玉米Opaque1基因的分子标记及其应用

摘要

本发明涉及一种玉米Opaque1基因的分子标记及其应用。该分子标记是通过PCR扩增特异性引物，得到的一种共显性分子标记MYO-PD，所述的特异性引物为SEQIDNO.1～SEQIDNO.2所示的碱基序列。利用这个与o1基因完全连锁的分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中o1基因的存在与否以及杂合或纯合状态。同时，利用这个分子标记能区分突变体与10种国内主要育种亲本，能够在任何育种背景群体中准确检测到o1基因的存在，且错选率为0。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用o1基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

权利要求

1.一种玉米Opaque1基因的分子标记，其特征在于该分子标记是通过PCR扩增特异性引物，得到的一种共显性分子标记MYO-PD，所述的特异性引物为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的碱基序列。

2.一种根据权利要求1所述的高油高赖氨酸玉米Opaque1基因的分子标记在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。

说明书

玉米Opaque1基因的分子标记及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种玉米Opaque1 基因的分子标记及其应用。技术背景

[0002] 全球正经历着持续的冲击：粮食危机、螺旋式上升的能源消费、气候变暖的加剧以及近来的经济衰退。粮食危机引发的骚乱在各大洲时有发生。作为食品、饲料和燃料的重要来源，农作物的全球需求和消耗正在急剧增加。特别是，新兴国家饮食结构的调整：肉类消费不断增加；以及发达国家利用粮食生产生物燃料的加速。这使得粮食问题日益凸现，已成为制约世界经济发展及安全的关键因素之一。因此，只有通过不断提高农作物的产量，在世界有限的耕地上生产出更多的粮食，才能满足社会需求，维持世界安全和全球经济可持续发展。

[0003] 玉米是世界上是世界上分布最广的作物之一，栽培面积仅次于小麦和水稻。它是世界上同时也是我国主要的粮食和饲料作物。从1998年起，玉米总产量已超过小麦和水稻成为世界第一大粮食作物。我国从1995年开始玉米的总产量已超过小麦，成为仅次于水稻的第二大粮食作物。预计到2017年，全球玉米和小麦的年产量需要再增加2亿吨才能满足全世界的需求。为应对世界粮食危机，保证国家粮食安全，我国提出了构建粮食核心区、到2020年再增产粮食1000亿斤的战略目标，其中需要新增玉米400亿斤(全国新增1000亿斤粮食生产能力规划2009-2020年, 2009, 国务院)。因此，这对玉米产量和品质的改良与创新提出了更高的要求。

[0004] 玉米(Zea mays)，亦称包谷、苞米、棒子，属于禾本科(Gramineae)玉蜀黍族 (Maydeae)一年生草本植物。与其它作物相比，玉米具有以下优点：巨大的突变体库、较大的异染色质区段、很高的核苷酸多态性以及其基因与近缘草本共线(colinearity)。因此，玉米已成为遗传学、细胞学和基因组学研究的中心系统。同时，作为光合高效的C4植物，玉米已被列为研究生物产量和质量相关机制生物质能源的模式系统。2009年，随着2.3Gb玉米B73自交系草图序列在Science杂志上发表，这将对玉米驯化以及农艺性状的研究起着里程碑式的作用。

[0005] 籽粒是玉米营养物质的重要储存器官。它主要由来源于双受精的胚和胚乳组成，并且表面有种皮包被。在典型的马齿(dent)玉米品种中，胚乳由物理特性不同的几个部分组成。其最外层是糊粉层(aleurone)，由一些特化的细胞组成，在种子萌发过程中能够分泌水解酶。糊粉层下面就是粉质胚乳细胞(starchy endosperm cells)，充斥着淀粉和储藏蛋白，这些细胞形成两种结构不同的区域：分布于外围的玻璃质(vitreous)胚乳和内部的粉质(starchy)胚乳。

[0006] 通常，玉米胚乳含有90%的淀粉和10%的蛋白。而这些蛋白中70%的成分是醇溶蛋白，也称作玉米蛋白(zein)。然而，这些含量丰富的醇溶蛋白营养成分却很不平衡。它缺乏一些单胃动物必需的氨基酸，尤其是赖氨酸；它仅含有1.5-2%的赖氨酸，而最佳的人类营养比例是5%。而大多数粉质胚乳突变体都有一个共同的特征：赖氨酸的含量显著增加，从而改良了蛋白品质。其中，以opaque2的突变尤为显著，赖氨酸含量增加接近2倍。研究表明，大多数此类突变体蛋白品质的改善得益于非醇溶蛋白与醇溶蛋白的比例的增加。

[0007] 玉米胚乳突变体o2的发现为玉米品质改造创新提供了极为重要的基础。研究发现：o2通过减少醇溶蛋白的合成、增加其它富含赖氨酸的蛋白质，从而最终提高胚乳中赖氨酸的含量。但是，这种类型的突变会导致籽粒密度低、质地柔软、以及硬度下降。随之而来的是一些不利的农艺性状，例如籽粒很脆、易受虫害及不易储藏，产量也随之减低，极大降低了该类型突变体的商业价值。

[0008] 于是，玉米育种学家开始寻找能够改变o2 胚乳松软、粉质表型的修饰基因(modifier gene)，从而获得必需氨基酸含量增加且物理性质正常的籽粒。研究表明：调控o2 的修饰基因的位点有好几个；这些位点都能够有效地改善粉质胚乳突变体的不利农艺性状。南非和国际玉米和小麦改良中心的育种学家，通过将o2 修饰基因系统渗入o2种质的方法，最终获得了胚乳坚硬的o2 突变体，称为“优质蛋白玉米”(QPM, quality protein maize)。QPM表型和产量与正常玉米相似，但却保持了o2 的赖氨酸含量。这种种质创新极大地增加了玉米的商业价值，极大推动了玉米产业的发展。

[0009] 玉米籽粒品质性状的改造依赖于这些能够改良蛋白品质的高赖氨酸突变体。opaque1（o1）是玉米经典的粉质胚乳突变体，最早由Singleton和Jones发现，呈现出柔软、粉质的籽粒表型。o1突变体在特定遗传背景下（如A69Y等），能产生o2突变体类似的效应，赖氨酸含量增加，蛋白品质提高(Balconi et al., 1998)。如果能将o1 突变体引入生产品种，则能进一步提高籽粒的赖氨酸(lys)含量，培育出高赖氨酸(lys)含量的优质蛋白玉米新品种。因此，o1突变体可以改善玉米籽粒的蛋白品质，对培育高品质的玉米有很好的应用价值。

[0010] O1 虽然已经被克隆，但是O1 基因至今尚未通过杂交育种被很好地利用，主要是因为O1 由隐性基因突变引起，通过杂交选育需要较长的时间。DNA分子标记辅助育种是一项新的育种技术，该技术是通过利用与目标性状基因紧密连锁的DNA分子标记对控制目标性状的基因进行间接选择的现代育种技术。该技术对目标基因的转移，不仅可在早期进行准确、稳定的选择，而且可克服再度利用隐性基因识别难的问题，从而加速育种进程，提高育种效率。与常规育种相比，该技术可提高育种效率2-3倍。

[0011] DNA分子标记辅助育种技术的关键是：（1）获得的分子标记应该是能够区分育种过程中杂交亲本（纯合O1类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（F1代）的共显性标记；（2）获得的共显性分子标记与控制目标性状基因的连锁情况，连锁越紧密在其后代中错选的概率越低，如果该标记来源于控制目标性状基因，则利用该分子标记在其后代中错选的概率为零；（3）该标记可以区分突变体与国内所有主要育种亲本。以往研究中并没有获得位于O1基因上并且与其完全连锁的共显性DNA分子标记，故无法对该基因所控制的目标性状进行DNA分子标记辅助选择，同时，以往也为获得能够区分突变体与国内所有主要育种亲本的分析标记。所以，对于该种标记的获得和鉴定是对控制玉米籽粒高油高赖氨酸含量农艺性状的O1 基因进行DNA分子标记辅助育种的基础。

发明内容

[0012] 本发明的目的之一在于提供一种玉米Opaque1 基因的分子标记。

[0013] 本发明的目的之二在于提供该分子标记在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。

[0014] 为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0015] 一种玉米Opaque1 基因的分子标记，其特征在于该分子标记是通过PCR扩增特异性引物，得到的一种共显性分子标记MYO-PD，所述的特异性引物为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示的碱基序列。

[0016] 一种根据上述的高油高赖氨酸玉米Opaque1基因的分子标记在检测和区分玉米育种过程中杂交亲本以及它们杂交子代类型中的应用。。

[0017] 本发明利用高油高赖氨酸玉米（O1/O1）与其他具优良性状的玉米杂交获得F1代，F1代自交后筛选具有目的性状的高油高赖氨酸玉米F2，F2代多次自交，最终获得稳定的纯合体。

[0018] 本发明提供1个位于O1基因上并且与其完全连锁的共显性DNA分子标记，以及利用这个共显性DNA分子标记对O1 基因进行分子标记辅助选择的方法。利用这个分子标记能对玉米任何时期和任何组织的DNA进行基因型鉴定，检测杂交育种子代各单株中o1基因的存在与否以及杂合或纯合状态。利用这个分子标记能区分突变体与国内10种主要育种亲本，能够在任何育种背景群体中准确检测到o1基因的存在。这种检测方法的准确性高，操作简单，为利用o1 基因的DNA分子标记辅助育种提供重要的技术手段。

附图说明

[0019] 图1 o1 突变体和野生型籽粒中脂肪酸含量变化图

[0020] 图2为玉米籽粒纯合突变体外形图（o1/o1）；

[0021] 图3是玉米籽粒野生型（+/+）

[0022] 图4是用于进行O1 基因克隆的BC群体构建路线；

[0023] 图5标记MYO-PD在BC群体中的分离情况，其中1—5为o1/o1纯合体； 6—10为O1/+杂合体；

[0024] 图6是本发明中分子标记在玉米四号染色体长臂上的示意位置；

[0025] 图7是标记MYO-PD在10种国内不同育种自交系间的多态情况； +/-是杂合型对照，o1为o1/o1是突变体对照。

具体实施方式

[0026] 下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆（Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.）或植物分子生物学－实验手册（Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual, Melody S. Clark编， Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997）中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0027] 实施例一：利用o1突变体（o1/o1）培育高油高赖氨酸玉米

[0028] 与对应的野生型相比，o1 突变体籽粒总脂肪酸含量增加了10%左右，其中占玉米脂肪酸组分90%左右的三大组分C16:0，C18:1，C18:2都有显著性差异（表1，图1）。把o1突变纯合体（o1/o1）与其它具有优良生产性状的玉米杂交，然后F1代自交，在F2代中分离出高油高赖氨酸玉米籽粒的隐性纯合体。该隐性纯合体经多代自交，轮回选择，逐代选择籽粒发育好，赖氨酸含量高的种子，最终获得稳定的隐性纯合体，高油高赖氨酸自交系或群体，即获得高油高赖氨酸商品玉米。

[0029] 表1 o1 突变体及其对应野生型脂肪酸含量分析。

[0030]

[0031] 实施例二： 共显性分子标记的获得及与O1 基因连锁关系的确定[0032] 图2和图3为玉米籽粒野生型（+/+）与玉米籽粒纯合突变体（o1/o1）外形图。通过纯合突变体（o1/o1）与纯合野生型（+/+）杂交获得F1（o1/+），然后以F1为母本，纯合突变体为父本进行回交构建回交（BC）群体，参见图4。 BC群体中出现了基因型分离，包含o1/+与o1/o1两种基因型，参见图5，具有o1/+基因型的与+/+基因型的籽粒均为非Opaque的野生型类型籽粒，具有o1/o1基因型的籽粒为Opaque的突变体类型。

[0033] 本发明通过经典的遗传定位获知O1 基因定位在玉米第10号染色体的长臂上(Bin4.07)。通过在O1 位点附近为纯合突变体和纯合野生型的植株构建的回交群体（BC），提取纯合突变体、野生型以及BC群体各单株的基因组DNA，利用图位克隆的方法克隆了该基因，获得了该基因的DNA序列。经过序列分析表明，该基因在基因组上与野生型相比缺失了5个碱基，参见图6。等位突变体测序分析证实该基因即为O1基因。本研究依据突变基因o1 与野生型基因O1 的差别序列设计特异性引物，即共显性分子标记MYO-PD，通过扩增O1基因的特异片段，根据扩增条带的大小区分出纯合野生型和突变体以及杂合子的基因型。

[0034] 正向引物从5′端至3′端为：CAAGGGAGGCTTCAATTTCTA；

[0035] 反向引物从5′端至3′端为：GTCGCTCTCATGAACAAAACT；

[0036] 所得到共显性分子标记MYO-PD能够区分育种过程中杂交亲本（纯合o1类型和纯合野生型类型）以及它们杂交子代（F1代）的。

[0037] 由于该标记位于O1基因上，故该分子标记与该基因完全连锁，参见图6。使用这个分子标记进行辅助选择准确度很高，在任何背景下，标记MYO-PD与O1基因的交换率为0，使用这个标记确定O1基因的错选率为0。

[0038] 实施例三：分子标记在不同亲本间的多态性鉴定

[0039] 提取o1/o1突变体纯和，野生型纯和和B73、Mo17、W22、W64A、BSSS53等10种育种中广泛使用的自交系的基因组DNA，通过PCR反应分析在不同品种间的多态性。结果表明，使用本发明中的分子标记MYO-PD对o1 与B73、Mo17、W22、W64A、BSSS53等10种育种亲本DNA进行PCR扩增和凝胶电泳分析表明，MYO-PD在o1 与B73、Mo17、W22、W64A、BSSS53等10种育种亲本都具有多态性，参见图7。此结果证明，分子标记MYO-PD能够在任何育种背景群体中准确检测到o1基因的存在，可用于与这些育种材料培育高油高赖氨酸玉米时o1基因的辅助选择且错选率为0。