同氨基酸的位置。使用上面构建的M30的三维模型，分析这些残基的位置。然后，根据Queen等人提供的标准(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))，选择要移植到受体上的供体残基。通过将一些选择的供体残基转移至受体抗体，如在下述实施例中所述构建人源化的M30抗体序列。

[0614] 9)-2  M30重链的人源化

[0615] 9)-2-1  M30-H1-型重链：

[0616] 将通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 63表示的cM30重链的氨基酸编号20 (谷氨酸)、24 (谷氨酰胺)、28 (脯氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、35 (丙氨酸)、39 (蛋氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (赖氨酸)、67 (异亮氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、89 (谷氨酰胺)、91 (丝氨酸)、93 (赖氨酸)、95 (丝氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丝氨酸)、136 (苏氨酸)和137 (亮氨酸)而设计的人源化的M30重链命名为“M30-H1-型重链”。

[0617] M30-H1-型重链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 85表示。

[0618] 9)-2-2  M30-H2-型重链：

[0619] 将通过分别用谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、精氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 63表示的cM30重链的氨基酸编号20 (谷氨酸)、24 (谷氨酰胺)、28 (脯氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、35 (丙氨酸)、39 (蛋氨酸)、57 (赖氨酸)、59 (赖氨酸)、86 (赖氨酸)、87 (丙氨酸)、89 (谷氨酰胺)、91 (丝氨酸)、93 (赖氨酸)、95 (丝氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丝氨酸)、136 (苏氨酸)和137 (亮氨酸) 而设计的人源化的M30重链命名为“M30-H2-型重链”。

[0620] M30-H2-型重链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 87表示。

[0621] 9)-2-3  M30-H3-型重链：

[0622] 将通过分别用缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 63表示的cM30重链的氨基酸编号24 (谷氨酰胺)、28 (脯氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、35 (丙氨酸)、39 (蛋氨酸)、59 (赖氨酸)、89 (谷氨酰胺)、91 (丝氨酸)、93 (赖氨酸)、95 (丝氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丝氨酸)、136 (苏氨酸)和137 (亮氨酸)而设计的人源化的M30重链命名为“M30-H3-型重链”。

[0623] M30-H3-型重链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 89表示。

[0624] 9)-2-4 M30-H4-型重链：

[0625] 将通过分别用缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 63表示的cM30重链的氨基酸编号24 (谷氨酰胺)、28 (脯氨酸)、30 (亮氨酸)、31 (缬氨酸)、35 (丙氨酸)、39 (蛋氨酸)、59 (赖氨酸)、95 (丝氨酸)、106 (苏氨酸)、110 (丝氨酸)、136 (苏氨酸)和137 (亮氨酸)而设计的人源化的M30重链命名为“M30-H4-型重链”。

[0626] M30-H4-型重链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 91表示。

[0627] 9)-3  M30轻链的人源化

[0628] 9)-3-1  M30-L1-型轻链：

[0629] 将通过分别用谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和异亮氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 59表示的cM30轻链的氨基酸编号21 (谷氨酰胺)、25 (丝氨酸)、29 (苏氨酸)、30 (异亮氨酸)、33 (丙氨酸)、38 (赖氨酸)、39 (缬氨酸)、41 (蛋氨酸)、42 (苏氨酸)、61 (丝氨酸)、62 (丝氨酸)、64 (赖氨酸)、65 (脯氨酸)、66 (色氨酸)、77 (缬氨酸)、89 (丝氨酸)、90 (酪氨酸)、91 (丝氨酸)、97 (缬氨酸)、99 (丙氨酸)、102 (丙氨酸)、104 (苏氨酸)、119 (苏氨酸)、123 (亮氨酸)和125 (亮氨酸) 而设计的人源化的M30轻链命名为“M30-L1-型轻链”。

[0630] M30-L1-型轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 71表示。

[0631] 9)-3-2 M30-L2-型轻链：

[0632] 将通过分别用谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和异亮氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 59表示的cM30轻链的氨基酸编号21 (谷氨酰胺)、25 (丝氨酸)、29 (苏氨酸)、30 (异亮氨酸)、33 (丙氨酸)、38 (赖氨酸)、39 (缬氨酸)、41 (蛋氨酸)、42 (苏氨酸)、61 (丝氨酸)、62 (丝氨酸)、64 (赖氨酸)、65 (脯氨酸)、77 (缬氨酸)、89 (丝氨酸)、91 (丝氨酸)、97 (缬氨酸)、99 (丙氨酸)、102 (丙氨酸)、104 (苏氨酸)、119 (苏氨酸)、123 (亮氨酸)和125 (亮氨酸) 而设计的人源化的M30轻链命名为“M30-L2-型轻链”。

[0633] M30-L2-型轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 73表示。

[0634] 9)-3-3 M30-L3-型轻链：

[0635] 将通过分别用丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和异亮氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 59表示的cM30轻链的氨基酸编号29 (苏氨酸)、30 (异亮氨酸)、33 (丙氨酸)、38 (赖氨酸)、39 (缬氨酸)、41 (蛋氨酸)、62 (丝氨酸)、65 (脯氨酸)、77 (缬氨酸)、91 (丝氨酸)、97 (缬氨酸)、99 (丙氨酸)、102 (丙氨酸)、104 (苏氨酸)、119 (苏氨酸)、123 (亮氨酸)和125 (亮氨酸)而设计的人源化的M30轻链命名为“M30-L3-型轻链”。

[0636] M30-L3-型轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 75表示。

[0637] 9)-3-4 M30-L4-型轻链：

[0638] 将通过分别用谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和异亮氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 59表示的cM30轻链的氨基酸编号21 (谷氨酰胺)、25 (丝氨酸)、29 (苏氨酸)、30 (异亮氨酸)、33 (丙氨酸)、38 (赖氨酸)、39 (缬氨酸)、41 (蛋氨酸)、42 (苏氨酸)、61 (丝氨酸)、62 (丝氨酸)、64 (赖氨酸)、66 (色氨酸)、77 (缬氨酸)、89 (丝氨酸)、90 (酪氨酸)、91 (丝氨酸)、96 (精氨酸)、97 (缬氨酸)、99 (丙氨酸)、102 (丙氨酸)、104 (苏氨酸)、119 (苏氨酸)、123 (亮氨酸)和125 (亮氨酸) 而设计的人源化的M30轻链命名为“M30-L4-型轻链”。

[0639] M30-L4-型轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 77表示。

[0640] 9)-3-5 M30-L5-型轻链：

[0641] 将通过分别用丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和异亮氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 59表示的cM30轻链的氨基酸编号29 (苏氨酸)、30 (异亮氨酸)、33 (丙氨酸)、38 (赖氨酸)、39 (缬氨酸)、41 (蛋氨酸)、62 (丝氨酸)、77 (缬氨酸)、91 (丝氨酸)、97 (缬氨酸)、99 (丙氨酸)、102 (丙氨酸)、104 (苏氨酸)、119 (苏氨酸)、123 (亮氨酸)和
125 (亮氨酸) 而设计的人源化的M30轻链命名为“M30-L5-型轻链”。

[0642] M30-L5-型轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 79表示。

[0643] 9)-3-6 M30-L6-型轻链：

[0644] 将通过分别用谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和异亮氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 59表示的cM30轻链的氨基酸编号21 (谷氨酰胺)、25 (丝氨酸)、29 (苏氨酸)、30 (异亮氨酸)、33 (丙氨酸)、38 (赖氨酸)、39 (缬氨酸)、41 (蛋氨酸)、42 (苏氨酸)、61 (丝氨酸)、
62 (丝氨酸)、64 (赖氨酸)、66 (色氨酸)、77 (缬氨酸)、89 (丝氨酸)、90 (酪氨酸)、91 (丝氨酸)、97 (缬氨酸)、99 (丙氨酸)、102 (丙氨酸)、104 (苏氨酸)、119 (苏氨酸)、123 (亮氨酸)和125 (亮氨酸)而设计的人源化的M30轻链命名为“M30-L6-型轻链”。

[0645] M30-L6-型轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 81表示。

[0646] 9)-3-7 M30-L7-型轻链：

[0647] 将通过分别用谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、精氨酸、丙氨酸、亮氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸和异亮氨酸取代由序列表中的SEQ ID NO: 59表示的cM30轻链的氨基酸编号21 (谷氨酰胺)、25 (丝氨酸)、29 (苏氨酸)、30 (异亮氨酸)、33 (丙氨酸)、38 (赖氨酸)、39 (缬氨酸)、41 (蛋氨酸)、42 (苏氨酸)、61 (丝氨酸)、62 (丝氨酸)、64 (赖氨酸)、66 (色氨酸)、77 (缬氨酸)、89 (丝氨酸)、91 (丝氨酸)、97 (缬氨酸)、99 (丙氨酸)、102 (丙氨酸)、104 (苏氨酸)、119 (苏氨酸)、123 (亮氨酸)和125 (亮氨酸)而设计的人源化的M30轻链命名为“M30-L7-型轻链”。

[0648] M30-L7-型轻链的氨基酸序列由SEQ ID NO: 83表示。

[0649] (实施例10)  人源化抗体的制备

[0650] 10)-1  M30-L1、M30-L2、M30-L3、M30-L4、M30-L5、M30-L6和M30-L7-型轻链表达载体的构建

[0651] 基于SEQ ID NO: 70、72、74、76、78、80和82，根据与下述SEQ ID NO氨基酸序列对应的核苷酸序列，合成了包含编码M30-L1、M30-L2、M30-L3、M30-L4、M30-L5、M30-L6或M30-L7-型轻链可变区的基因的DNA (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service)，所述轻链可变区由序列表中的SEQ ID NO: 71的氨基酸编号21-128、SEQ ID NO: 73的氨基酸编号21-128、SEQ ID NO: 75的氨基酸编号21-128、SEQ ID NO: 77的氨基酸编号21-128、SEQ ID NO: 79的氨基酸编号21-128、SEQ ID NO: 81的氨基酸编号21-128、或SEQ ID NO: 83的氨基酸编号21-128表示。然后，将通过用限制性酶NdeI和BsiWI切割合成的DNA所得到的每个DNA片段插入通用的嵌合和人源化抗体轻链表达载体(pEF6KCL)的用限制性酶NdeI和BsiWI切割的位点处，由此构建M30-L1、M30-L2、M30-L3、M30-L4、M30-L5、M30-L6和M30-L7-型轻链表达载体。

[0652] 将如此得到的表达载体分别命名为“pEF6KCL/M30-L1”、“pEF6KCL/M30-L2”、“pEF6KCL/M30-L3”、“pEF6KCL/M30-L4”、“pEF6KCL/M30-L5”、“pEF6KCL/M30-L6”和“pEF6KCL/M30-L7”。

[0653] 10)-2  M30-H1、M30-H2、M30-H3和M30-H4-型重链表达载体的构建

[0654] 基于SEQ ID NO: 84、86、88和90，根据与下述SEQ ID NO氨基酸序列对应的核苷酸序列，合成了包含编码M30-H1、M30-H2、M30-H3或M30-H4-型重链可变区的基因的DNA (GENEART, Inc. Artificial Gene Synthesis Service)，所述重链可变区由SEQ ID NO: 85的氨基酸编号20-141、SEQ ID NO: 87的氨基酸编号20-141、SEQ ID NO: 89的氨基酸编号20-141、或SEQ ID NO: 91的氨基酸编号20-141表示。然后，将通过用限制性酶BlpI切割合成的DNA所得到的每个DNA片段插入通用的人源化抗体重链表达载体(pEF1FCCU)的用限制性酶BlpI切割的位点处，由此构建M30-H1、M30-H2、M30-H3和M30-H4-型重链表达载体。

[0655] 将如此得到的表达载体分别命名为“pEF1FCCU/M30-H1”、“pEF1FCCU/M30-H2”、“pEF1FCCU/M30-H3”和“pEF1FCCU/M30-H4”。

[0656] 10)-3  人源化抗体的制备

[0657] 将处于对数生长期的FreeStyle 293F细胞(Invitrogen Corporation)的1.2×109个细胞接种进1.2 L新鲜FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corporation)中，并在8% CO2培养箱中在37℃在90 rpm振荡培养1小时。将3.6 mg聚乙烯亚胺(Polyscience #
24765) 溶解在20 ml Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corporation)中。随后，将用PureLink HiPure Plasmid Kit (Invitrogen Corporation)制备的重链表达载体(0.4 mg) 和轻链表达载体(0.8 mg) 悬浮于20 ml Opti-Pro SFM培养基中。然后，将20 ml得到的表达载体/Opti-Pro SFM混合液加入20 ml得到的聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合液中，并将得到的混合物轻轻搅拌，然后放置5分钟。此后，将混合物加给FreeStyle 293F细胞，并在8% CO2培养箱中在37℃在90 rpm进行振荡培养7天。将得到的培养物上清液穿过一次性的囊式过滤器(Advantec #CCS-045-E1H)进行过滤。

[0658] 将通过pEF1FCCU/M30-H1和pEF6KCL/M30-L1的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H1-L1”，将通过pEF1FCCU/M30-H1和pEF6KCL/M30-L2的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H1-L2”，将通过pEF1FCCU/M30-H1和pEF6KCL/M30-L3的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H1-L3”，将通过pEF1FCCU/M30-H1和pEF6KCL/M30-L4的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H1-L4”，将通过pEF1FCCU/M30-H4和pEF6KCL/M30-L1的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H4-L1”，将通过pEF1FCCU/M30-H4和pEF6KCL/M30-L2的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H4-L2”，将通过pEF1FCCU/M30-H4和pEF6KCL/M30-L3的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H4-L3”，将通过pEF1FCCU/M30-H4和pEF6KCL/M30-L4的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H4-L4”，将通过pEF1FCCU/M30-H1和pEF6KCL/M30-L5的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H1-L5”，将通过pEF1FCCU/M30-H1和pEF6KCL/M30-L6的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H1-L6”，并将通过pEF1FCCU/M30-H1和pEF6KCL/M30-L7的组合得到的人源化M30抗体命名为“M30-H1-L7”。

[0659] 10)-4  人源化抗体的纯化

[0660] 通过包括rProtein A亲和色谱法(在4-6℃)和陶瓷羟磷灰石(在室温)的两步法，纯化在实施例10)-3中得到的培养物上清液。在通过rProtein A亲和色谱法纯化以后和在通过陶瓷羟磷灰石纯化以后，在室温进行缓冲液更换步骤。

[0661] 首先，将1100-1200 ml培养物上清液应用于经PBS平衡过的MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-Sciences Corporation制造，2个串联的HiTrap柱(体积：1 ml))。将所有培养溶液倒入柱中以后，用15-30 ml PBS洗涤柱。随后，用2 M精氨酸盐酸盐溶液(pH 4.0)进行洗脱，并收集含有抗体的级分。将所述级分应用于脱盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corporation制造，2个串联的HiTrap脱盐柱(体积：5 ml))，由此用含有5 mM磷酸钠、50 mM MES和20 mM NaCl的缓冲液（在pH 6.5）更换缓冲液。

[0662] 进一步，将进行了缓冲液更换的抗体溶液应用于经含有5 mM NaPi、50 mM MES和20 mM NaCl的缓冲液（在pH 6.5）平衡过的陶瓷羟磷灰石柱(Japan Bio-Rad 
Laboratories, Inc., Bio-Scale CHT2-1羟磷灰石柱(体积：2 ml))。然后，用氯化钠进行线性浓度梯度洗脱，并收集含有抗体的级分。

[0663] 将所述级分应用于脱盐柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corporation制造，2个串联的HiTrap脱盐柱(体积：5 ml))，由此用CBS (含有10 mM柠檬酸盐缓冲液和140 mM氯化钠, pH 6.0)更换液体。

[0664] 最后，使用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN 20 (分级分子量: 30 K, Sartorius Co., Ltd.，在4℃)，浓缩得到的溶液，并将IgG的浓度调节至1.0 mg/ml或更高，并将如此得到的溶液用作经纯化的样品。

[0665] 10)-5  人源化抗体与B7-H3抗原的结合特性

[0666] 通过表面等离子体共振(SPR) 装置(Biacore, Inc.)，测量人源化M30抗体与人B7-H3抗原的结合特性。根据常规方法，将抗-人IgG抗体固定化在传感器芯片上，然后，使在上面10)-4中得到的人源化M30抗体的每种纯化样品与其结合。此后，向其中添加不同浓度的B7-H3变体2抗原的细胞外结构域多肽(R&D Systems, Inc.制造, #2318-B3-050/CF)，并随时间测量与运行缓冲液(磷酸盐缓冲液, 0.05% SP20) 中的抗体结合的抗原的量。用专用软件(BIAevaluation)分析测量的量，并计算解离常数(Kd [M])。使用cM30抗体作为每个测量操作的阳性对照，执行测量。结果如表3所示。所有人源化M30抗体具有针对B7-H3抗原的结合活性。

[0667] [表3]

[0668]

[0669] 实施例11. cM30抗体和人源化M30抗体相对于M30抗体的结合B7-H3抗原的竞争性抑制活性的测量

[0670] 通过下述方法，测量cM30抗体和人源化M30抗体(M30-H1-L4抗体) 相对于M30抗体的结合B7-H3变体1和变体2的竞争性抑制活性

[0671] 使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC生物素化试剂盒(Thermo Scientific Corporation制造, #21435)并根据附带的方案，将各种小鼠单克隆抗体M30生物素化(在下文中将各种生物素化的M30抗体称作“bM30”)。此外，在所有情况下，使用BD OPTI EIA (BD Biosciences, Inc., #550536) 作为要在下述ELISA方法中使用的缓冲液。

[0672] 用包被缓冲液将B7-H3变体1的细胞外结构域多肽(R&D Systems, Inc.制造, #1949-B3-050/CF)和B7-H3变体2的细胞外结构域多肽(R&D Systems, Inc.制造, #2318-B3-050/CF)各自稀释至0.5 μg/ml，并将得到的溶液以100 μL/孔分配在免疫板(Nunc, Inc.制造, #442404)中。然后，将平板在4℃静置过夜，由此使蛋白吸附至平板。次日，以200 μL/孔分配测定稀释剂，并将平板在室温静置4小时。

[0673] 除去每个孔中的溶液以后，将5 μg/ml的生物素化的抗体和每种浓度(0 μg/ml、1 μg/ml、5μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml或125 μg/ml) 的未标记的抗体的混合溶液以100 μL/孔分配在测定稀释剂中，并将平板在室温静置1小时。

[0674] 用洗涤缓冲液洗涤每个孔2次以后，以100 μL/孔加入用测定稀释剂稀释至500倍的抗生蛋白链菌素-辣根过氧化物酶缀合物(GE Healthcare Bio-Sciences Corporation制造, #RPN1231V)，并将平板在室温静置1小时。

[0675] 除去每个孔中的溶液并用洗涤缓冲液洗涤每个孔2次以后，以100 μL/孔加入底物溶液，并使显色反应在搅拌下在反应混合物中进行。显色结束后，向其中以100 μl/孔加入封闭缓冲液，停止显色反应。然后，使用平板读数器测量在450 nm的吸光度。

[0676] 作为结果，在附着有B7-H3变体1的细胞外结构域的多肽的平板中，向其中仅加入bM30的孔的吸光度为2.36±0.05 (平均值±标准差(n=12))，在附着有B7-H3变体2的细胞外结构域的多肽的平板中，则为1.90±0.20 (平均值±标准差(n=12))。

[0677] 将图10的图中的吸光度各自表示为平均值±标准差(n=3)。对照IgG没有抑制bM30与B7-H3的结合。

[0678] 另一方面，证实了在以下两种平板中，M30抗体自身、cM30抗体（它是M30抗体的嵌合抗体）和M30-H1-L4（它是人源化抗体）会抑制bM30与B7-H3的结合：附着有B7-H3变体1的细胞外结构域的多肽的平板，和附着有B7-H3变体2的细胞外结构域的多肽的平板。

[0679] 即，证实了cM30抗体和人源化抗体(M30-H1-L4抗体)将B7-H3抗原的相同表位识别为M30抗体。

[0680] 实施例12. 人源化M30抗体的活性

[0681] 12)-1  人源化M30抗体的ADCP活性

[0682] 根据常规方法分离健康受试者的PBMC，并将其悬浮于含10% FBS的RPMI 1640中，然后接种在烧瓶中。将细胞在CO2培养箱中培养过夜。除去培养物上清液，并给附着于烧瓶的细胞添加补充了M-CSF和GM-CSF的含10% FBS的RPMI 1640 (PeproTech, Inc.)，将细胞培养2周。用TrypLE使细胞脱离，并收集。然后，以500 μl/孔(1 x 105个细胞/孔)，将细胞加入24-孔板中，并在37℃培养过夜。将如此制备的细胞用作效应细胞。

[0683] 使用PKH26染料标记试剂盒(Sigma Co., Ltd.)，标记要用作靶细胞的NCI-H322细胞。用TrypLE使靶细胞脱离，并用PBS洗涤2次。以1 x 107个细胞/ml，将细胞悬浮于稀释剂C中。用稀释剂C将PKH26染料储备液(1 mM) 稀释至8 μM，此后立即向其中加入稀释的染料溶液，其量等于细胞混悬液的量。将得到的混合物在室温放置5分钟。然后，向其中加入1 ml血清，此外，向其中加入含血清的培养基，并洗涤2次。

[0684] 用含10% FBS的RPMI 1640 (Invitrogen Corporation)，将每种M30抗体、cM30抗体和人源化M30抗体(M30-H1-L4抗体) 稀释至20 μg/ml。随后，以2 x 106个细胞/100 μl/试管分配靶细胞(NCI-H322细胞)，并混合。将得到的混合物在冰上静置30分钟。除去上清液，并用培养溶液洗涤细胞2次，悬浮于500 μl培养溶液。

[0685] 从效应细胞除去上清液，向其中加入已经用悬浮于培养溶液中的M30抗体、cM30抗体或人源化M30抗体(M30-H1-L4抗体)处理过的细胞，并与其混合。然后，将细胞在CO2培养箱中培养3小时。

[0686] 此后，用胰蛋白酶-EDTA使细胞脱离，并收集。

[0687] 向收集的细胞中，加入FITC标记的抗-小鼠CD11b抗体(Becton, Dickinson and Company, Ltd.)，并将得到的混合物在冰上静置30分钟。

[0688] 除去上清液，并用培养溶液洗涤细胞2次。

[0689] 将收集的细胞悬浮于300 μl培养基，并通过FACS Calibur (Becton, Dickinson and Company, Ltd.)进行分析。在CD11b-阳性的巨噬细胞中，将PKH26-阳性的级分评价为吞噬阳性的细胞。

[0690] 结果显示在图11中。

[0691] 在加入人源化M30抗体(M30-H1-L4抗体)的组中，以与加入M30抗体或cM30抗体的组中相同的方式，观察到对NCI-H322细胞的ADCP活性。

[0692] 12)-2  人源化M30抗体的ADCC活性

[0693] 根据常规方法分离健康受试者的PBMC，并将其悬浮于含10% FBS的RPMI 1640中，然后接种在烧瓶中。将细胞在CO2培养箱中培养过夜。

[0694] 收集漂浮细胞，随后进行洗涤操作，并将得到的细胞用作外周血淋巴细胞(PBL)。将得到的PBL悬浮于含有10% 胎牛血清(Invitrogen Corporation制造)的、不含酚红的RPMI 1640 (Invitrogen Corporation制造)(在下文中缩写为“ADCC培养基”)中，并使细胞混悬液穿过细胞过滤网(孔径: 40 μm, BD Biosciences, Ltd.制造)。然后，通过台盼蓝染料排除测定来计数活细胞。在将PBL混悬液离心以后，除去培养基，并将细胞以2.5 x 106个细胞/ml的活细胞密度再悬浮于ADCC培养基中，并用作效应细胞。

[0695] 用胰蛋白酶处理NCI-H322细胞，并用含10% FBS的RPMI 1640洗涤处理过的细胞，6
然后再悬浮于含10% FBS的RPMI 1640中。将所述细胞(4 x 10细胞)与穿过0.22 μm过滤器灭菌的铬-51 (5550 kBq)混合，并在37℃和5% CO2条件下标记1小时。将经标记的细胞用ADCC培养基洗涤3次，并将细胞以2 x 105个细胞/ml再悬浮在ADCC培养基中，并用作靶细胞。

[0696] 以2 x 105个细胞/ml的细胞密度，以50 μl/孔，将靶细胞分配在96-孔U形底微量培养板中。向其中加入50 μl每种cM30抗体和人源化M30抗体(M30-H1-L4、M30-H4-L4、M30-H1-L5、M30-H1-L6和M30-H1-L7)，用ADCC培养基稀释，使得加入效应细胞以后的抗体终浓度为1、10、100或1000 ng/ml。然后，以2.5 x 106个细胞/ml的细胞密度，向其中加入100 μl效应细胞，并将细胞在37℃和5% CO2条件下培养4小时。将上清液收集在LumaPlate (PerkinElmer, Inc.制造)中，并使用γ计数器测量从其中发射的γ辐射。根据下述方程式，计算由ADCC活性造成的细胞裂解百分比。

[0697] 细胞裂解百分比(%) = (A-B)/(C-B) x 100

[0698] A: 得自样品孔的辐射计数

[0699] B: 平均自发辐射发射计数(得自未向其中加入抗体和效应细胞的孔) (n=3)。进行与样品孔相同的操作，但是在加入抗体时加入50 μl量的ADCC培养基，并在加入效应细胞时加入100 μl量的ADCC培养基。

[0700] C: 平均最大辐射发射计数(得自在其中用表面活性剂溶解靶细胞的孔) (n=3)。进行与样品孔相同的操作，但是在加入抗体时加入50μl ADCC培养基，并在加入效应细胞时加入100μl含有2% (v/v) Triton X-100的ADCC培养基。

[0701] 结果显示在表4和图12中。

[0702] 显示的数据是一式三份测量结果的平均值，误差棒代表标准差。使用学生t-检验来计算P值。

[0703] 在加入M30-H1-L4抗体的组中，以与加入cM30抗体的组中相同的方式观察到ADCC活性。也以相同的方式观察到其它人源化M30抗体(M30-H4-L4、M30-H1-L5、M30-H1-L6和M30-H1-L7) 具有ADCC活性。

[0704] [表4]

[0705]

[0706] 12)-3  人源化M30抗体的体内抗肿瘤作用

[0707] 通过胰蛋白酶处理，使MDA-MB-231细胞脱离培养瓶，然后悬浮于含10% FBS的RPMI 1640培养基(Life Technologies Corporation)中，随后离心，并除去上清液。用相同的培养基洗涤细胞2次，然后悬浮于BD Matrigel Basement Membrane Matrix(BD 
Biosciences, Inc.制造)中。然后，以5 x 106个细胞/小鼠的剂量，将所述细胞皮下地植入
6周龄的小鼠(FOX CHASE SCID C.B.17/Icr-scid/scidJcl, CLEA JAPAN, Inc.)组中的每只小鼠的腋窝区域中。将植入当天视作第0天，并在第14、21、28、35和42天，以10、1、0.1或
0.01 mg/kg (分别约200、20、2或0.2 μg/小鼠)的剂量腹膜内地施用人源化M30抗体(M30-H1-L4抗体)。在第14、18、21、25、28、31、35、39、42、45和49天测量肿瘤体积，并检查抗体的施用的抗肿瘤作用。

[0708] 作为结果，在施用10、1和0.1 mg/kg的人源化M30抗体(M30-H1-L4抗体) 的组中，与未施用抗体的未治疗组相比，肿瘤生长被显著抑制。在施用10、1和0.1 mg/kg的人源化M30抗体(M30-H1-L4抗体) 的组中，在第49天，以肿瘤重量的方式，与未治疗组相比，肿瘤生长抑制率(= 100 - (抗体施用组的平均肿瘤重量)/(未治疗组的平均肿瘤重量) x 100) 分别为67、54、和51%，并且P值都为P<0.0001。使用Dunnett氏多重比较检验，计算P值。

[0709] 此外，在第49天，在10、1、0.1和0.01 mg/kg施用组中，M30-H1-L4抗体的肿瘤生长抑制率(%) (= 100 - (抗体施用组的平均肿瘤体积)/(未治疗组的平均肿瘤体积) x 100) 分别为84、68、61和30%。因此，以与M30抗体和cM30抗体相同的方式，观察到人源化M30抗体(M30-H1-L4抗体)具有非常强的体内抗肿瘤作用，并证实了以剂量-响应方式表现出所述作用(图38)。

[0710] 工业适用性

[0711] 本发明的抗-B7-H3抗体具有抗肿瘤活性，并且包含抗-B7-H3抗体的药物组合物可以是抗癌剂。

[0712] 序列表自由正文

[0713] SEQ ID NO: 1: PCR引物1

[0714] SEQ ID NO: 2: PCR引物2

[0715] SEQ ID NO: 3: CMV启动子引物: 引物3

[0716] SEQ ID NO: 4: BGH反向引物: 引物4

[0717] SEQ ID NO: 5: B7-H3变体1的核苷酸序列

[0718] SEQ ID NO: 6: B7-H3变体1的氨基酸序列

[0719] SEQ ID NO: 7: PCR引物5

[0720] SEQ ID NO: 8: PCR引物6

[0721] SEQ ID NO: 9: B7-H3变体2的核苷酸序列

[0722] SEQ ID NO: 10: B7-H3变体2的氨基酸序列

[0723] SEQ ID NO: 11: PCR引物7

[0724] SEQ ID NO: 12: PCR引物8

[0725] SEQ ID NO: 13: PCR引物9

[0726] SEQ ID NO: 14: PCR引物10

[0727] SEQ ID NO: 15: PCR引物11

[0728] SEQ ID NO: 16: PCR引物12

[0729] SEQ ID NO: 17: PCR引物13

[0730] SEQ ID NO: 18: PCR引物14

[0731] SEQ ID NO: 19: PCR引物15

[0732] SEQ ID NO: 20: B7-H3 IgV1的核苷酸序列

[0733] SEQ ID NO: 21: B7-H3 IgV1的氨基酸序列

[0734] SEQ ID NO: 22: B7-H3 IgC1的核苷酸序列

[0735] SEQ ID NO: 23: B7-H3 IgC1的氨基酸序列

[0736] SEQ ID NO: 24: B7-H3 IgV2的核苷酸序列

[0737] SEQ ID NO: 25: B7-H3 IgV2的氨基酸序列

[0738] SEQ ID NO: 26: B7-H3 IgC2的核苷酸序列

[0739] SEQ ID NO: 27: B7-H3 IgC2的氨基酸序列

[0740] SEQ ID NO: 28: B7-H3 IgC1-V2-C2的核苷酸序列

[0741] SEQ ID NO: 29: B7-H3 IgC1-V2-C2的氨基酸序列

[0742] SEQ ID NO: 30: B7-H3 IgV2-C2的核苷酸序列

[0743] SEQ ID NO: 31: B7-H3 IgV2-C2的氨基酸序列

[0744] SEQ ID NO: 32: B7RP-1的核苷酸序列

[0745] SEQ ID NO: 33: B7RP-1的氨基酸序列

[0746] SEQ ID NO: 34: B7-H1的核苷酸序列

[0747] SEQ ID NO: 35: B7-H1的氨基酸序列

[0748] SEQ ID NO: 36: B7-DC的核苷酸序列

[0749] SEQ ID NO: 37: B7-DC的氨基酸序列

[0750] SEQ ID NO: 38: CD80的核苷酸序列

[0751] SEQ ID NO: 39: CD80的氨基酸序列

[0752] SEQ ID NO: 40: CD86的核苷酸序列

[0753] SEQ ID NO: 41: CD86的氨基酸序列

[0754] SEQ ID NO: 42: B7-H4的核苷酸序列

[0755] SEQ ID NO: 43: B7-H4的氨基酸序列

[0756] SEQ ID NO: 44: 小鼠抗体M30重链的N-端氨基酸序列

[0757] SEQ ID NO: 45: 小鼠抗体M30轻链的N-端氨基酸序列

[0758] SEQ ID NO: 46: PCR引物16

[0759] SEQ ID NO: 47: PCR引物17

[0760] SEQ ID NO: 48: PCR引物18

[0761] SEQ ID NO: 49: PCR引物19

[0762] SEQ ID NO: 50: 编码M30抗体重链的cDNA的核苷酸序列

[0763] SEQ ID NO: 51: M30的氨基酸序列抗体重链

[0764] SEQ ID NO: 52: 编码M30抗体轻链的cDNA的核苷酸序列

[0765] SEQ ID NO: 53: M30抗体轻链的氨基酸序列

[0766] SEQ ID NO: 54: PCR引物20

[0767] SEQ ID NO: 55: PCR引物21

[0768] SEQ ID NO: 56: 编码人κ链分泌信号、人κ链恒定区和人聚腺苷酸额外信号的DNA序列

[0769] SEQ ID NO: 57: 包含编码人IgG1的信号序列和恒定区的氨基酸的DNA序列的DNA片段

[0770] SEQ ID NO: 58: 编码M30抗体嵌合体-型轻链的cDNA的核苷酸序列

[0771] SEQ ID NO: 59: M30抗体嵌合体-型轻链的氨基酸序列

[0772] SEQ ID NO: 60: PCR引物22

[0773] SEQ ID NO: 61: PCR引物23

[0774] SEQ ID NO: 62: 编码M30抗体嵌合体-型重链的cDNA的核苷酸序列

[0775] SEQ ID NO: 63: M30抗体嵌合体-型重链的氨基酸序列

[0776] SEQ ID NO: 64: PCR引物24

[0777] SEQ ID NO: 65: PCR引物25

[0778] SEQ ID NO: 66: PCR引物26

[0779] SEQ ID NO: 67: PCR引物27

[0780] SEQ ID NO: 68: PCR引物28

[0781] SEQ ID NO: 69: PCR引物29

[0782] SEQ ID NO: 70: M30-L1-型轻链的核苷酸序列

[0783] SEQ ID NO: 71: M30-L1-型轻链的氨基酸序列

[0784] SEQ ID NO: 72: M30-L2-型轻链的核苷酸序列

[0785] SEQ ID NO: 73: M30-L2-型轻链的氨基酸序列

[0786] SEQ ID NO: 74: M30-L3-型轻链的核苷酸序列

[0787] SEQ ID NO: 75: M30-L3-型轻链的氨基酸序列

[0788] SEQ ID NO: 76: M30-L4-型轻链的核苷酸序列

[0789] SEQ ID NO: 77: M30-L4-型轻链的氨基酸序列

[0790] SEQ ID NO: 78: M30-L5-型轻链的核苷酸序列

[0791] SEQ ID NO: 79: M30-L5-型轻链的氨基酸序列

[0792] SEQ ID NO: 80: M30-L6-型轻链的核苷酸序列

[0793] SEQ ID NO: 81: M30-L6-型轻链的氨基酸序列

[0794] SEQ ID NO: 82: M30-L7-型轻链的核苷酸序列

[0795] SEQ ID NO: 83: M30-L7-型轻链的氨基酸序列

[0796] SEQ ID NO: 84: M30-H1-型重链的核苷酸序列

[0797] SEQ ID NO: 85: M30-H1-型重链的氨基酸序列

[0798] SEQ ID NO: 86: M30-H2-型重链的核苷酸序列

[0799] SEQ ID NO: 87: M30-H2-型重链的氨基酸序列

[0800] SEQ ID NO: 88: M30-H3-型重链的核苷酸序列

[0801] SEQ ID NO: 89: M30-H3-型重链的氨基酸序列

[0802] SEQ ID NO: 90: M30-H4-型重链的核苷酸序列

[0803] SEQ ID NO: 91: M30-H4-型重链的氨基酸序列

[0804] SEQ ID NO: 92: M30抗体CDRH1的氨基酸序列

[0805] SEQ ID NO: 93: M30抗体CDRH2的氨基酸序列

[0806] SEQ ID NO: 94: M30抗体CDRH3的氨基酸序列

[0807] SEQ ID NO: 95: M30抗体CDRL1的氨基酸序列

[0808] SEQ ID NO: 96: M30抗体CDRL2的氨基酸序列

[0809] SEQ ID NO: 97: M30抗体CDRL3的氨基酸序列