转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂及检测方法

摘要

本发明公开了转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂及检测方法，以外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF为扩增靶序列，具有特异、敏感的优点；检测限可达到65.12ng/μL，并且具有良好的特异性。检测方法通过DNA提取和LAMP检测，反应管内颜色若变为绿色，则为转基因油菜籽MS8品系，对DNA模板质量要求不高，LAMP检测周期短，检测成本低，对技术人员的要求较低，操作过程简单，结果分析简单。

权利要求

1.转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂，包括2×LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和特异性引物，其特征在于所述特异性引物的核苷酸序列分别为：F3：TCGAATCATA TTCGTACTGT AGT

B3：AAAACCTCTC TTTGTAGAAA CA

FIP：GCCACTCGAA GGACAAATTT TAAAATTTTT ATGATCAAAG CGTCCTCABIP：AAGTGTCAAA CTCTCATCCA AACATTTTAT GCCATTTAGT TAACTAGTTG ALF：TGCTGTGGCC CATAAACCT。

2.利用权利要求1所述的转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂检测转基因油菜籽MS8品系的方法，其特征在于步骤如下：A、DNA提取：油菜籽样品粉末用DNA提取试剂盒提取，得到DNA模板，具体依DNA提取试剂盒说明书进行；

B、LAMP检测：25μL反应体系为2×LAMP反应缓冲液12.5μL，浓度为8U/μLBst DNA聚合酶1.5μL，浓度都为20μmol/L的引物F3和B3各为0.2μL，浓度为20μmol/L的引物LF为0.8μL，浓度都为20μmol/L的引物BIP和FIP各为1.6μL，DNA模板2.0μL，余量为双蒸水；LAMP反应条件为反应管在61℃恒温水浴锅中扩增1h，扩增结束后，8000r/min室温离心1min，染色剂SYBR Green I与扩增产物充分混合，反应管内颜色若变为绿色，则为转基因油菜籽MS8品系。

说明书

转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂及检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及转基因油菜籽的检测，具体涉及转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂及检测方法。

背景技术

[0002] 转基因食品在全世界一直就是极具争议性的问题。它对人的身体健康、自然环境和生态圈的影响，至今没有确定结论，其潜在的巨大风险却不可忽视。从1990年起，欧盟已先后颁布了10多项有关转基因生物安全性管理方面的法规，逐步形成了总体一般性法规与专项法规相配套的法律体系，要求对转基因作物的生产加以控制并加强管理。我国也颁布了《农业转基因生物安全管理条例》和《农业转基因生物标识管理办法》，并于2002年3月20日正式实施。对油菜籽等转基因产品的定性检测研究已取得成功，主要方法是快速检测试纸条法、PCR、ELISA等，每种方法都有其优缺点,如公开号为CN1420181的发明专利申请，就公开了用于转基因油菜籽实时荧光PCR检测的探针及试剂盒，但未对转基因油菜籽MS8可以实时检测的说明。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题是提供一种对转基因油菜籽MS8品系具有特异性高、检测周期短、成本低廉和操作简单的LAMP检测试剂及检测方法。

[0004] 本发明系选择参考参考GenBank中油菜籽MS8的基因序列。根据油菜籽内源基因左端与外源基因右端的边界位置，使用Primer Exploer V4（http://primer exlorer.jp）设计并筛选出1组特异性好、灵敏性高的特异性引物，引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

[0005] 本发明的转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂，包括2×LAMP反应缓冲液、Bst DNA聚合酶和特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列分别为：

[0006] F3：TCGAATCATA TTCGTACTGT AGT

[0007] B3：AAAACCTCTC TTTGTAGAAA CA

[0008] FIP：GCCACTCGAA GGACAAATTT TAAAATTTTT ATGATCAAAG CGTCCTCA[0009] BIP：AAGTGTCAAA CTCTCATCCA AACATTTTAT GCCATTTAGT TAACTAGTTG A[0010] LF：TGCTGTGGCC CATAAACCT。

[0011] 利用上述转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂检测转基因油菜籽MS8品系的方法，步骤如下：

[0012] A、DNA提取：油菜籽样品粉末用DNA提取试剂盒提取，得到DNA模板，具体依DNA提取试剂盒说明书进行；

[0013] B、LAMP检测：25μL反应体系为2×LAMP反应缓冲液12.5μL，浓度为8U/μLBst DNA聚合酶1.5μL，浓度都为20μmol/L的引物F3和B3各为0.2μL，浓度为20μmol/L的引物LF为0.8μL，浓度都为20μmol/L的引物BIP和FIP各为1.6μL，DNA模板2.0μL，余量为双蒸水；LAMP反应条件为反应管在61℃恒温水浴锅中扩增1h，扩增结束后，8000r/min室温离心1min，染色剂SYBR Green I与扩增产物充分混合，反应管内颜色若变为绿色，则为转基因油菜籽MS8品系。

[0014] 本发明的转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂及检测方法，以外引物F3和B3，内引物FIP和BIP，环引物LF为扩增靶序列，具有特异、敏感的优点；检测限可达到65.12ng/μL，并且具有良好的特异性。检测方法通过DNA提取和LAMP检测，反应管内颜色若变为绿色，则为转基因油菜籽MS8品系，对DNA模板质量要求不高，LAMP检测周期短，检测成本低，对技术人员的要求较低，操作过程简单，结果分析简单。

具体实施方式

[0015] 以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

[0016] 实施例1、转基因油菜籽MS8品系的LAMP检测试剂

[0017] 以25μL反应体系：2×LAMP反应缓冲液12.5μL，浓度8U/μL的Bst DNA聚合酶1.5μL，浓度都为20μmol/L的引物F3和B3各为0.2μL，浓度为20μmol/L的引物LF为
0.8μL，浓度都为20μmol/L的引物BIP和FIP各为1.6μL。LAMP反应缓冲液和BstDNA聚合酶购于NEW ENGLAND Biolabs公司。

[0018] 实施例2、DNA提取

[0019] DNA提取按 Plant Mini Kit试剂（购自德国QIAGEN公司）操作说明提取：50mg转基因油菜籽样品粉末装入1.5mL离心管中，加入500μL缓冲液AP1，在65℃的振荡恒温金属浴内振荡15min；加入130μLAP2，上下颠倒充分混匀后，在4℃冰箱内静置5min，使核酸沉淀；用12000r/min室温离心5min，取上清液500μL转至2mL收集管中；将收集管放入QIAcube核酸自动提取仪内，选择DNeasy Plant Mini模式，自动提取DNA，使用U-0080D生物分光光度计测定OD260及OD280值，计算DNA浓度；取出DNA样品模板，储存于-20℃冰箱中备用。

[0020] 实施例3、LAMP检测

[0021] 25μL反应体系为2×LAMP反应缓冲液12.5μL，浓度为8U/μL Bst DNA聚合酶1.5μL，浓度都为20μmol/L的引物F3和B3各为0.2μL，浓度为20μmol/L的引物LF为
0.8μL，浓度都为20μmol/L的引物BIP和FIP各为1.6μL，DNA模板2.0μL，余量为双蒸水；LAMP反应条件为反应管在61℃恒温水浴锅中扩增1h，扩增结束后，8000r/min室温离心
1min，染色剂SYBR Green I与扩增产物充分混合，反应管内颜色若变为绿色，则为转基因油菜籽MS8品系，其中染色剂SYBR Green I在反应混合液后滴入0.1μL在反应管的管盖上，扩增结束离心后再与扩增产物充分混合，这样待反应结束后在不开盖的情况下直接使染色剂与扩增产物混合，以此减少反复开盖而造成的污染问题。

[0022] 实施例4、特异性和敏感性试验

[0023] 用实施例1的反应体系对验证的转基因油菜籽MS8、非转基因油菜和非MS8品系的转基因油菜籽进行实施例2的DNA提取和实施例3的LAMP扩增检测，比较它们的特异性，结果只是转基因油菜籽MS8的反应管内颜色变为绿色；说明具有很好的特异性。对转基因0 ﹣1 ﹣2 ﹣3 ﹣4
油菜籽MS8的DNA模板含量为32.56μg/μL，DNA模板进行10、10 、10 、10 、10 、10﹣5 ﹣6 -1 -3 -4
、10 稀释再LAMP检测，当稀释10 ～10 时，反应管颜色变为绿色；而当稀释10 及以上时，反应管未变色。故本实验建立的转基因油菜籽MS8品系LAMP检测方法的检测限为-3
原液稀释10 ，即65.12ng/μL。