基于可调谐激光的STED超分辨显微镜

摘要

本发明涉及显微镜技术领域，提供的基于可调谐激光的STED超分辨显微镜包括激发光单元、损耗光单元、第一二色镜和扫描成像单元；激发光单元包括第一可调谐激光光源；损耗光单元包括第二可调谐激光光源、半玻片、涡旋相位片和四分之一波片；扫描成像单元包括第二二色镜、扫描振镜、扫描透镜、筒镜、物镜、针孔透镜和光电倍增管。本发明采用可调谐激光光源作为STED超分辨显微镜中的激发光光源和损耗光光源，由于激发光波长和损耗光波长均可以根据需要进行调节设置，对于给定的荧光染料，可以找到适合的激发光波长和损耗光波长，扩大了STED超分辨显微镜的适用范围。

权利要求

1.一种基于可调谐激光的STED超分辨显微镜，其特征在于，包括激发光单元、损耗光单元、第一二色镜和扫描成像单元；

所述激发光单元包括第一可调谐激光光源；所述损耗光单元包括第二可调谐激光光源、半玻片、涡旋相位片和四分之一波片，第二可调谐激光光源、半玻片、涡旋相位片和四分之一波片沿第二可调谐激光光源的发光光路依次设置；所述扫描成像单元包括第二二色镜、扫描振镜、扫描透镜、筒镜、物镜、针孔透镜和光电倍增管，扫描振镜、扫描透镜、筒镜、物镜沿第二二色镜的反射光路依次设置，针孔透镜和光电倍增管沿第二二色镜的透射光路依次设置；

所述第一二色镜用于连接激发光单元和损耗光单元，第一二色镜对激发光单元出射的激发光进行透射，对损耗光单元出射的损耗光进行反射；经第一二色镜透射后的激发光和反射后的损耗光共同入射至第二二色镜；第二二色镜对入射的损耗光和激发光进行反射；

所述激发光单元中的第一可调谐激光光源发出的激发光波长可根据需要进行调节设置，这样可根据给定的荧光染料选择合适的激发光波长，所述激发光单元出射的激发光经第一二色镜透射、第二二色镜反射、扫描振镜反射和扫描透镜、筒镜、物镜透射，在物镜焦面处形成第一光斑，所述第一光斑用于激发样本中的荧光物质从而产生荧光；

所述损耗光单元中的第二可调谐激光光源发出的损耗光波长可根据需要进行调节设置，这样可根据给定的荧光染料选择合适的损耗光波长，半玻片用于改变入射损耗光的偏振方向，涡旋相位片用于在损耗光光束中引入0-2π的涡旋相位分布，四分之一波片用于将损耗光由线偏光转为圆偏光，损耗光单元出射的损耗光经第一二色镜、第二二色镜、扫描振镜反射和扫描透镜、筒镜、物镜透射，在物镜焦面处形成第二光斑；所述第一光斑和第二光斑重叠；

所述样本中的荧光物质发出的荧光经物镜收集后经筒镜、扫描透镜透射和扫描振镜反射，入射进第二二色镜，并被第二二色镜透射后经针孔透镜被光电倍增管收集。

2.根据权利要求1所述的基于可调谐激光的STED超分辨显微镜，其特征在于，所述第一二色镜对激发光单元出射的激发光具有高透射率，对损耗光单元出射的损耗光具有高反射率；第二二色镜对入射的损耗光和激发光具有高反射率，对激发光激发产生的荧光具有高透射率。

3.根据权利要求1所述的基于可调谐激光的STED超分辨显微镜，其特征在于，所述第一光斑为艾里斑状光斑；

所述第二光斑为面包圈状光斑，光斑的中央位置光强接近为零而周围环状区域光强较高。

4.根据权利要求3所述的基于可调谐激光的STED超分辨显微镜，其特征在于，所述艾里斑状光斑和面包圈状光斑重叠，使位于艾里斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子被损耗光退激发，不再产生荧光。

5.根据权利要求1所述的基于可调谐激光的STED超分辨显微镜，其特征在于，在所述光电倍增管和针孔透镜之间设有针孔，所述针孔位于针孔透镜的焦点处；所述样本中的荧光物质发出的荧光经过针孔透镜聚焦在针孔处，透过针孔的荧光被光电倍增管收集。

说明书

基于可调谐激光的STED超分辨显微镜

技术领域

[0001] 本发明涉及显微镜技术领域，尤其是涉及一种基于可调谐激光的STED超分辨显微镜。

背景技术

[0002] 超分辨光学显微术对生物医学和材料学等领域的研究具有革命性的推动作用，其研究进展在很多科学领域内都产生了深远的影响。超分辨光学显微术由于实现方法不同，出现了多种类型：受激辐射损耗（Stimulated Emission Depletion，STED）显微术是建立在激光共聚焦显微术基础上的一种光学超分辨显微术，是首先提出也是最直接地客服光学衍射极限的远场光学显微术，相对于其它类型的超分辨显微术，其成像速度相对较快，能够对活细胞进行成像，在生物医学研究中可以探测更精细的结构，也为材料科学领域研究提供了新手段。

[0003] 在STED显微成像系统中需要两种激光照明，一种激光在物镜焦点处形成近似艾利分布的光斑，对荧光物质进行激发，使得荧光物质发出荧光，这种照明激光为激发光；另一种在物镜焦点处形成中央光强为零的圆环形光斑，使位于圆环上处于激发态的荧光物质损耗掉，不再发射荧光，只有位于圆环形焦斑中央暗区的荧光物质才能产生荧光，由于中央暗区的直径远小于衍射极限，故可获得超越光学分辨极限的图像。

[0004] 给定波长的激发光只能用来激发吸收峰值位于该波长附近的荧光染料，给定波长的损耗光只能用来退激发荧光发射波长红端和该损耗光波长接近的荧光染料，激发光波长、损耗光波长和荧光染料的吸收发射波长要匹配。目前的STED显微成像系统多是采用固定波长的激发光或损耗光，这样一来适合的荧光染料数量就很有限，能够观察的生物组织也就很有限；采用双色或多色STED可以同时对两种或多种荧光染料进行激发，扩大了系统的适用范围，但即使采用双色或多色STED也只是很有限地扩大了系统的适用范围，实际生物学实验中荧光染料千差万别，有限的几个激发光波长或损耗光波长不能满足要求。

发明内容

[0005] 本发明的目的是：提供一种基于可调谐激光的STED超分辨显微镜，激发光波长和损耗光波长均可以根据需要进行调节设置，扩大了STED超分辨显微成像系统的适用范围。

[0006] 本发明的技术方案是：

[0007] 一种基于可调谐激光的STED超分辨显微镜，其特征在于，包括激发光单元、损耗光单元、第一二色镜和扫描成像单元；

[0008] 所述激发光单元包括第一可调谐激光光源；所述损耗光单元包括第二可调谐激光光源、半玻片、涡旋相位片和四分之一波片，第二可调谐激光光源、半玻片、涡旋相位片和四分之一波片沿第二可调谐激光光源的发光光路依次设置；所述扫描成像单元包括第二二色镜、扫描振镜、扫描透镜、筒镜、物镜、针孔透镜和光电倍增管，扫描振镜、扫描透镜、筒镜、物镜沿第二二色镜的反射光路依次设置，针孔透镜和光电倍增管沿第二二色镜的透射光路依次设置；

[0009] 所述第一二色镜用于连接激发光单元和损耗光单元，第一二色镜对激发光单元出射的激发光进行透射，对损耗光单元出射的损耗光进行反射；经第一二色镜透射后的激发光和反射后的损耗光共同入射至第二二色镜；第二二色镜对入射的损耗光和激发光进行反射；

[0010] 所述激发光单元中的第一可调谐激光光源发出的激发光波长可根据需要进行设置，激发光单元出射的激发光经第一二色镜透射、第二二色镜反射、扫描振镜反射和扫描透镜、筒镜、物镜透射，在物镜焦面处形成第一光斑，所述第一光斑用于激发样本中的荧光物质从而产生荧光；

[0011] 所述损耗光单元中的第二可调谐激光光源发出的损耗光波长可根据需要进行设置，半玻片用于改变入射损耗光的偏振方向，涡旋相位片用于在损耗光光束中引入0-2π的涡旋相位分布，四分之一波片用于将损耗光由线偏光转为圆偏光，损耗光单元出射的损耗光经第一二色镜、第二二色镜、扫描振镜反射和扫描透镜、筒镜、物镜透射，在物镜焦面处形成第二光斑；所述第一光斑和第二光斑重叠；

[0012] 所述样本中的荧光物质发出的荧光经物镜收集后经筒镜、扫描透镜透射和扫描振镜反射，入射进第二二色镜，并被第二二色镜透射后经针孔透镜被光电倍增管收集。

[0013] 下面对上述技术方案进一步解释：

[0014] 所述第一二色镜对激发光单元出射的激发光具有高透射率，对损耗光单元出射的损耗光具有高反射率；第二二色镜对入射的损耗光和激发光具有高反射率，对激发光激发产生的荧光具有高透射率。

[0015] 所述第一光斑为艾里斑状光斑；

[0016] 所述第二光斑为面包圈状光斑，光斑的中央位置光强接近为零而周围环状区域光强较高。

[0017] 所述艾里斑状光斑和面包圈状光斑重叠，使位于艾里斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子被损耗光退激发，不再产生荧光。

[0018] 在所述光电倍增管和针孔透镜之间设有针孔，所述针孔位于针孔透镜的焦点处；所述样本中的荧光物质发出的荧光经过针孔透镜聚焦在针孔处，透过针孔的荧光被光电倍增管收集。

[0019] 本发明的优点是：

[0020] 本发明采用可调谐激光光源作为STED超分辨显微镜中的激发光光源和损耗光光源，由于激发光波长和损耗光波长均可以根据需要进行调节设置，对于给定的荧光染料，可以找到适合的激发光波长和损耗光波长，扩大了STED超分辨显微镜的适用范围。

附图说明

[0021] 图1为本发明实施例提供的基于可调谐激光的STED超分辨显微镜结构示意图。

[0022] 其中：基于可调谐激光的STED超分辨显微镜100、激发光单元110、第一可调谐激光光源111、损耗光单元120、第二可调谐激光光源121、半玻片122、涡旋相位片123、四分之一波片124、第一二色镜130、扫描成像单元140、第二二色镜141、扫描振镜142、扫描透镜143、筒镜144、物镜145、针孔透镜146、针孔147、光电倍增管148、样本200。

具体实施方式

[0023] 请参考图1。图1中标有单箭头的光路为激光传播光路；标有双箭头的光路为荧光传播光路。

[0024] 实施例：基于可调谐激光的STED超分辨显微镜100包括激发光单元110、损耗光单元120、第一二色镜130和扫描成像单元140。

[0025] 激发光单元110包括第一可调谐激光光源111，该第一可调谐激光光源111发出的激发光波长可根据需要进行设置。

[0026] 损耗光单元120包括第二可调谐激光光源121、半玻片122、涡旋相位片123和四分之一波片124，它们分别沿第二可调谐激光光源121的发光光路依次设置。第二可调谐激光光源121发出的损耗光波长也可根据需要进行设置。其中，半玻片122用于改变入射损耗光的偏振方向，涡旋相位片123用于在损耗光光束中引入0-2π的涡旋相位分布，四分之一波片124用于将损耗光由线偏光转为圆偏光。

[0027] 第一二色镜130用于连接激发光单元110和损耗光单元120，对激发光单元110出射的激发光进行透射，对损耗光单元120出射的损耗光进行反射。在一优选实施例中，第一二色镜130对激发光单元110出射的激发光具有高透射率，对损耗光单元120出射的损耗光具有高反射率。

[0028] 扫描成像单元140包括第二二色镜141、扫描振镜142、扫描透镜143、筒镜144、物镜145、针孔透镜146和光电倍增管148，扫描振镜142、扫描透镜143、筒镜144、物镜145沿第二二色镜141的反射光路依次设置，针孔透镜146和光电倍增管148沿第二二色镜141的透射光路依次设置。经第一二色镜130透射后的激发光和反射后的损耗光共同入射至第二二色镜
141，第二二色镜141对入射的损耗光和激发光进行反射。在一优选实施例中，第二二色镜
141对入射的损耗光和激发光具有高反射率。

[0029] 激发光单元110出射的激发光经第一二色镜130透射、第二二色镜141反射、扫描振镜142反射和扫描透镜143、筒镜144、物镜145透射，在物镜145焦面处形成第一光斑，该第一光斑用于激发样本200中的荧光物质从而产生荧光，荧光经物镜145收集后经筒镜144、扫描透镜143透射和扫描振镜142反射，入射进第二二色镜141，并被第二二色镜141透射后经针孔透镜146被光电倍增管148收集，光电倍增管148探测荧光并将荧光转换成电信号，在一优选实施例中，第二二色镜141对激发光激发产生的荧光具有高透射率。损耗光单元120出射的损耗光经第一二色镜130、第二二色镜141、扫描振镜142反射和扫描透镜143、筒镜144、物镜145透射，在物镜145焦面处形成第二光斑。第一光斑和第二光斑重叠。

[0030] 在一优选实施例中，第一光斑为艾里斑状光斑；第二光斑为面包圈状光斑，光斑的中央位置光强接近为零而周围环状区域光强较高。艾里斑状光斑和面包圈状光斑重叠在一起，使位于艾里斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子被损耗光退激发，不再产生荧光，从而减小了荧光的有效发射区域，实现光学超分辨成像。

[0031] 在另一优选实施例中，在光电倍增管148和针孔透镜146之间设有针孔147，针孔147位于针孔透镜146的焦点处；样本200中的荧光物质发出的荧光经过针孔透镜146聚焦在针孔147处，透过针孔147的荧光被光电倍增管148收集。

[0032] 本实施例工作过程如下：

[0033] 如图1所示，第一可调谐激光光源111发出激发光光束，经第一二色镜130透射、第二二色镜141反射、扫描振镜142反射和扫描透镜143、筒镜144、物镜145透射后，在物镜145焦面处形成一个艾里斑分布的光斑，用于激发样本200中的荧光物质从而产生荧光；第二可调谐激光光源121发出的损耗光光束经半玻片122、涡旋相位片123、四分之一玻片124后，经第一二色镜130、第二二色镜141、扫描振镜142反射和扫描透镜143、筒镜144、物镜145透射，在物镜145的焦面处形成一个面包圈形的光斑，光斑的中央位置光强接近为零而周围环状区域光强较高。激发光在物镜145焦面处形成的艾里斑状光斑和损耗光在物镜145焦面处形成的面包圈状光斑重叠在一起，使得位于艾里斑外围区域上处于荧光发射态的荧光分子被损耗光退激发，不再产生荧光，从而减小了荧光的有效发射区域，实现光学超分辨成像。样本200中的荧光物质发出的荧光经物镜145收集后经过筒镜144和扫描透镜143，之后被扫描振镜142反射，入射进入第二二色镜141，被第二二色镜141透射，经过针孔透镜146聚焦在针孔147处，透过针孔147的荧光被光电倍增管148收集。

[0034] 本发明采用可调谐激光光源作为STED超分辨显微镜中的激发光光源和损耗光光源，由于激发光波长和损耗光波长均可以根据需要进行调节设置，对于给定的荧光染料，可以找到适合的激发光波长和损耗光波长，扩大了STED超分辨显微镜的适用范围。

[0035] 当然本发明的基于可调谐激光的STED超分辨显微镜还可具有多种变换及改型，并不局限于上述实施方式的具体结构。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。