核酸扩增

摘要

本发明公开了一种监测核酸扩增的方法，所述方法通过以下步骤实现：将核酸和等温试剂盒的扩增混合物提供至pH传感器或pH指示剂，采用等温扩增对所述核酸进行扩增，并且使用所述pH传感器或pH指示剂检测由于扩增引起的pH变化。所述试剂盒包括镁盐、季铵盐和碱金属碱。

权利要求

1.一种用于核酸等温扩增的反应混合物，所述混合物包括：镁盐，碱金属碱，以及选自由季铵盐、氯化铵和盐酸胍组成的组中的至少一种铵化合物，其中所述混合物的缓冲容量小于10mM。

2.根据权利要求1所述的混合物，其中将所述混合物的缓冲容量设置为小于用扩增时释放的质子的期望浓度除以pH变化阈值得到的值，所述pH变化阀值是通过暴露于所述混合物的传感器检测的。

3.根据权利要求1所述的混合物，其中将所述混合物的缓冲容量设置为小于用扩增时释放的质子的期望浓度除以pH变化阈值得到的值的一半，所述pH变化阀值是通过暴露于所述混合物的传感器检测的。

4.根据权利要求2所述的混合物，其中待检测的所述pH变化阈值为所述传感器的检测限。

5.根据权利要求1所述的混合物，其中在所述扩增的操作条件下，所述混合物的缓冲容量小于5mM。

6.根据权利要求5所述的混合物，其中在所述扩增的操作条件下，所述混合物的缓冲容量小于1mM。

7.根据权利要求1至6中任意一项所述的混合物，其中所述混合物还包含缓冲剂。

8.根据权利要求7所述的混合物，其中所述缓冲剂选自由Tris、Hepes、Bicine和MOPS构成的组。

9.根据权利要求8所述的混合物，其中所述混合物中的所述缓冲剂的浓度小于5mM。

10.根据权利要求9所述的混合物，其中所述混合物中的所述缓冲剂的浓度小于3mM。

11.根据权利要求10所述的混合物，其中所述混合物中的所述缓冲剂的浓度小于2mM。

12.根据权利要求11所述的混合物，其中所述混合物中的所述缓冲剂的浓度小于1mM。

13.根据权利要求1至6中任意一项所述的混合物，其中所述混合物还包含硫酸盐化合物。

14.根据权利要求13所述的混合物，其中所述混合物中的所述硫酸盐化合物的浓度小于15mM。

15.根据权利要求14所述的混合物，其中所述混合物中的所述硫酸盐化合物的浓度小于10mM。

16.根据权利要求15所述的混合物，其中所述混合物中的所述硫酸盐化合物的浓度小于8mM。

17.根据权利要求16所述的混合物，其中所述混合物中的所述硫酸盐化合物的浓度小于5mM。

18.根据权利要求17所述的混合物，其中所述混合物中的所述硫酸盐化合物的浓度小于1mM。

19.根据权利要求1所述的混合物，其中所述混合物中的所述季铵盐、氯化铵或盐酸胍的浓度介于2mM和15mM之间。

20.根据权利要求1所述的混合物，其中所述碱金属碱的浓度使得所述混合物的pH介于6和9之间。

21.根据权利要求20所述的混合物，其中所述碱金属碱的浓度使得所述混合物的pH介于7和8.8之间。

22.根据权利要求20所述的混合物，其中所述碱金属碱的浓度使得所述混合物的pH介于8和8.6之间。

23.根据权利要求1至6中任意一项所述的混合物，其中所述碱金属碱为NaOH、KOH或LiOH中的一种。

24.根据权利要求1至6中任意一项所述的混合物，还包括一种或多种用于所述核酸扩增的引物，所述引物为等位基因特异性的，从而使得扩增能够指示目标核酸的存在。

25.根据权利要求1至6中任意一项所述的混合物，其中所述等温扩增为链置换扩增。

26.根据权利要求20所述的混合物，其中所述等温扩增为环介导等温扩增(LAMP)。

27.根据权利要求1至6中任意一项所述的混合物，还包括链置换酶、核苷酸和引物。

28.根据权利要求27所述的混合物，其中所述链置换酶、核苷酸和引物中的至少一种与其余试剂分开存放。

29.一种监测核酸扩增的方法，包括以下步骤：

将核酸和根据权利要求1至23中任意一项所述的反应混合物提供至pH传感器或pH指示剂；

使用等温扩增对所述核酸进行扩增；以及

使用所述pH传感器或pH指示剂检测由于扩增引起的pH的变化。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述pH指示剂为比色染料或荧光染料。

31.根据权利要求29所述的方法，其中所述pH传感器为离子敏感场效应晶体管(ISFET)。

32.根据权利要求29至31中任意一项所述的方法，还包括：确定使混合物的pH变化大于预定的变化量所需要的反应时间；以及基于所述反应时间对所述核酸的初始浓度进行定量。

33.根据权利要求29至31中任意一项所述的方法，其中所述混合物与参比电极流体连通。

34.根据权利要求33所述的方法，其中所述混合物与银-氯化银电极连通。

35.根据权利要求29至31中任意一项所述的方法，其中所述混合物包含一种或多种等位基因特异性引物，所述引物具有至少一个与所述核酸的目标单核苷酸多态性(SNP)互补的碱基，所述方法还包括根据是否进行扩增来鉴定所述核酸的所述至少一个碱基，所述扩增的进行由pH传感器或pH指示剂检测。

36.根据权利要求29至31中任意一项所述的方法，其中所述扩增改变所述混合物的质子浓度使其变化量大于所述混合物的缓冲容量的10％。

37.一种方法，包括使用权利要求1至28中任意一项所述的反应混合物对核酸进行等温扩增。

说明书

核酸扩增

技术领域

[0001] 本发明涉及对一定量的核酸进行扩增的方法和试剂盒。本发明特别地涉及等温扩增技术。经扩增的核酸可以被传感器检测到。

背景技术

[0002] 在进行遗传分析时，往往由于样品中存在的拷贝数太少而无法进行检测，通常需要对样品中的拷贝数进行扩增。

[0003] 例如，可以采用热循环扩增或等温扩增完成这个过程。

[0004] 等温扩增技术包括SDA、LAMP、SMAP、ICAN、SMART。通过链置换反应在恒温下进行该反应过程。通过在恒温下孵育包含样品、引物、具有链置换活性的DNA聚合酶以及底物的混合物，可以一步完成扩增。

[0005] 在环介导等温扩增(LAMP)技术中，采用4至6个被特别设计为分别识别靶基因中的6至8个特定区域的不同引物，来完成靶特异性扩增。Eiken Chemical的专利EP2045337“Process for synthesizing nucleic acid”中进一步描述了LAMP技术，在此通过引用的方式将其并入本文中。

[0006] 这种方法通常能够在15-60分钟内将核酸拷贝扩增109-1010倍。

[0007] 除了引物之外，链置换技术使用Tris和硫酸盐化合物(例如MgSO4、NH4SO4)来保持酶的功能性。

[0008] Tris为具有式(HOCH2)3CNH2的有机化合物(正式名称为三(羟甲基)氨基甲烷)。诸如LAMP之类的链置换技术使用Tris作为缓冲剂，使反应维持在最佳pH值。

[0009] Tris和硫酸盐的推荐浓度分别为大于等于20mM和12-20mM。

[0010] 核酸扩增后，核酸检验需要二级检测技术，例如分光光度法、浊度法、LFD(横向流动试纸条法)或荧光素酶法。然而，这些已知的技术存在缺陷。荧光试剂需要标记以发出紫外荧光，因而耗费昂贵。此外，诸如SYBR绿等试剂与DNA结合，使其本身具有致癌性；埃姆斯试验(Ames Test)表明其具有致突变性和细胞毒性。而且，SYBR绿是非特异性的，其可以附着在任意双链DNA上，因此增强了背景信号。浊度测量需要昂贵的仪器以提供量化。最后，LFD中所用试剂需要二次偶联，其对非特异性检测敏感。

[0011] 现有的等温扩增技术不适用于采用pH检测的体系。因此，该领域存在这样的需求：需要一种对核酸进行等温扩增并且能够利用安全廉价的设备有效地对其进行检测的试剂盒和方法。令人惊讶的是，发明人已经发现所用的试剂可以提高扩增的产量。

发明内容

[0012] 根据本发明的第一个方面，提供了一种试剂盒，其中的试剂可组合形成用于核酸等温扩增的混合物，所述试剂盒包括：镁盐、季铵盐和碱金属碱。

[0013] 所述混合物的缓冲容量可以被设置为小于用扩增时释放的质子的期望浓度除以pH变化阈值得到的值，所述pH变化是通过暴露于所述混合物的传感器检测得到的。

[0014] 所述混合物的缓冲容量可以被设置为小于用扩增时释放的质子的期望浓度除以pH变化阈值所得值的一半，所述pH变化阀值是通过暴露于所述混合物的传感器检测得到的。

[0015] 所述待检测的pH变化阈值可以为所述感受器的检测限值。

[0016] 在用于所述扩增的操作条件下，所述混合物的缓冲容量可以小于10mM，优选地小于5mM，更优选地小于1mM。

[0017] 所述混合物中的缓冲剂的浓度可以小于5mM，更优选地小于3mM、小于2mM或小于1mM。

[0018] 如果存在硫酸盐化合物的话，其浓度可以小于15mM，优选地小于10mM、小于8mM、小于5mM或小于1mM。

[0019] 所述季铵盐，优选的或所述氯化铵的浓度为介于2mM和15mM之间。

[0020] 所述碱金属碱的浓度使得所述混合物的pH介于6和9之间，优选地介于7和8.8之间，更优选地介于8.3和8.6之间。

[0021] 所述碱金属碱为NaOH、KOH或LiOH之一。

[0022] 在核酸扩增过程中还可以使用一种或多种引物，所述引物为等位基因特异性的，从而使得扩增能够显示目标核酸的存在。

[0023] 所述等温扩增可以为链置换扩增，优选为环介导等温扩增(LAMP)。

[0024] 所述混合物的缓冲容量可以基本上屏蔽(mask)非扩增时所释放的质子的预期量。

[0025] 所述试剂盒还可以具有链置换酶、核苷酸和引物，其中优选地这些试剂中的至少一种与其余试剂分开存放。

[0026] 根据本发明的第二个方面，提供了一种方法：使用用于等温扩增的试剂盒、pH传感器或pH指示剂；采用等温扩增对核酸进行扩增；以及使用所述pH传感器或pH指示剂检测由于所述扩增引起的pH变化。

[0027] 所述pH指示剂可以为比色染料或荧光染料，所述pH传感器可以为离子敏感场效应晶体管(ISFET)。

[0028] 所述方法可以确定使混合物的pH变化大于预定的变化量所需要的反应时间；以及基于所述反应时间对核酸的初始浓度进行定量。

[0029] 所述混合物可以与参比电极流体连通，所述参比电极优选为银-氯化银电极。

[0030] 所述混合物可以包含一种或多种等位基因特异性引物，所述引物具有至少一个与所述核酸的目标单核苷酸多态性(SNP)互补的碱基，所述方法还包括根据是否进行扩增来鉴定所述核酸的所述至少一个碱基，所述扩增是否进行由pH传感器或pH指示剂检测。

[0031] 所述扩增可以改变所述混合物的质子浓度使其变化量大于所述混合物的缓冲容量的10％。

[0032] 根据本发明的第三个方面，提供了一种方法，其包括使用所述新的试剂盒对核酸进行等温扩增。

附图说明

[0033] 下文将结合附图，通过例子对本发明的具体实施方案进行描述，其中：

[0034] 图1为链置换扩增技术(如LAMP)的一系列化学反应；

[0035] 图2为暴露于样品的ISFET的剖面图；

[0036] 图3为pH检测系统的剖面图；

[0037] 图4为监测DNA样品扩增以鉴定DNA(选项A)或计算DNA的量(选项B)的方法的流程图；

[0038] 图5为示出常规LAMP配方中试剂的缓冲容量的图；

[0039] 图6为示出不同浓度的NH4Cl的缓冲容量的图；以及

[0040] 图7为用于定量样品中的DNA的标准曲线图。

[0041] 常规LAMP扩增方法使用具有置换活性的DNA聚合酶在标准检验条件下进行，例如：20mM Tris-HCl(pH8.8)、10mM KCl、10mM(NH)4SO4、2.5mM MgSO4、0.1％Triton X-100、0.8M甜菜碱、DNA/RNA、dNTP和Bst聚合酶。

[0042] 本发明人发现这些常规试剂使得无法使用pH传感器进行检测，这主要是因为它们能够屏蔽扩增时产生的质子。

[0043] 事实上，所有这些组分具有不同的pKa，这意味着它们对所述混合物的缓冲容量具有不同的影响。

[0044] 上述提到的试剂中，TrisHCl具有吸收抗衡离子(H+和OH-)的能力，从而帮助溶液保持在聚合酶起作用的最佳pH范围内的稳定pH水平。

[0045] 本发明人发现，用NaOH替代TrisHCl可以将pH设定在聚合酶(例如Bst)可以起作用的范围内，同时降低了缓冲容量。此外，NaOH使双链DNA中的两条链不那么紧密地结合，使得置换聚合酶更容易将它们分开，从而加速反应并提高链置换酶的效率。

[0046] 此外，电子传感器(例如ISFET)使用参比电极，例如铂、Ag/AgCl、氯化亚汞等。这些材料中的一些材料，特别是Ag/AgCl电极与所述标准试剂反应。例如，通过Ag/AgCl电极，Tris在该电极上形成Tris-Ag络合物，其使Ag/AgCl的性能劣化，并且含硫酸盐的试剂会使Ag/AgCl电极中毒。

[0047] 发明详述

[0048] 使用本发明方法的优选的体系包括pH传感器或指示剂、微流体结构、核酸样品、试剂、以及在需要时设定样品的电压电势的参比电极。将试剂和样品合并成一种流体以进行扩增。扩增时释放质子，并用pH传感器或指示剂测量pH的变化。

[0049] 优选地，所述pH传感器或指示剂为ISFET(离子敏感场效应晶体管)。图3中示出该传感器，其中pH传感器3可以为一个或多个位于CMOS微芯片7上的离子敏感场效应晶体管(ISFET)，CMOS微芯片7上具有由基片2中的空隙形成的微流体腔8。试剂和核酸样品可以在被加入到一个或多个暴露于ISFET的腔之前或之后混合。每个ISFET输出电信号，该电信号由信号处理器监测。ISFET的钝化层可被官能化从而使其对质子(氢离子)敏感。随着核酸的扩增，释放出质子，并且作为ISFET电输出的变化而被信号处理器监测到。

[0050] 在可选的实施方案中，pH指示剂可用于检测扩增时释放的质子。例如，所述pH指示剂可以为比色染料或荧光染料，其随着接触流体pH的变化而改变光学性质，例如染料的发射波长。pH指示剂的例子包括Fluorescein、Pyranine和pHrodo染料(可购自Life Technology公司)。

[0051] 所述微流体结构可为孔、腔或通道，以接收靠近传感器或指示剂的样品，并且可以包括将样品输送至传感器或指示剂的装置。所述微流体结构还有助于降低质子远离传感器或指示剂的扩散。在以下实施方案中，ISFET用于举例说明pH检测方案，但是也可以使用其他pH传感器。所述腔可由材料(如SU-8)中的空穴形成，所述材料位于微芯片顶部，并且可被选择性地侵蚀，以留下所述空穴。

[0052] 图2示出了由氮化硅制成的、具有浮栅和传感层的ISFET，其暴露于流体电解质中。在专利US2004134798(A1)中进一步描述了ISFET，通过引用的方式将其内容并入本文。

[0053] 优选地，每个ISFET产生经ISFET和参比信号之间的差值校准的输出信号。参比信号可来自另一个暴露于阴性对照反应的ISFET，或来自位于芯片上但不暴露于波动pH的FET。因此，芯片上任何通常的漂移和噪音将由这些信号之间的差异消除。

[0054] 优选的扩增反应为等温扩增反应，优选为链置换反应。如本文所用，链置换反应是通过具有链置换活性的聚合酶在可进行链置换的反应条件下进行的。链置换反应的例子包括链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)或环介导等温扩增(LAMP)。

[0055] 作为例子，在图1中示出LAMP方法中化学反应的步骤。在步骤1中，双链DNA模板在升高的温度下处于动态平衡。引物F2可以在互补位置上退火至单链。在步骤2中，具有链置换活性的聚合酶使核苷酸从F2的3’端沿着模板延伸。引入核苷酸是以氢离子(质子)作为一种副产物的反应。在步骤3中，F3引物退火至模板上的F3c区域，并开始链置换。在步骤4中合成上游链，进一步释放质子。下游链变为单链(步骤5)，其在步骤6中随着F1c在5’端退火至F1而形成茎-环结构。与此同时，BIP引物退火至所述链的另一端并且核苷酸从B2延伸，释放更多的质子。引物B3置换所述链并促进延伸以形成步骤7所示的双链。步骤8中的结构具有双端茎环，由其进行连续的置换和延伸以扩增模板。如前所述，延伸涉及质子的释放。

[0056] 本文所述的等温扩增反应中所使用的链置换聚合酶可选自由以下聚合酶构成的组：phi29-DNA-聚合酶、Klenow DNA-聚合酶、Vent DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、9oNm(TM)DNA聚合酶、以及它们的突变体和变体。

[0057] 本领域技术人员将能够理解，试剂的最佳浓度将取决于聚合酶的选择；并且，基于聚合酶的知识和实验，下述对优选试剂的一些改变是常规的方法。有关适宜条件的指导可以从酶制造商获得。

[0058] 优选的试剂浓度

[0059] 本发明的方法不需要任何缓冲剂，并且优选地存在最小量的缓冲剂。缓冲剂为用于将溶液的酸度(pH)保持在接近指定操作点的弱酸及其共轭碱，从而使得在加入少量强酸或强碱时，或者在本发明中在掺入核苷酸时释放少量质子的情况下，pH不会发生显著的变化。缓冲剂是加入到混合物中的化合物，主要目的是提供对抗pH变化的缓冲作用。如本文所用，当化合物的主要目的不是缓冲或其缓冲效果远小于混合物中其他化合物时，该化合物不是缓冲剂。用于核酸扩增反应的缓冲剂通常具有介于6和8.5之间的pKa值，并且4+
具有介于6和9之间的缓冲范围。例如，铵(NH )具有一定的缓冲能力，但是其主要目的不是用于缓冲混合物，并且在pH 8的混合物中具有9.24的pKa，相比于Tris而言，其不是很强的缓冲剂。

[0060] 对缓冲剂、酶和体系的初始pH的选择是相互依赖的。例如，虽然缓冲剂可为如下常见缓冲剂之一：TAPS、Bicine、Tris、Tricine、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、Cacodylate、SSC和MES，但在一个实施方案中，TRIS在pH为8.5时与BST酶一起使用。

[0061] 优选地，缓冲剂的浓度小于10mM，优选地小于8mM、小于5mM或小于1mM。优选地，所述缓冲剂为Tris或Hepes。

[0062] 为了降低对参比电极的毒害作用，在合并的流体中的硫酸盐化合物的浓度小于15mM，优选地小于10mM、小于8mM、小于5mM或小于1mM。

[0063] 氯化铵可用于替代硫酸铵，同时还使得可获得良好的扩增产量。更通常地，其他季4+
盐可用于替代氯化铵。季铵盐是具有NR 结构的带正电的多原子离子，其中R为烷基或芳基。

[0064] 优选地，在合并的流体中，季铵盐的浓度范围为大于2mM、5mM或8mM。但是，铵4+
(NH )具有一定的缓冲容量，因此在保持最佳扩增产量的同时，需要使合并的流体中的铵化合物(如氯化铵)的最终浓度最小化。为了降低缓冲容量，合并的流体中的铵化合物的浓度小于15mM、优选地小于10mM。

[0065] 镁有利于促进模板中核苷酸的掺入。合并的流体中的镁化合物(例如硫酸镁)的浓度优选地大于0.5mM、大于1mM、大于2mM、或大于4mM。合并的流体中的镁离子的浓度取决于dNTP、模板和引物的浓度。通常，合并的流体中的dNTP与硫酸镁的比例优选地小于1:2、小于1:3、小于1:4或小于1:5。

[0066] 由于高氯浓度有助于Ag/AgCl电极，因此加入如氯化钠或氯化钾等一价盐，氯离子浓度优选地大于10mM、大于20mM、大于30mM、大于40mM或大于50mM。在一个实施方案中，所述流体中的氯离子浓度为介于40mM和60mM之间。

[0067] 为了设定所述流体的初始pH，向流体中加入碱金属碱，例如NaOH、LiOH或KOH。设定所述碱金属碱的浓度使得所述合并溶液的pH介于6和9之间，更优选地介于7和8.8之间，最优选地介于8和8.6之间，这些pH范围适于某些酶起作用。对于Bst聚合酶，优选地初始pH大于7，更优选地大于8.2且小于8.8，更优选地小于8.6。

[0068] 其他试剂的浓度可以保持在常规用量。参见Notomi T等人的文章(Nucleic Acids Res.2000Jun 15；28(12):E63)。例如，在一个实施方案中，Bst聚合酶的量为至少0.3单位每微升合并的流体；甜菜碱的浓度为0-1.5M，优选为0.8M-1M；并且引物的总浓度介于2m和6.2uM之间。

[0069] 已经发现，上述试剂浓度能够提供良好的扩增产量，同时也能提供低的缓冲容量，从而使pH传感器能够用于检测核酸扩增时释放的质子。

[0070] 所述过程可以在固定温度下进行，以降低由热循环引起的传感器信号漂移，从而使传感器信号更稳定。另外，该过程与半导体平台高度相容。例如，最佳酶作用温度可由芯片上的加热元件和温度传感器实现和监测；可以较少地担心与热循环有关的热膨胀和热疲劳；以及可以选择试剂以使其不影响微芯片上的电极。

[0071] 通常，等温法需要固定的温度，该温度由所用的试剂决定。例如，在LAMP中，酶功能在60℃至65℃之间最佳。有利的是，本文所述优选的实施方案中的试剂/缓冲剂允许更宽的操作温度。

[0072] 与热循环不同，由于等温扩增不涉及不连续的步骤，在每个步骤中DNA加倍，因此难以估计指定时间内发生了多少次扩增。结果，这种等温扩增法通常有助于过量扩增，其负作用是背景(即非特异性)扩增或荧光背景水平过高。本发明的方法能够实时监测扩增过程，从而在获得足够产量时可以停止该过程。在微芯片上进行本发明的方法时，所述流体由pH传感器监测并且由芯片表面上的元件加热，可以使温度降低或升高至扩增暂停的温度。这保证了在背景DNA之外有足够的所需DNA，并且不需要为了确定发生足够的扩增而进行不必要的等待。

[0073] 在合并时，提供具有上述浓度的所述试剂。有些试剂具有它们本身所需的保持稳定性的条件，因此可以在混合前单独储存。例如，酶可以与其他试剂分开，在合适的缓冲溶液中长期储存，从而保证酶的稳定性。在与其余试剂混合时，缓冲剂被充分稀释从而不会显著地屏蔽pH的变化。另外，针对特定目标基因的引物可以以独立的溶液或以冻干形式提供。考虑到所用的试剂，本领域技术人员应了解或可推知其条件和预混浓度。

[0074] 应用

[0075] 如图4的流程图所示，可以制备DNA样品并将其分到一个或多个腔或孔中。每个腔或孔暴露于微芯片上的ISFET。将DNA与试剂合并以用于环介导等温扩增。以下分别为优选的试剂和浓度，其组合为最优选的试剂盒：

[0076] ·至少0.3单位每微升的Bst聚合酶；

[0077] ·浓度为1M的甜菜碱；

[0078] ·总浓度为5uM的引物；

[0079] ·浓度为5mM的硫酸镁；

[0080] ·浓度为1mM的Tris；

[0081] ·浓度为0的硫酸铵；

[0082] ·浓度为1.2mM的NaOH，其使得合并的流体的pH为8.5；

[0083] ·浓度为5mM的氯化铵；以及

[0084] ·浓度为50mM的氯化钾。

[0085] ISFET信号的接收与参比FET不同，并且由信号处理器监测。通过与微芯片整合的加热器将腔和流体加热至60℃。在预定反应时间后，如果可能，应使模板充分地扩增，从而通过ISFET信号的变化而被检测到。还可以连续地监测信号以确定扩增和由此产生的信号变化何时达到阈值。

[0086] 诊断

[0087] 在一个优选的实施方案中，如图4的选项A所述，本方法可用于鉴定核酸链中的一个或多个碱基。该鉴定可以为单一碱基或单一序列。在鉴定单一序列的情况下，可以鉴定与医学状况有关的特定碱基，并且对该碱基的了解能够为诊断提供方法。目标碱基的例子包括单一序列、单核苷酸多态性(SNP)、缺失、插入、短串联重复(STP)以及遗传或体细胞来源的突变。也可以进行病原体检测，由此，本方法可以检测生物体或生物体株系的存在。

[0088] 可以设计扩增所用的引物，例如FIP寡聚物(上游内部引物)和BIP(下游内部引物)寡聚物，使其包括或排除这些序列：SNP或STP区域。这样，这些序列的扩增或缺失表明待鉴定的碱基/序列的存在或缺失。

[0089] 在图1所示的体系中，两个或多个腔或孔可用来同时进行DNA的扩增。每个孔中加入不同引物组，每组引物用于检测样品DNA中的不同碱基。因此，DNA将仅在存在互补引物组的情况下扩增，产生质子，而其他情况则不会发生扩增。当仅有一个腔中发生扩增时，可以认为该DNA是纯合的，即在两个基因上具有相同的等位基因(突变型或野生型)。当两个腔中发生扩增时，可以认为该DNA为杂合的，即在基因上具有不同的等位基因(突变型和野生型)。因此，通过监测ISFET信号以检测波动，并结合相应孔中的引物组情况，人们可以确定样品DNA中碱基的一致性。为了降低信号处理的需要，可以对来自ISFET的信号进行实时比较，从而输出代表各孔中扩增副产物之间的差异的信号。

[0090] 定量

[0091] 如图4选项B所示，本方法可以用于对样品中的DNA进行定量。给定时间点的质子浓度与流体中DNA的量、以及之前产生的且未从传感区域扩散走的质子的累积量成比例。通过得知在给定时间点，信号与反应开始时相比的变化，并且将该变化与标准进行比较，人们可以确定扩增开始时样品中DNA的量。因此，人们可由现在的量和时间来反向确定样品中初始DNA的量。

[0092] 所述标准可以得自模型、实验数据、或者一个或多个独立的、经历与所述检验平行的扩增反应的内对照反应。所述标准可以作为储存介质上的查询表或者作为计算机程序中的量化方程表示。图7示出了DNA的量相对于时间的示例性图表，据此确定DNA的量。该图表可以内插或外推，或者可以通过数据提取最佳方程，从而在测量反应时间后估计DNA的量。

[0093] 反应时间为从扩增开始(即，存在所有用于扩增的试剂和条件的时刻)至pH变化大于阈值时的时间。可以通过监测pH传感器信号或pH指示剂来检测pH变化。

[0094] RNA

[0095] 本发明方法也可以用于通过使用反转录酶(RTase)，例如禽类成髓细胞瘤病毒(AMV RTase)，以及DNA聚合酶来检测RNA模板。cDNA可由模板RNA合成并用本发明技术扩增，然后使用pH传感器或指示剂检测。

[0096] 缓冲容量优化

[0097] 当大多数化合物对混合物贡献一定的缓冲容量时，理想的是，总的贡献被最小化。然而，可能需要一些少量的缓冲来稳定酶。应当考虑扩增反应预期所产生的质子来选择缓冲剂(如果存在的话)、试剂总缓冲容量、和浓度。所产生的质子的量取决于起始模板的量、扩增条件和扩增时间(假定有过量的核苷酸、酶和引物)。起始模板取决于供体、所取的生物样品类型，扩增时间可以由测试的操作者或制造商来选择。然而，通过了解扩增时间、生物样品类型以及供体类型，人们能够计算出所产生的质子的预期量(或量的范围)。

[0098] 然后可以选择混合物的缓冲容量，使得即使是在缓冲混合物的存在下，预期的(或最低预期的)由扩增产生的质子也会导致pH的变化大于阈值量。pH变化阈值可以为传感器或相关电路的检测限值。可供选则的是，pH变化阈值可以为0.1pH，更优选为0.2pH，最优选为0.5pH。

[0099] 缓冲容量由等式(I)定义：

[0100] β＝dn/d(p[H+])

[0101] 其中n为所加入的OH-或H+的量，d(p[H+])为所得氢离子浓度的余对数的无穷小(infinitesimal)变化。

[0102] 在一个实施方案中，采用了具有0.5pH的较低检测限的ISFET，其暴露于35ul扩增反应，其中，30分钟后实验产量为50ug扩增子。释放自所产生的扩增子的总质子大约为2.17mM(假定碱基对的分子量为650g/摩尔)；

[0103] β＝2.17mM/>0.5

[0104] β<4.34mM

[0105] 因此，为了实现所需的>0.5的pH变化，混合物的缓冲容量应当被设定在小于4.34mM。

[0106] 下表1提供了在25℃下pKa介于6.15和8.43之间的常用缓冲剂的性质。在反应中，这些缓冲剂的浓度应当最小化，从而在较短的扩增反应时间内实现较大的pH变化。然而，可选地提供缓冲剂，以降低背景噪音、稳定酶和/或稳定初始反应。表2提供了所计算出的通过改变缓冲剂的浓度对适合Bst酶的扩增反应缓冲容量的影响。可以看到，很多缓冲选择将满足上述需求，其缓冲容量小于4.34mM(4340uM)。表2中列出的满足该条件的各种缓冲剂和浓度都各自是优选的，并且在本发明的范围内。

[0107] 表1各种缓冲剂的性质

[0108]缓冲剂名称 25℃下pKa 缓冲范围 化合物全名
TAPS 8.43 7.7–9.1 3-{[三(羟甲基)甲基]氨基}丙磺酸
Bicine 8.35 7.6–9.0 N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸
Tris 8.06 7.5–9.0 三(羟甲基)甲胺
Tricine 8.05 7.4–8.8 N-三(羟甲基)甲基甘氨酸
TAPSO 7.635 7.0-8.2 3-[N-三(羟甲基)甲胺]-2-羟基丙磺酸
HEPES 7.48 6.8–8.2 4-2-羟乙基-1-哌嗪乙磺酸
TES 7.4 6.8–8.2 2-{[三(羟甲基)甲基]氨基}乙磺酸
MOPS 7.2 6.5–7.9 3-(N-吗啉基)丙磺酸
PIPES 6.76 6.1–7.5 哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)
Cacodylate 6.27 5.0–7.4 二甲基胂酸
SSC 7 6.5-7.5 柠檬酸钠缓冲液
MES 6.15 5.5–6.7 2-(N-吗啉基)乙磺酸

[0109] 表2各种条件下的缓冲容量

[0110]Hepes@pH 9 8.5 8 7.5 7
40mM 8865 17121 23580 18235
20mM 5199 8916 12071 9628
10mM 3352 3367 4813 6317 5324
5mM 3024 2451 2762 3440 3173

Tris@pH 9 8.5 8 7.5 7
40mM 19536.4 23631 16160 7809
20mM 10535 12170 8361 4415
10mM 4824 6035 6441 4462 2718
5mM 3761 3785 3575 2512 1869

MOPS@pH 9 8.5 8 7.5 7 6.5
40mM 5721 11589 21050 22871 14673
20mM 3628 6149 10806 11946 8286
10mM 3051 2581 3430 5685 6483 5092
5mM 2874 2058 2070 3124 3752 3496

Bicine@pH 9 8.5 8 7.5 7 6.5
40mM 23891 20371 10553 4791.26 3164
20mM 12713 10541 5558 2906 2531
10mM 6139 7124 5626 3061 1963 2215
5mM 4418 4329 3168 1812 1492 2057

[0111] 在一些实施方案中，将缓冲容量由计算得到的最大值降低一部分以确保能够检测到足够的pH信号。缓冲容量可以小于最大缓冲容量的一半，优选地小于五分之一，或小于十分之一，使得由扩增反应预期所释放的质子所导致的pH变化能够被检测到。因此，在上述例子中缓冲容量可以设为4.34mM的1/10，即0.434mM。

[0112] 在一个实施方案中，流体中试剂的缓冲容量用于屏蔽那些即使目标核酸没有成功扩增时也会引起的pH变化。该变化可以被认为是离子背景噪音，其可能是由非特异性扩增、或核苷酸、引物或模板的自发降解和水解导致的。非特异性扩增是指不是来自模板核酸的目标区域的核酸扩增产物。通常，这是由引物二聚体的形成和/或引物退火至模板DNA的非目标区域导致的。

[0113] 在一个实施方案中，设置混合物的总缓冲容量，使得背景噪音可以被忽略。例如，可以估计或通过实验来发现本方法过程中可能产生的背景噪音的量，并用pH变化来表示。试剂的缓冲容量可以提高至通过吸收由于背景所释放或消耗的质子来屏蔽背景的量(超过上文建议的用于提供检测下限的最小量)。因此，除非且直到有足够的质子释放(其应当对应于目标模板核酸的特异性核苷酸插入)，pH传感器或指示剂不能检测到信号。

[0114] 在一个实施方案中，将DNA样品和试剂加入到多个微流体腔中。在一个示例性实施方案中，在没有缓冲剂时，由背景导致的pH降低估计为0.1pH。向各个腔中提供少量的缓冲剂来屏蔽该估计的作用。在化学反应发生之前、过程中和之后监测传感器信号。只在释放大量质子的核酸扩增反应的腔中，传感器信号有可检测到的变化。因此，在一个实施方案中，缓冲容量大于0.5mM。

[0115] 不同的试剂(例如等位基因特异性引物)可以用于检测样品中遗传生物标记的存在或缺失。该反应可以为DNA的扩增，并且所述试剂可以包含适于热循环或等温扩增的引物和核苷酸。随着目标DNA在一个或多个腔中的扩增，质子释放超出所估计的被缓冲剂屏蔽的背景作用。pH变化通过传感器信号的变化而被检测。