洋酸浆控制器官大小蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种洋酸浆控制器官大小蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的洋酸浆蛋白（POS1）是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将（a）所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与调控花、果实和/或种子大小相关的蛋白质。实验证明，过表达POS1转基因植株表现出花器官增大、果实增大、种子增大。本发明在果蔬作物，特别是酸浆属作物的遗传改良等行业领域具有广阔的市场和应用前景。

权利要求

1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是序列表中序列2所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。

5.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。

6.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组菌。

7.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于：所述重组表达载体中，启动所述基因的转录的启动子为35S启动子。

9.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4或7或

8所述的重组载体，或权利要求5所述的表达盒，或权利要求6所述的重组菌在如下任一中的应用：(a1)调控植物的花的大小；

(a2)调控植物的果实的重量；

(a3)调控植物的果实的体积；

(a4)调控植物种子的重量；

(a5)选育花增大的植物品种；

(a6)选育果实重量增加的植物品种；

(a7)选育果实体积增大的植物品种；

(a8)选育种子重量增加的植物品种；

所述植物为酸浆属植物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述花的大小体现在如下中的至少一种：花萼的大小、花冠的大小、雄蕊的大小和子房的大小；所述花增大体现在如下中的至少一种：花萼增大、花冠增大、雄蕊增大和子房增大。

11.培育具有如下目的性状中至少一种的转基因植物的方法，包括如下步骤：a)向目的植物中导入权利要求1所述蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下b1)-b4)目的性状中至少一种的转基因植物：b1)花增大；

b2)果实重量增加；

b3)果实体积增大；

b4)种子重量增加；

所述植物为酸浆属植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述花增大体现在如下中的至少一种：花萼增大、花冠增大、雄蕊增大和子房增大。

说明书

洋酸浆控制器官大小蛋白及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种洋酸浆控制器官大小蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 酸浆属（Physalis）植物约70种以上，大多数分布于美洲。我国有酸浆P.alkekengi等6种，南北均产之。酸浆属植物为一年生或多年生草本；叶互生，但常2枚聚生，单叶，常具不规则的深波状齿，稀羽状深裂；花通常腋生或腋上生，蓝色、深黄色或白色；花萼钟状，5齿裂，受精后随浆果发育扩大而成灯笼状，完全包裹浆果；花冠辐状或辐状钟形，有褶襞，5浅裂或五角形；雄蕊5，着生于花冠近基部，花丝基部扩大，花药纵裂；子房2室，柱头不明显浅裂；胚珠多数；浆果球形，包藏于灯笼状的果萼内；种子多颗，扁平，盘形或肾形，表面有网状小窝孔。酸浆属一些植物已经成为新兴的药食同源的果蔬作物，其浆果大小是重要的驯化性状之一。酸浆属植物的浆果大小存在明显的多样性，而形成这种多样性的分子机制尚不清楚。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种洋酸浆控制器官大小蛋白及其编码基因与应用。

[0004] 本发明所提供的蛋白质，名称为Physalis Organ Size1（简称POS1），来源于洋酸浆（Physalis floridana），是如下（a）或（b）：

[0005] （a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

[0006] （b）将（a）所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与调控花、果实和/或种子大小相关的蛋白质。

[0007] 为了便于POS1蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

[0008] 表：标签的序列

[0009]标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL

[0010] 上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

[0011] 编码所述POS1蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

[0012] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

[0013] 在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述POS1蛋白的基因（命名为POS1）；所述POS1基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：

[0014] 1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

[0015] 2）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码所述POS1蛋白的DNA分子；

[0016] 3）与1）或2）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述POS1蛋白的DNA分子。

[0017] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

[0018] 其中，序列2由1020个核苷酸组成，第1-1020位为ORF，编码序列表中序列1所示的POS1蛋白。

[0019] 其它酸浆属植物中POS1蛋白及其编码基因的直系同源序列也属于本发明的保护范围。

[0020] 含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

[0021] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

[0022] 在本发明的一个实施例中，所述重组克隆载体具体为将所述核酸分子（基因）连入pGEM-T Easy载体所得的重组克隆载体。

[0023] 所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

[0024] 在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述POS1基因转录的启动子具体为35S启动子。

[0025] 更为具体的，所述重组表达载体为在pBAR载体的酶切位点中插入所述POS1基因得到的重组质粒。所述酶切位点具体为Apa I和Kpn I。

[0026] 所述表达盒由能够启动所述POS1基因表达的启动子，所述POS1基因，以及转录终止序列组成。

[0027] 所述POS1蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

[0028] （a1）调控植物的花的大小；

[0029] （a2）调控植物的果实的重量；

[0030] （a3）调控植物的果实的体积；

[0031] （a4）调控植物种子的重量；

[0032] （a5）选育花增大的植物品种；

[0033] （a6）选育果实重量增加的植物品种；

[0034] （a7）选育果实体积增大的植物品种；

[0035] （a8）选育种子重量增加的植物品种。

[0036] 在本发明中，所述调控植株的花的大小体现在：在所述植物体内，若所述POS1基因的表达量越高，则所述植物的花越大。所述调控植株的果实的重量体现在：在所述植物体内，若所述POS1基因的表达量越高，则所述植物的果实的重量越重。所述调控植株的果实的体积体现在：在所述植物体内，若所述POS1基因的表达量越高，则所述植物的果实的体积越大。所述调控植株的种子的重量体现在：在所述植物体内，若所述POS1基因的表达量越高，则所述植物的种子的重量（百粒重）越重。

[0037] 在本发明中，所述选育花增大的植物品种的方法、所述选育果实重量增加的植物品种的方法、所述选育果实体积增大的植物品种的方法，以及所述选育种子重量增加的植物品种的方法，均具体可包括将所述POS1基因表达量较高的植株作为亲本进行杂交的步骤。

[0038] 本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

[0039] 本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可包括如下步骤：

[0040] a）向目的植物中导入所述POS1基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

[0041] b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，具有如下b1）-b4）目的性状中至少一种的转基因植物：

[0042] b1）花增大；

[0043] b2）果实重量增加；

[0044] b3）果实体积增大；

[0045] b4）种子重量增加。

[0046] 所述POS1蛋白在所述转基因植物中的表达量高于所述目的植物；编码所述POS1蛋白的基因（即POS1基因）是所述基因是如下1）至3）中任一所述的DNA分子：

[0047] 1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

[0048] 2）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述POS1蛋白的DNA分子；

[0049] 3）与1）或2）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述POS1蛋白的DNA分子。

[0050] 上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

[0051] 所述POS1基因具体可通过上述任一所述重组表达载体导入所述目的植物中，得到所述转基因植物。具体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法将所述重组表达载体转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。农杆菌介导等生物学方法转化到植物细胞或组织中。

[0052] 在上述应用或方法中，所述花的大小体现在如下中的至少一种：花萼的大小、花冠的大小、雄蕊的大小和/或子房的大小；所述花增大体现在如下中的至少一种：花萼增大、花冠增大、雄蕊增大和/或子房增大。

[0053] 在上述应用或方法中，所述花具体可为成熟花；所述果实具体可为成熟果实；所述种子具体可为成熟果实中的种子。

[0054] 在上述应用或方法中，所述植物可为酸浆属植物。

[0055] 在本发明中，所述植物具体为酸浆属植物洋酸浆（Physalis floridana）。在本发明的一个实施例中，所述植物具体为洋酸浆（Physalis floridana）P106。

[0056] 实验证明，过表达POS1转基因植株表现出花器官增大、果实增大、种子增大。本发明在果蔬作物，特别是酸浆属作物的遗传改良等行业领域具有广阔的市场和应用前景。

附图说明

[0057] 图1为重组表达载体pBAR-POS1和TRV2-POS1的PCR鉴定图谱。其中，A为重组表达载体pBAR-POS1的PCR鉴定图谱，M：DNA分子量标准2000bp，1000bp，750bp，500bp，200bp，100bp。1：重组表达载体pBAR-POS1中POS1全长cDNA；B为重组表达载体TRV2-POS1的PCR鉴定图谱，M：DNA分子量标准2000bp，1000bp，750bp，500bp，200bp，100bp。1：重组表达载体TRV2-POS1中POS1cDNA片段。

[0058] 图2为POS1转基因洋酸浆植株中POS1基因表达量的实时荧光定量PCR分析结果。其中，wt表示未转基因的野生型洋酸浆；1表示POS1转基因洋酸浆植株L3；2表示POS1转基因洋酸浆植株L5；3表示POS1转基因洋酸浆植株L9。黑色柱表示POS1基因在花中的相对表达量；灰色柱表示POS1基因在果中的相对表达量。

[0059] 图3为POS1转基因洋酸浆植株的表型观察。A：花；B：果实；C：种子。A、B和C的比例尺均为5mm。

[0060] 图4为VIGS植株鉴定和表型观察。A：未转基因的野生型洋酸浆植株（WT）和POS1基因沉默洋酸浆（VIGS）花中POS1基因的相对表达量（菱形方框所示折线图）以及成熟花大小（花冠大小）统计分析（灰色柱形图），根据成熟花大小（花冠大小）将VIGS植株划分为I、II和III级；B：各级成熟花的表型；C：各级果实的表型。B和C的比例尺均为1mm，B和C中的VI、VII和VIII分别表示I、II和III级。

具体实施方式

[0061] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0062] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0063] pBAR 载 体：记 载 于“He CY,Tian Y,Saedler R,Efremova N,Riss S,Khan MR,Yephremov A,Saedler H.(2010)The MADS-domain protein MPF1 of Physalis floridana controls plant architecture,seed development and flowering time.Planta231:767-777.”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。

[0064] TRV2载体和TRV1载体：均记载于“Liu Y,Schiff M,Dinesh-Kumar SP.(2002)Virus-induced gene silencing in tomato.Plant J.31:777-786.”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。

[0065] 农杆菌LBA4404：记载于“He CY,Saedler H.(2005)Heterotopic expression of MPF2is the key to the evolution of the Chinese lantern of Physalis,a morphological novelty in Solanaceae.Proc Natl Acad Sci USA.102:5779-5784.”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。

[0066] 农 杆 菌 GV3101：记 载 于“Zhao J,Tian Y,Zhang JS,Zhao M,Gong P,Riss S,Saedler R,He CY.(2013)The euAP1protein MPF3represses MPF2to specify floral calyx identity and displays crucial roles in Chinese lantern development in Physalis.Plant Cell 25:2002-2021.”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。

[0067] 洋 酸 浆（Physalis floridana）P106：记 载 于“He C,Saedler H.(2005)Heterotopic expression of MPF2is the key to the evolution of the Chinese lantern of Physalis,a morphological novelty in Solanaceae.Proc Natl Acad Sci USA.102:5779-5784.”一文，公众可从中国科学院植物研究所获得。

[0068] 实施例1、洋酸浆POS1基因的获得

[0069] 根据前期cDNA-AFLP得到的部分cDNA序列，通过5’和3’-RACE技术，以洋酸浆（Physalis floridana）P106的成熟花的cDNA为模板进行扩增，经测序后得到POS1基因的cDNA序列。其开放阅读框（ORF）序列如序列表中序列2所示。

[0070] 为了进一步验证以上经过5’和3’-RACE技术获得的POS1基因的ORF确实为序列表中的序列2。本发明的发明人进行了如下实验：

[0071] 根据序列2设计了扩增其全长的引物对（POS1-F和POS1-R）。以洋酸浆（Physalis floridana）P106的成熟花为实验材料，将其取下后立即置于液氮中冷冻备用。将100mg经液氮充分研磨的洋酸浆（Physalis floridana）P106的成熟花用Trizol试剂盒提取总RNA。进一步将所得总RNA采用M-MLVreverse transcriptase(Invitrogen)试剂盒进行反转录，获得cDNA。相关操作均按照试剂盒说明书进行。以所得cDNA为模板，采用引物POS1-F和POS1-R进行扩增。

[0072] POS1-F：5’-GGGCCCATGTCCGCTCATGAGCTTCTCG-3’（下划线部分为酶切位点Apa I的识别位点，其后的序列为序列2的第1-22位）；

[0073] POS1-R：5’-GGTACCTTAGGGATCCGCCTGAGGTAGG-3’（下划线部分为酶切位点Kpn I的识别位点，其后的序列为序列2的第999-1020位的反向互补序列）。

[0074] 将所得PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行纯化回收，回收片段与pGEM-T Easy载体（promega公司）连接。将重组子命名为pTE-POS1。送交测序公司测序验证。测序结果显示，重组子pTE-POS1中的外源基因序列为“GGGCCC+序列2+GGTACC”，与预期一致。将序列2所示基因命名为POS1，整个序列2即为其开放阅读框，编码序列表中序列1所示的蛋白质（命名为POS1）。

[0075] 实施例2、重组表达载体的构建及鉴定

[0076] 一、重组表达载体pBAR-POS1的构建及鉴定

[0077] 本发明的发明人为了研究POS1基因的功能，将靠近POS1基因ORF构建到pBAR载体上，获得超表达载体。具体如下：

[0078] 1、重组表达载体pBAR-POS1的构建

[0079] 以限制性内切酶Apa I和Kpn Ⅰ酶切实施例1得到的重组质粒pTE-POS1，回收大小约为1020bp的目的条带，将其与经过同样双酶切的pBAR载体的骨架大片段相连，得到重组质粒，将其命名为pBAR-POS1。

[0080] 2、重组表达载体pBAR-POS1的鉴定

[0081] 以重组表达载体pBAR-POS1为模板，采用引物POS1-F和POS1-R（序列同上）进行PCR扩增，所得电泳图谱见图1中A。从图中可以看出，PCR产物大小约为1020bp，与预期结果一致。

[0082] 进一步，对重组表达载体pBAR-POS1进行测序，结果表明，重组表达载体pBAR-POS1的结构描述如下：在重组表达载体的酶切位点Apa I和Kpn Ⅰ之间插入了序列表中序列2后得到的重组质粒。

[0083] 在重组表达载体pBAR-POS1中，启动所述POS1基因（序列2）转录的启动子为35S启动子。

[0084] 二、VIGS载体的构建及鉴定

[0085] 本发明的发明人用病毒诱导的基因沉默技术（virus induced gene silencing，VIGS）进一步研究POS1基因的功能。将靠近POS1基因3’端的474bp构建到TRV2载体上。具体如下：

[0086] 1、TRV2-POS1载体的构建

[0087] 以实施例1得到的重组质粒pTE-POS1为模版，用引物VIGS-F和VIGS-R扩增，得到目的片段后，送PCR产物测序正确。用EcoR I和Kpn I双酶切TRV2载体和目的片段后，将目的片段连接入TRV2载体骨架大片段，得到重组质粒，将其命名为TRV2-POS1。

[0088] VIGS-F：5'-CGGAATTCATTTCCCAAGTCTTTCCACG-3'（下划线部分为EcoR I酶切位点，其后的序列为序列2的547-566位）；

[0089] VIGS-R：5'-CGGGTACCTTAGGGATCCGCCTGAGGTAGG-3'（下划线部分为Kpn I酶切位点，其后的序列为序列2的第999-1020位的反向互补序列）。

[0090] 2、TRV2-POS1载体的鉴定

[0091] 以重组表达载体TRV2-POS1为模板，采用引物VIGS-F和VIGS-R（序列同上）进行PCR扩增，所得电泳图谱见图1中B。从图中可以看出，PCR产物大小约为474bp，与预期结果一致。

[0092] 进一步，对重组表达载体TRV2-POS1进行测序，结果表明，重组表达载体TRV2-POS1的结构描述如下：在重组表达载体的酶切位点EcoR I和Kpn I之间插入了序列表中序列2的第547-1020位后得到的重组质粒。

[0093] 实施例3、POS1转基因洋酸浆的获得及功能鉴定

[0094] 一、POS1转基因洋酸浆的获得及鉴定

[0095] 1、POS1转基因洋酸浆及转入pBAR空载体洋酸浆植株的获得

[0096] 将实施例2构建的重组表达载体pBAR-POS1通过电击法导入农杆菌LBA4404感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物POS1-F和POS1-R（序列同上）组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有POS1基因（PCR目的条带大小约为1020bp）的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pBAR-POS1。

[0097] 同时设置转入pBAR空载体的对照。将转入pBAR空载体的农杆菌LBA4404命名为LBA4404/pBAR。

[0098] 用所得重组农杆菌侵染洋酸浆愈伤组织。具体操作方法如下：

[0099] （1）取构建成功的阳性农杆菌（LBA4404/pBAR-POS1或LBA4404/pBAR）接种于5mL的YEB液体培养基，28℃，摇床转速200-250rpm，振荡培养2d。

[0100] （2）将上述培养好的菌液按1:100（体积比）比例接种于100mL的YEB液体培养基中，28℃，摇床转速200-250rpm，振荡培养至OD600=0.4-0.6。

[0101] （3）4000g，离心5min收集菌体。

[0102] （4）用50mL的MS液体培养基重悬菌体。

[0103] （5）剪取洋酸浆（Physalis floridana）P106无菌苗的子叶部分作为用于侵染的外植体，将其浸入步骤（4）所得菌体中黑暗培养1h。

[0104] （6）将侵染好的外植体用MS液体培养基清洗去多余的菌液，用灭菌的干净滤纸吸干外植体上的残余液体，将外植体放于MS固体培养基平板上（含AS15mg/L），黑暗培养1-2d。

[0105] （7）待农杆菌长出后，用MS液体培养基（含Cef300mg/L）清洗外植体上多余的菌体，用灭菌的干净滤纸吸干外植体上的残余液体，将外植体放于MS分化平板上（含Cef300mg/L，6-BA2.816mg/L和NAA0.186mg/L）。25℃，16h光照培养。

[0106] （8）每两周继代一次。继代两次后，转入筛选平板（含Cef300mg/L，6-BA2.816mg/L，NAA0.186mg/L和PPT5mg/L）。

[0107] （9）每两周继代一次，筛选愈伤组织，诱导至再生芽产生。

[0108] （10）当抗性芽长到2cm时，将其切下换到1/2MS培养基（含Cef300mg/L和PPT5mg/L）上面生根，待根生长好后练苗，即可移栽温室。获得转基因T0代植株。

[0109] 转基因T0代植株在含有草甘膦（PPT，5mg/L）和头孢噻吩钠（Claforan，5mg/L）的1/2MS培养基上进行筛选，获得两种转基因抗性苗，即转入pBAR-POS1的洋酸浆植株和转入pBAR空载体的洋酸浆植株（T1代）。

[0110] 2、POS1转基因洋酸浆的分子鉴定

[0111] 从步骤1获得的T1代POS1转基因洋酸浆，以及转入pBAR空载体的对照植株中分别提取基因组DNA。根据载体上带有的标记基因（BAR），设计引物BAR-F和BAR-R（引物序列如下），对所有转基因植株进行PCR鉴定，经鉴定表明含有BAR基因的（PCR产物大小约为300bp）植株即为转基因阳性植株。

[0112] BAR-F：5’-GAGTGCTTGCGGCAGCGTGAAG-3’；

[0113] BAR-R：5’-CTGAAGGCGGGAAACGACAATC-3’。

[0114] 经上述PCR分子鉴定，将鉴定阳性的其中三个POS1转基因洋酸浆株系分别记作L3、L5和L9。

[0115] 3、POS1转基因洋酸浆中POS1基因在转录水平表达量的检测

[0116] 以上述获得的T1代POS1转基因洋酸浆L3、L5和L9三个株系，以及转入pBAR空载体的洋酸浆植株和未转基因的野生型洋酸浆植株为实验材料。提取各实验材料的花和果的总RNA，并反转录获得cDNA，进而通过实时荧光定量PCR方法分析POS1基因在各实验材料中的表达情况。

[0117] 其中，扩增POS1基因的引物序列为：

[0118] 引物1：5’-CAGTGATGCCACGGACTCGTCTAAT-3’（序列2的第141-165位），[0119] 引物2：5’-CCGAGGAGAAGGTTGAAGAAGAG-3’（序列2的第632-654位的反向互补序列）。

[0120] 以PFACTIN作为内参基因，扩增内参PFACTIN的引物序列为：

[0121] 引物3：5’-GGGTATGCCCTTCCACATGCCA-3’，

[0122] 引物4：5’-GAGCCTCCAATCCAGACACTGATT-3’。

[0123] 实时荧光定量PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq5μL，正向引物（20μM）0.25μL，反向引物（20μM）0.25μL，cDNA模板0.5μL，ddH2O补至10μL。

[0124] 实时荧光定量PCR反应程序：95℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒，40个循环。72℃，5分钟。

[0125] 数值分析：Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，-ΔCtΔCt=Ct(Gene)-Ct(Actin)，以2 的值衡量基因转录水平，分析各基因的表达情况。

[0126] 实验重复三次，结果取平均值。

[0127] 各遗传材料中POS1基因表达量的分析结果如图2所示。POS1基因的表达均为相对值，以POS1在野生型洋酸浆花中的表达量为1。从图中可以看出，无论在花中还是在果中，相比未转基因的野生型洋酸浆，POS1转基因洋酸浆L3、L5和L9中POS1基因的表达量显著提高。而转入pBAR空载体的洋酸浆植株中POS1基因的表达量与未转基因的野生型洋酸浆相比基本一致，无统计学差异。

[0128] 二、POS1基因控制器官大小的功能鉴定

[0129] 以上述获得的T1代POS1转基因L3、L5和L9三个株系，以及转入pBAR空载体的洋酸浆植株和未转基因的野生型洋酸浆植株（WT）为实验材料。

[0130] 对同步生长的各实验材料的成熟花、成熟果实和种子进行测量、统计、分析。具体方法如下：（1）花各轮器官：利用扫描仪（hp scanjet5590）成像，并用AxioVision Rel.4.7图像测量统计软件测量统计花各轮器官（花萼、花冠、雄蕊和子房）的大小，花萼大小用从花萼顶端到花托的距离表示，花冠大小用花瓣顶端到花托的距离表示，雄蕊大小用雄蕊的长度表示，子房的长度不包括花柱的部分。（2）果实：待果实成熟后，对所有的成熟果实测重，取平均值代表果实的重量；将果实完全浸入装有水的量筒中，水面上升的刻度即为果实的体积，取平均值代表果实的体积。（3）种子：待果实成熟，取出种子，烘干，测百粒重。每个实验材料的每一项参数均保证样本数为12-15个。

[0131] 实验重复三次，结果取平均值。

[0132] 结果显示，3个POS1转基因洋酸浆株系L3、L5和L9的花、果实和种子均变大（图3）。另外，花各轮器官的大小、果实重量和体积、种子百粒重增幅（与未转基因的野生型洋酸浆植株相比）的统计结果见表1。

[0133] 实施例4、POS1基因沉默洋酸浆的获得及功能鉴定

[0134] 一、POS1基因沉默洋酸浆的获得及鉴定

[0135] 1、POS1基因沉默洋酸浆的获得

[0136] 一方面，将实施例2构建的重组表达载体TRV2-POS1通过电击法导入农杆菌GV3101感受态。对转化后的重组农杆菌用由引物VIGS-F和VIGS-R（序列同上）组成的引物对进行PCR鉴定。将经鉴定表明含有大小约为474bp目的片段的重组农杆菌命名为GV3101/TRV2-POS1。同时设置转入TRV2空载体的对照。将转入TRV2空载体的重组农杆菌命名为GV3101/TRV2。

[0137] 另一方面，将TRV1载体通过电击法导入农杆菌GV3101感受态，将得到的重组农杆菌命名为GV3101/TRV1。

[0138] 将相同浓度的重组农杆菌GV3101/TRV2-POS1（或GV3101/TRV2）和重组农杆菌GV3101/TRV1按照体积比1：1的比例共同注射进入生长2周左右的洋酸浆（Physalis floridana）P106叶片中。获得转化植物。

[0139] 2、POS1基因沉默洋酸浆的鉴定

[0140] 侵染两周后，对每朵花剪取2个花萼、2个花瓣、2个雄蕊，混合提取RNA并保留标记该花，共从100朵花上取样。利用实时荧光定量PCR方法检测每朵花相应POS1基因表达量（具体操作参见实施例3步骤一3中所述），并在果实成熟时统计上述处理标记过的浆果重量。同时以未转基因的野生型洋酸浆植株为对照。其中，未转基因的野生型洋酸浆植株（WT）取样8株；POS1基因沉默洋酸浆（VIGS）取样29株。

[0141] 鉴定结果如图4中A（菱形方框所示折线图）所示。可见，未转基因的野生型洋酸浆植株（WT）中POS1基因的相对表达量在整体上高于POS1基因沉默洋酸浆（VIGS）。

[0142] 二、POS1基因沉默的洋酸浆的功能鉴定

[0143] 将步骤一获得的转化植株（转入TRV2-POS1和TRV1的植株，以及转入TRV2空载体和TRV1的对照植株）生长在长日照（16h），温度为22-25℃的温室中观察表型。同时以未经处理的野生型洋酸浆植株为对照（WT）。对各遗传材料的花各轮器官（花萼、花冠、雄蕊和子房）的大小、果实重量和体积进行观察和统计分析。其中，花各轮器官的大小是在成熟花时期进行统计分析的；果实重量和体积在成熟果时期进行统计分析的。每个实验材料的每一项参数均保证样本数为100。

[0144] 具体方法如下：（1）花各轮器官：利用扫描仪（hp scanjet5590）成像，并用AxioVision Rel.4.7图像测量统计软件测量统计花各轮器官（花萼、花冠、雄蕊和子房）的大小，花萼大小用从花萼顶端到花托的距离表示，花冠大小用花瓣顶端到花托的距离表示，雄蕊大小用雄蕊的长度表示，子房的长度不包括花柱的部分，共100朵花。（2）果实：待果实成熟后，对所有的成熟果实测重，取平均值代表果实的重量；将果实完全浸入装有水的量筒中，水面上升的刻度即为果实的体积，取平均值代表果实的体积。

[0145] 实验重复三次，结果取平均值。

[0146] 结果显示，通过VIGS抑制POS1基因的表达后，花和果实的大小也发生了变化，依据各植株成熟花的大小（花冠的大小）将POS1基因沉默洋酸浆（VIGS）划分为I、II和III级（图4）。I级花果大小与野生型相比无明显变化（POS1基因的表达量与野生型无统计学差异）；II和III级花果大小都明显变小（POS1基因的表达量显著低于野生型）（图4），花各轮器官的大小、果实重量和体积降幅的统计结果见表1。

[0147] 表1POS1超表达和VIGS转基因植株花、果实和种子大小变化幅度

[0148]

[0149]

[0150] 注：POS1-P106VIGS为实施例4获得的POS1基因沉默的洋酸浆，VI、VII、VIII分别表示I、II、III级；35S:POS1-P106为实施例3获得的POS1转基因洋酸浆。正数表示相对于野生型相应参数提高的百分比，负数表示相对于野生型相应参数降低的百分比，变化幅度的计算公式为：（实验组数值-野生型数值）/野生型数值×100%。

[0151] 综合以上实施例3和实施例4的结果，可见POS1基因调控了酸浆属植物的花、浆果和种子的大小。