一种三花注射液的检测方法

摘要

本发明涉及以天然提取物为原料制成的三花注射液的质量控制方法。本发明方法包括以下步骤：1)对照品溶液的制备；2)三花注射液供试品溶液的制备；3)采用快速高效液相色谱梯度洗脱法检测；4)图谱辨认。本发明将所得到三花注射液样品的特佂图谱采用计算相对保留时间及相对峰面积的方法确定特征图谱的辨认，从而建立起三花注射液的快速HPLC特佂图谱，从色谱的整体面貌特佂上控制三花注射液质量情况，避免了因只测定一、两个化学成分而评价三花注射液整体质量的片面性，能够较全面、有效地控制产品质量。本发明具有方法简便、快速、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握等特点，可以全面监控原料、半成品和成品的质量，通过特征图谱的辨认，对其进行质量控制和防伪，实用性突出，应用前景广阔。

权利要求

1.一种三花注射液的检测方法，其特征在于：其包括以下步骤：

(1)对照品溶液的制备：取野黄芩苷对照品5mg、三七总皂苷对照提取物100mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇70ml，用功率300W，频率50kHz的超声处理45分钟，取出，放置室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

(2)供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物40mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

(3)快速高效液相色谱检测：精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，进行HPLC检测，色谱条件为：色谱柱为 Express C18，色谱柱规格为：5cm×4.6mm，2.7μm；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；流速：0.8ml/min；柱温：25℃；以DAD检测器，检测波长为203nm；

所述梯度洗脱步骤为：

(4)将所得到三花注射液样品的特征图谱采用计算相对保留时间及相对峰面积的方法确定特征图谱的辨认。

2.根据权利要求1所述三花注射液的检测方法，其特征在于：所述三花注射液快速HPLC特征图谱在203nm共检测出14个共有色谱峰，归属于灯盏花素的色谱峰1个，归属于三七总皂苷的色谱峰13个。

3.根据权利要求1所述三花注射液的检测方法，其特征在于：所述方法可以对三花注射液所含的三七总皂苷及灯盏花素同步作出色谱鉴定。

4.根据权利要求1所述三花注射液的检测方法，其特征在于：所述方法可用于鉴别及定量测定三花注射液中三七总皂苷及灯盏花素的含量并制定限度范围。

说明书

一种三花注射液的检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种三花注射液的快速质量控制方法及应用。

背景技术

[0002] 三花注射液是中药复方制剂，由三七总皂苷(原药材为三七)及灯盏花素(原药材为灯盏细辛)中药提取物组成。三七总皂苷原料来源为五加科植物三七的根中提取出来的皂苷类成分。味甘，微苦，性温。归肝、胃、心、肺、大肠经。其功能主治为止血散瘀，消肿定痛。《中华本草5》收载了三七，载其功能为止血散瘀、消肿定痛。主治各种出血证，跌扑瘀肿，胸痹绞痛，癥瘕，血瘀经闭、痛经，产后瘀阻腹痛，疮痈肿痛。《本草纲目》载其：止血、散血、定痛。《医便》载其：专治血，归经络。《本草新编》载其：三七根，止血之神药也。无论上中下之血，凡有外越者，一味独用亦效。《本草求真》中指出：三七气味苦温，能于血分化其血瘀。《衷中参西录》中载其：三七，善化瘀血，又善止血妄行。近年来，在三七总皂苷治疗心血管疾病方面进行了较多的基础与临床研究，三七总皂苷具有多方面的生物活性，是防治心血管疾病的一种有效药物，其作用主要表现在强心、扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、改善心肌代谢、抗自由基、抗凝、钙拮抗等方面。灯盏花素(灯盏花黄酮)是灯盏细辛(灯盏花)的有效成分，灯盏细辛为菊科植物短葶飞蓬的干燥全草。味辛、微苦，温。入肺、胃、肝经。其功能主治为散寒解表，祛风除湿，活络止痛，消积。主治感冒，风湿痹痛，瘫痪，胃痛，牙痛，小儿疳积，骨髓炎，跌打损伤。其主要成分为黄酮，内酯，挥发油，氨基酸等，有效成份主要是4-羟基黄芩素(Scutellarein)等。临床上主要用于治疗缺血性心脏疾病、脑血栓及脑梗塞等。两药合用，具有活血化瘀、通络止痛功效，用于治疗心血瘀阻，脑梗塞(缺血性脑卒中)急性期及恢复期；冠心病、心绞痛。

[0003] 三花注射液作为一种中药复方制剂，由于其复方内部的不同药味组合间的有机配合关系形成了复方整体综合的治疗特征，复方的质量优劣难以以明确的指标进行评价，复方的质量不稳定，直接引起了治疗效果的不稳定。中药特征图谱的研究和建立正是为了解决中药质量控制和监督这一关键问题而采取的一种方法，它从药材的生产、加工、贮存及制剂的原料、中间品、成品等各个角度和方面，进行中药样品分析，通过相似性和相关性对比，发现质量变异和缺陷，从而全面、特异地把握住中药制剂的质量命脉。

[0004] 目前，三花注射液的质量控制方法仍存在一定不足，中国专利CN1939372A公开了一种三花注射液的指纹图谱质量控制方法，但该方法采用2种高效液相色谱法分别测定三七总皂苷中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及灯盏花素中野黄芩苷的含量，操作繁琐，检测时间长。

[0005] 林燕芝公开了一种三花注射剂的指纹图谱质量控制方法(三花注射剂质量评价方法研究，2004年硕士论文)，该方法的不足之处在于，1、高效液相色谱分析耗时60分钟，分析时间较长，耗能不环保。2、人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度不好，只有0.97，不能达 到含测要求。3、基线漂移，且很多共有峰堆积在一起，没有达到有效分离。

[0006] 因此，目前仍然缺少一种快速、有效的三花注射剂的指纹图谱质量控制方法。

发明内容

[0007] 本发明的目的是克服上述现有技术中的不足之处，提供一种快速、有效的三花注射液的质量控制方法及应用。

[0008] 本发明采用快速HPLC梯度洗脱在一个流动相系统利用相同检测波长，同时检出复方中的两种原料共6种成分含量，建立的特征图谱可以全面监控原料、半成品和成品的质量，通过色谱特征图谱相的比较，评价优劣、考察稳定性和一致性，弥补了原质量控制方法的不足。

[0009] 本发明涉及的三花注射液的质量控制方法，包括以下步骤：

[0010] (1)对照品溶液的制备：取野黄芩苷对照品5mg、三七总皂苷对照提取物100mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇70ml超声处理(功率300W，频率50kHz)45分钟，取出，放置室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

[0011] (2)供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物40mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

[0012] (3)快速高效液相色谱检测：精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入液相色谱仪，进行HPLC检测，色谱条件为：色谱柱为SUPELCO ExpressC18(5cm×4.6mm，2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱；流速：0.8ml／min；柱温：25℃；以DAD检测器，检测波长为203nm；

[0013] 所述梯度洗脱步骤为：

[0014]

[0015] (4)将所得到三花注射液样品的特佂图谱采用计算相对保留时间及相对峰面积的方法确定特征图谱的辨认。

[0016] 本发明涉及的三花注射液的质量控制方法，通过对十批三花注射液构建的高效液相色谱特征图谱并进行分析比较，找出其共有特征峰得到三花注射液标准特征图谱。所构建的特征图谱在203nm共检测出14个共有色谱峰，归属于灯盏花素的色谱峰1个，归属于三七总皂苷的色谱峰13个。

[0017] 三花注射液的HPLC特征图谱203nm的共有峰为[1]、[2]、[S]、[3]、[4]、[5]、[6]、 [7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]共14个峰；其中，归属于灯盏花素的共有峰为[1]1个峰；归属于三七总皂苷的共有峰为[2]、[S]、[3]、[4]、[5]、[6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]、[12]、[13]共13个峰。所述图谱如图1所示。

[0018] 本发明涉及的三花注射液的质量控制方法，其指纹图谱符合以下标准规定即为合格产品。

[0019] 标准规定：供试品特征图谱中应呈现14个共有峰，以人参皂苷Rg1峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间比值，应在规定值的±5％范围之内。规定值为：0.322(峰1)、0.888(峰2)、1.000(峰 S)、1.024(峰3)、1.545(峰 4)、1.603(峰5)、1.640(峰 6)、
1.702(峰7)、1.879(峰 8)、2.068(峰9)、2.248(峰 10)、2.549(峰11)、2.599(峰 12)、
2.668(峰13)。各特征峰与S峰的相对峰面积比值，应在规定值的±20％范围之内。规定值为：0.748(峰1)、0.268(峰2)、1.000(峰S)、0.110(峰3)、0.789(峰7)、0.252(峰9)。
且非共有峰面积不得过总面积的5％。

[0020] 本发明涉及的三花注射液质量控制方法，其高效液相色谱分离的人参皂苷Rg1峰和人参皂苷Re峰的分离度应大于1.5；理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

[0021] 本发明涉及的三花注射液质量控制方法，检测出的含量限度应符合以下标准：

[0022] 本品按标示量计算，每瓶含野黄芩苷(C21H18O12)应为3.4～5.4mg，三七皂苷R1(C47H80O18)应不得少于7.5mg、人参皂苷Rg1(C42H72O14)应不得少于29.8mg、人参皂苷Re(C48H82O18)应不得少于3.2mg，人参皂苷Rb1(C54H92O23)应不得少于31.9mg、人参皂苷Rd(C48H82O18)应不得少于6.4mg，且五者总量应为90.3～129.3mg。

[0023] 本发明的目的还可以通过以下措施来达到：三花注射液的HPLC特征图谱，其特殊之处在于，利用DAD检测器对主要峰进行色谱峰归属及峰纯度检测，通过UV吸收曲线的比较，结合参照品确认：

[0024] 1号峰为野黄芩苷、2号峰为三七皂苷R1、S号峰为人参皂苷Rg1、3号峰为人参皂苷Re、7号峰为人参皂苷Rb1、9号峰为人参皂苷Rd。

[0025] 以上色谱峰构成了三花注射液的特征图谱。

[0026] 本发明所述的三花注射液质量控制方法可以对三花注射液所含的三七总皂苷及灯盏花素同步作出色谱鉴定，同时可用于鉴别及定量测定三花注射液中三七总皂苷及灯盏花素的含量并制定限度范围。

[0027] 本发明将所得到三花注射液样品的特佂图谱采用计算相对保留时间及相对峰面积的方法确定特征图谱的辨认，从而建立起三花注射液的快速HPLC特佂图谱，从色谱的整体面貌特佂上控制三花注射液质量情况，避免了因只测定一、两个化学成分而评价三花注射液整体质量的片面性，能够较全面、有效地控制产品质量。本发明具有方法简便、快速、稳定、精密度 高、重现性好、易于掌握等特点，可以全面监控原料、半成品和成品的质量，通过特征图谱的辨认，对其进行质量控制和防伪，实用性突出，应用前景广阔。

[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0029] 1、本发明涉及一种快速测定三花注射液质量的方法，可以同时测定三七总皂苷中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1以及灯盏花素中野黄芩苷的含量，本发明的HPLC非线性梯度洗脱方法可以通过在一个流动相系统利用同一检测波长，同时快速对复方中的两种原料6种成分含测。

[0030] 2、本发明涉及一种快速测定三花注射液质量的方法，其高效液相色谱检测耗时仅需半个小时，提高了工作效率的同时可大大节约溶剂，有利于环保。

[0031] 3、本发明涉及的三花注射液快速质量控制方法，检测出的六个含测成分的色谱峰分离度均＞1.5，相较于现有技术(分离度小于0.97)，本发明的质量控制方法能够更准确的对三花注射液进行定性定量鉴定。

[0032] 4、本发明涉及的三花注射液快速质量控制方法，其基线相较于现有技术更为稳定，峰形漂亮。可作为含测及指纹图谱共用。

[0033] 5、本发明涉及的三花注射液质量控制方法，能更全面地监控原料药材、半成品和成品的质量，监控生产工艺的稳定性。

附图说明

[0034] 图1：三花注射液(203nm)对照特征图谱

[0035] 图2：野黄芩苷和三七总皂苷全波长扫描图

[0036] 图3：不同柱温的液相色谱图

[0037] 图4：不同流速的液相色谱图

[0038] 图5：不同色谱柱的液相色谱图

[0039] 图6：空白溶剂的液相色谱图

[0040] 图7：灯盏花素阴性对照的液相色谱图

[0041] 图8：三七总皂苷阴性对照的的液相色谱图

[0042] 图9：混合对照品的液相色谱图

[0043] 图10：供试品溶液的液相色谱图

[0044] 图11：野黄芩苷线性关系图

[0045] 图12：三七皂苷R1线性关系图

[0046] 图13：人参皂苷Rg1线性关系图

[0047] 图14：人参皂苷Re线性关系图

[0048] 图15：人参皂苷Rb1线性关系图

[0049] 图16：人参皂苷Rd线性关系图

[0050] 图17：三花注射液延长至1h的液相色谱图

[0051] 图18：空白溶剂延长至1h的液相色谱图

具体实施方式

[0052] 以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。

[0053] 实施例1：三花注射液质量快速测定方法

[0054] 1、对照品溶液的制备：取野黄芩苷对照品(批号：110842-201106，中国食品药品检定研究院)5mg、三七总皂苷对照品(批号：110870-201002，中国药品生物制品检定所)100mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇(分析纯，广州化学试剂厂)70ml，使用KQ-1000KDE超声波清洗仪进行超声处理(功率300W，频率50kHz)45分钟，取出，放置室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；

[0055] 2、供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品内容物(批号S121102；丽珠制药厂)40mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇(分析纯，广州化学试剂厂)溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

[0056] 3、快速高效液相色谱检测：精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入Agilent1260型高效液相色谱仪(G1311B四元梯度泵、G1329B自动进样器、1260智能柱温箱、DAD检测器)，进行HPLC检测，色谱条件为：色谱柱为SUPELCO Express C18(5cm×4.6mm，2.7μm)；以乙腈(色谱纯，默克)为流动相A，以0.05％磷酸溶液(分析纯，西陇化工股份有限公司)为流动相B，梯度洗脱；流速：0.8ml／min；柱温：25℃；以DAD检测器，检测波长为203nm；

[0057] 所述梯度洗脱步骤为：

[0058]

[0059] 将所得到三花注射液样品的特佂图谱采用计算相对保留时间及相对峰面积的方法确定特征图谱的辨认。

[0060] 实验结果：在203nm共检测出14个共有色谱峰，归属于灯盏花素的色谱峰1个，归属于三七总皂苷的色谱峰13个(如图1)。六个含测成分的色谱峰分离度均＞1.5，各特征峰与S峰的相对保留时间比值，在规定值的±5％范围之内。规定值为：0.322(峰1)、0.888(峰2)、1.000(峰S)、1.024(峰3)、1.545(峰4)、1.603(峰5)、1.640(峰6)、1.702(峰
7)、1.879(峰8)、2.068(峰9)、2.248(峰10)、2.549(峰11)、2.599(峰12)、2.668(峰13)。
各特征峰与S峰的相对峰面积比值，在规定值的±20％范围之内。规定值为：0.748(峰1)、
0.268(峰2)、1.000(峰S)、0.110(峰3)、0.789(峰7)、0.252(峰9)。

[0061] 对多批三花注射液样品按实施例1方法测其特征图谱均符合标准规定。

[0062] 实施例2：三花注射液的质量测定方法

[0063] 按实施例1制备对照品溶液和供试品溶液，精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入Agilent1260型高效液相色谱仪(G1311B四元梯度泵、G1329B自动进样器、
1260智能柱温箱、DAD检测器)进行HPLC检测，色谱柱为SUPELCO Express
C18(5cm×4.6mm，2.7μm)；色谱条件同(三花注射液质量评价方法研究，林燕芝，沈阳药科大学硕士论文，2004)，具体为：以0.05％磷酸溶液(分析纯，西陇化工股份有限公司)为流动相A，以乙腈(色谱纯，默克)为流动相B，梯度洗脱；流速：0.8ml／min；柱温：35℃；以DAD检测器，检测波长为203nm；

[0064] 所述梯度洗脱步骤为：

[0065]

[0066] 将所得到三花注射液样品的特佂图谱采用计算相对保留时间及相对峰面积的方法确定特征图谱的辨认。

[0067] 实验结果：色谱分析时间为60分钟，耗时较长，不环保。人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度不好，只有0.97，不能达到含测要求(即分离度大于1.5，同时色谱基线漂移。且很多共有峰堆积在一起，没有达到分离效果。不适用于三花质量控制检测。

[0068] 实施例3：三花注射液的质量快速测定方法

[0069] 按实施例1制备对照品溶液和供试品溶液，精密吸取对照品溶液及供试品溶液各2μl，分别注入Agilent1260型高效液相色谱仪(G1311B四元梯度泵、G1329B自动进样器、
1260智能柱温箱、DAD检测器)进行HPLC检测，色谱柱为SUPELCO Express
C18(5cm×4.6mm，2.7μm)；色谱条件具体为：以0.05％磷酸溶液(分析纯，西陇化工股份有限公司)为流动相A，以乙腈(色谱纯，默克)为流动相B，梯度洗脱；流速：0.8ml／min；
柱温：35℃；以DAD检测器，检测波长为203nm；

[0070] 所述梯度洗脱步骤为：

[0071]

[0072] 将所得到三花注射液样品的特佂图谱采用计算相对保留时间及相对峰面积的方法确定特征图谱的辨认。

[0073] 实验结果：人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离度不好，只有0.97，不能达到含测要求(即分离度大于1.5)。色谱基线漂移，不能准确的定量。不适用于三花质量控制检测。

[0074] 实施例4：三花注射液质量检测的色谱条件的优化

[0075] 1、检测波长的选择

[0076] 取野黄芩苷对照品，用甲醇制成浓度为0.05mg／ml供试品溶液，取三七总皂苷对照品溶液，用70％甲醇制成浓度为2.5mg／ml供试品溶液，注入液相色谱仪，在190nm～400nm波长范围内扫描，结果显示，野黄芩苷在203nm和335nm处有最大吸收，三七总皂苷在
203nm处有最大吸收，当选用203nm为检测波长时，在同一张图谱中可以同时反映野黄芩苷和三七总皂苷等6种化合物且检测灵敏度较高、基线平稳，故选用203nm为测定波长(结果见图2)。

[0077] 2、流动相的选择

[0078] 按实施例1制备对照品、供试品溶液，进行快速高效液相色谱检测，具体色谱条件如实施例1，其中考察3组流动相对三花注射液质量控制方法的影响，具体如下：

[0079] 组1：流动相A为乙腈，流动相B为水；

[0080] 组2：流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸溶液；

[0081] 组3：流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸溶液；

[0082] 实验结果表明，使用组3(即乙腈和0.05％磷酸溶液)为流动相时，色谱峰分离效果最佳。因此优选流动相A为乙腈，流动相B为0.05％磷酸溶液。

[0083] 3、柱温的选择

[0084] 按实施例1制备对照品、供试品溶液，进行快速高效液相色谱检测，通过考察不同柱温(20℃、25℃、30℃和35℃)，综合分析比较峰面积、分离度、对称因子和塔板数等参数，具体色谱条件如实施例1。

[0085] 实验结果表明柱温为25℃时，各参数最佳，最终确定柱温为25℃(结果见图3)。

[0086] 4、流速的确定

[0087] 按实施例1制备对照品、供试品溶液，进行快速高效液相色谱检测，通过考察不同流速(0.8ml／min、1.0ml／min和1.2ml／min)，综合分析比较峰面积、分离度、对称因子和塔板数等参数，具体色谱条件如实施例1。

[0088] 实验结果表明流速为0.8ml／min时，各参数最佳，最终确定最优流速为0.8ml／min(结果见图4)。

[0089] 5、色谱柱的确定

[0090] 按实施例1制备对照品、供试品溶液，进行快速高效液相色谱检测，分别使用Agilent Poroshell120EC-C18柱(4.6×50mm，2.7μm)，Phenomenex Kinetex2.6u C18柱(4.6×50mm，2.7μm)，SUPELCO Express C18柱(4.6×50mm，2.7μm)，每根色谱柱调整流动相至满足系统适应性试验后测定同一批样品的含量。具体色谱条件如实施例1。

[0091] 试验结果发现Agilent Poroshell120EC-C18柱(4.6×50mm，2.7μm)、SUPELCO Express C18柱(4.6×50mm，2.7μm)，均取得良好的分离效果，但使用SUPELCO Express C18柱(4.6×50mm，2.7μm)时，三七皂苷Rb1分离效果较好，且基线较平，确定了色谱柱SUPELCO Express C18柱(4.6×50mm，2.7μm)效果最优。(结
果见图5)。

[0092] 最终确定了色谱条件：色谱柱：SUPELCO Express C18柱(4.6×50mm，2.7μm)；以乙腈为流动相A，以0.05％磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8ml／min；检测波长为203nm；柱温为25℃。

[0093] 流动相洗脱程序

[0094]

[0095] 实施例5：三花注射液质量控制的专属性考察

[0096] 1、对照品及供试品溶液的制备

[0097] 对照品溶液的制备：取野黄芩苷对照品5mg、三七总皂苷对照提取物125mg，精密称定，置100ml容量瓶中，加甲醇70ml超声处理(功率300W，频率50kHz)45分钟，取出，放置室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

[0098] 供试品溶液的制备：取供试品约40mg，精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

[0099] 三七总皂苷阴性对照的制备按处方工艺制成缺三七总皂苷的阴性对照制剂，取三七总皂苷阴性样品约6.67mg，精密称定，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

[0100] 灯盏花素阴性对照的制备按处方工艺制成缺灯盏花素的阴性对照制剂，取灯盏花素阴性样品约38.67mg，精密称定，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

[0101] 空白溶剂的制备取甲醇适量，过滤，即得。

[0102] 2、高效液相色谱测定：

[0103] 精密吸取供试品溶液、三七总皂苷阴性供试品溶液、灯盏花素阴性供试品溶液、对照品溶液及溶剂空白溶液各2μl，注入液相色谱仪，记录液相图谱。可见在与对照品吸收峰相应的位置上，供试品色谱有吸收峰，而阴性对照和空白溶剂色谱在相应的位置没有吸收峰(见图6-图10)，证明用本方法测定灯盏花素和三七总皂苷专属性良好。

[0104] 实施例6：三花注射液质量控制方法的线性关系考察

[0105] 精密称取三七总皂苷200mg、灯盏花素10mg精密称定，置25ml容量瓶中，加甲醇20ml 超声45min(300W，50HZ)，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，即制成含三七总皂苷为8mg／ml，灯盏花素为0.4mg／ml的混标S1。精密量取混标S1分别稀释成含三七总皂苷
2mg／ml、灯盏花素0.1mg／ml的混标S2；三七总皂苷1mg／ml、灯盏花素0.05mg／ml的混标S3；三七总皂苷0.5mg／ml、灯盏花素0.025mg／ml的混标S4；三七总皂苷0.025mg／ml、灯盏花素0.0125mg／ml的混标S5。

[0106] 精密吸取不同浓度的混标溶液S1-S5各2μl，每份进样3次，记录各组分峰面积(如表1所示)。以各组分浓度为横坐标X，各组分峰面积均值为纵坐标Y，进行线性回归。结果见标准曲线数据表。(详见表2，图11-图16)。结果表明，在测定的浓度范围内，各标准曲线均呈良好的线性关系。

[0107] 表1线性考察各组分峰面积

[0108]

[0109] 表2野黄芩苷和三七总皂苷含量测定线性考察结果

[0110]化合物 回归方程 相关系数 线性范围(mg／ml)
野黄芩苷 Y=32319.95X-160.27 r=0.99983 0.0116～0.3726
三七皂苷R1 Y=4417.81X+4.87 r=0.99998 0.0171～0.5466
人参皂苷Rg1 Y=4520.32X+89.07 r=0.99978 0.0693～2.2180
人参皂苷Re Y=4556.54X+6.28 r=0.99996 0.0094～0.3010
人参皂苷Rb1 Y=3514.51X+30.38 r=0.99996 0.0735～2.3527
人参皂苷Rd Y=4269.93X+6.57 r=0.99998 0.0181～0.5783

[0111] 实施例7：三花注射液的质量控制方法的精密度试验

[0112] 取实施例1对照品溶液，按实施例1所示的色谱条件测定，连续进样6次。记录各化合 物峰面积，计算各个化合物的平均峰面积及RSD，结果见表3。

[0113] 取同一份供试品(批号S121102；丽珠制药厂)溶液(配制方法同实施例1)，按实施例1所示的色谱条件测定，连续进样6次。记录各化合物峰面积，计算6个含测成分的平均峰面积及RSD，结果见表4。

[0114] 表3混合对照品精密度试验结果

[0115]

[0116] 表4供试品精密度试验结果

[0117]

[0118] 实验结果表明：本方法的精密度良好。

[0119] 实施例8：稳定性试验

[0120] 取同一供试品(批号S121102；丽珠制药厂)溶液(配制方法同实施例1)，分别在0、3、6、9、12、18、24小时后，按实施例1所示的色谱条件测定，记录各化合物峰面积，结果见表5。

[0121] 表5稳定性试验结果

[0122]

[0123]

[0124] 实验结果表明：供试品溶液在24小时内稳定性良好。

[0125] 实施例9：三花注射液质量控制方法的重复性试验

[0126] 取同一批号(S121102)供试品溶液6份(配制方法同实施例1)，按实施例1所示的色谱条件进行测定，重复性试验结果见表6。

[0127] 表6重复性试验结果

[0128]

[0129] 实验结果表明，本法重复性符合要求。

[0130] 实施例10：三花注射液的质量控制方法的加样回收试验

[0131] 取供试品9份(已知含量)，每份约20mg，精密称定，每3份为一组，置25ml容量瓶中，第一组分别精密加入0.4608mg／ml野黄芩苷对照品0.8ml，三七总皂苷对照品14.60mg；第二组分别精密加入0.6912mg／ml野黄芩苷对照品0.8ml，三七总皂苷对照品18.24mg；第三组分别精密加入0.6912mg／ml野黄芩苷对照品1ml，三七总皂苷对照品21.88mg；加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得，具体按实施例1所示的色谱条件进行测定，实验结果见表7-表13。

[0132] 表7野黄芩苷加样回收率试验结果

[0133]

[0134] 表8三七皂苷R1加样回收率试验结果

[0135]

[0136] 表9人参皂苷Rg1加样回收率试验结果

[0137]

[0138]

[0139] 表10人参皂苷Re加样回收率试验结果

[0140]

[0141] 表11人参皂苷Rb1加样回收率试验结果

[0142]

[0143] 表12人参皂苷Rd加样回收率试验结果

[0144]

[0145] 表13三七总皂苷回收率试验结果

[0146]

[0147] 实验结果表明：本方法具有良好的回收率，可用于野黄芩苷和三七总皂苷的含量测定。

[0148] 实施例11：三花注射液样品测定及含量限度制定

[0149] 对三批样品(批号S121101、S121102、S121103)按实施例1所示的色谱条件进行测定，结果见表14。

[0150] 表14三批中试样品含量测定结果

[0151]

[0152] 由三批中试样品测定结查可知，灯盏花素以野黄芩苷计其转移率为84.9％，根据《中国药典》2010一部规定灯盏花素含野黄芩苷不低于98.0％，按标示量每瓶含灯盏花素5mg，结合其转移率及原料含量计算，在±20％定限度{[5×(0.85～0.9)×(0.98～1.0)]±20％}，本品按标示量计算，每瓶含野黄芩苷(C21H18O12)应为3.4～5.4mg；三七总皂苷各成分中试转移率均在99％以上，接近100％，原料内控标准R1≥7.0％，Rg≥28.0％，Re≥3.0％，Rb1≥30.0％，Rd≥6.0％，且五者总量≥85.0％。按标示量每瓶含三七总皂苷125mg，结合其转移率及原料含量计算，单成分不低于下限15％，即：125×内控×0.85；
五者总和按±15％定上下限，即：(125×0.85)±15％。本品按标示量计算，每瓶含三七皂苷R1(C47H80O18)应不得少于7.5mg、人参皂苷Rg1(C42H72O14)应不得少于29.8mg、人参皂苷Re(C48H82O18)应不得少于3.2mg，人参皂苷Rb1(C54H92O23)应不得少于31.9mg、人参皂苷Rd(C48H82O18)应不得少于6.4mg，且五者总量应为90.3～129.3mg。

[0153] 实验结果：三批中试样品含量测定结果，均符合规定，该方法可用于三花注射液含量测定。

[0154] 实施例12：三花注射液的标准特征图谱的建立

[0155] 三花注射液主要成分包括野黄芩苷(黄酮)及皂苷类。为有效地控制制剂质量，通过试验研究建立了该制剂高效液相色谱特征图谱。试验过程中对测定特征图谱的检测波长、流动 相、柱温、色谱柱等条件分别进行了优选，建立了液相特征图谱测定条件并进行了方法学考察，根据十批样品制订了三花注射液液相特征图谱标准。从而能够较全面、有效地控制制剂质量。

[0156] 对所测得的特征图谱的辨认，因为其色谱峰较多，且某些色谱峰峰面积小、保留时间接近，为了更准确控制质量，采用计算相对保留时间及相对峰面积的方法计算结果能够符合特征图谱的相关要求，所以，确定本品特征图谱的辨认采用计算相对保留时间及相对峰面积的方法。

[0157] 仪器与试药、色谱条件、对照品溶液的制备、供试品溶液的制备、测定方法均参照实施例1(即含量测定方法一致)。

[0158] 1、延长时间测试滞后峰

[0159] 延长测试时间1倍至1小时，未见滞后峰出现。结果见图17、图18。

[0160] 2、取三花注射液(批号：S121102)，进行了稳定性、精密度、重复性的方法学试验，各组分相对保留时间及相对峰面积RSD＜2.0％，结果均符合特征图谱的技术要求，表明本法稳定性、精密度、重复性良好。

[0161] 3、取十批三花注射液(S121101、S121102、S121103、S13040101、S13040102、S13040201、S13040202、S13040301、S13040302、130315)按实施例1制成供试品溶液，分别测定特征图谱，利用中药色谱特征图谱相似度评价系统(2012.1版)，以这十批三花注射液供试品特征图谱为基础，获得的“共有模式”作为对照特征图谱，十批三花注射液特征图谱均呈现14个共有峰，以人参皂苷Rg1峰为S峰，各特征峰与S峰的相对保留时间比值，在规定值的±5％范围之内。规定值为：0.322(峰1)、0.888(峰2)、1.000(峰S)、1.024(峰3)、1.545(峰4)、1.603(峰5)、1.640(峰6)、1.702(峰7)、1.879(峰8)、2.068(峰9)、2.248(峰
10)、2.549(峰11)、2.599(峰12)、2.668(峰13)。各特征峰与S峰的相对峰面积比值，在规定值的±20％范围之内。规定值为：0.748(峰1)、0.268(峰2)、1.000(峰S)、0.110(峰
3)、0.789(峰7)、0.252(峰9)。且非共有峰面积不得过总面积的5％。

[0162] 从原料和三花注射液特征图谱的分析结果表明，样品中主要共有峰在原料中均有对应峰存在。