一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法

摘要

本发明提供了一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法，该方法如下：LC-APCI/MS表征技术对样品油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分子量；利用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分；用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，得到回收率数值；利用改良的甘油三酯试剂盒和甘油或单个甘油酯标准品水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过等摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量。本发明能够仅利用甘油或单个甘油酯标准品来绝对定量油中的甘油酯类成分。

权利要求

1.一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法，该方法包括如下步骤：

用LC-APCI/MS表征技术对样品油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分子量；

利用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分；

用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，得到回收率数值；所述的用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，其方法如下：步骤一，配制样品油溶液，将样品油溶液用溶剂逐步稀释成系列浓度的多个浓度样品；

步骤二，将步骤一所得的多个浓度的样品进入液相色谱仪进行色谱分析，色谱条件选用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分时所用的色谱条件和检测器，根据分析结果，根据色谱峰面积及浓度的对数计算样品中各个甘油酯类成分的标准曲线；

步骤三，靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分常温下用氮气吹干后用溶剂复溶，分别进入液相色谱仪进行色谱分析，色谱条件选用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分时所用的色谱条件和检测器，得到各个甘油酯类成分的色谱峰面积；

步骤四，计算回收率，得到回收率值：

当选用检测器为MS和/或紫外检测器时，计算回收率所采用的公式为：

当选用检测器为ELSD 检测器时，计算回收率所采用的公式为：

其中，R是回收率、n是稀释倍数、Ad是靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分的色谱峰面积、A0是靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分的理论响应峰面积、k是样品油中各甘油酯类成分的标准曲线斜率、C0为靶向收集策略进样的样品油溶液的浓度；当选用MS检测器时，Ad、A0分别表示靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分的检测峰面积和理论响应峰面积分别相对一定浓度内标响应峰面积的比值；

利用改良的商品化甘油三酯试剂盒和甘油来水解或者利用改良的商品化甘油三酯试剂盒和单个甘油酯标准品来水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量。

2.根据权利要求1所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于：所述的利用改良的商品化甘油三酯试剂盒和甘油来水解或者利用改良的商品化甘油三酯试剂盒和单个甘油酯标准品来水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量，其方法如下：在商品化甘油三酯试剂盒的R2液中加入0～400KU/L的脂蛋白脂肪酶，对商品化甘油三酯试剂盒的R2液进行改良，得到改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液；

分三个批次利用靶向收集策略收集样品油中的各个甘油酯类成分并用氮气吹干；

向三个批次靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分中分别添加相同量的溶剂，得到各个甘油酯类成分的溶液，再向各溶液中加入30倍溶液体积量的改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液，得到各个甘油酯类成分的混合液；

配制对照品溶液，用溶液梯度稀释该对照品溶液，得到系列浓度的对照品溶液；

精密吸取与各个甘油酯类成分的溶液相等体积的系列浓度的对照品稀释液，加入30倍溶液体积量的改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液，得到系列浓度对照品稀释液的混合溶液，重复三批次；

将各个甘油酯类成分的混合液、系列浓度对照品稀释液的混合溶液分别涡旋，后放入

37℃恒温箱孵育水解15min；

将水解后的各个甘油酯类成分的混合液、系列浓度对照品稀释液的混合溶液分别吸取加入到96孔板后，加入2-4倍混合液体积量的商品化甘油三酯试剂盒的R1酶溶液，反应

5min，用酶标仪550nm下测定吸收度；

根据吸收度及浓度各取平均值计算对照品的响应值对浓度的标准曲线，再依据所述标准曲线和三个批次各个甘油酯类成分的混合液的吸收度响应值计算靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分的浓度，取平均值；

计算各甘油酯类成分在油中所占的质量百分含量，其计算公式为：

其中C为靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分分别添加相同量的溶剂后，各个甘油酯类成分溶液的浓度，C0为靶向收集策略进样的样品油的浓度，M为各甘油酯类成分的理论摩尔分子量，Rs是分流比，R为靶向收集的各甘油酯类成分吹干后的回收率，运用公式所测得的值就是油中各甘油酯的质量百分含量。

3.根据权利要求2所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于：所述对照品包括甘油、三油酸甘油酯和/或单个甘油酯，所述甘油酯还包括甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯中的一种或几种的组合。

4.根据权利要求1-2任一项所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于：所述溶剂包括异丙醇、乙醇、甲醇、氯仿、正己烷、二甲基亚砜、水、TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列表面活性剂中的一种或几种的组合。

5.根据权利要求1-2任一项所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于：所述样品油为包含甘油酯的植物油和/或动物油。

6.根据权利要求1所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于：所述样品油为鸦胆子油。

7.根据权利要求1所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法，其特征在于：所述的靶向收集策略和无标准品评价回收率策略用ELSD、MS或紫外检测器作为检测设备。

8.权利要求6-7任一项所述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法在定量油中的甘油酯类成分中的应用。

说明书

一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种基于酶水解绝对定量油中甘油酯类成分的方法，属于食品药品中油类成分的质量控制技术领域。

背景技术

[0002] 甘油酯类成分主要分布在脂肪、油和奶制品中，它是由一个甘油分子与1～3个脂肪酸分子缩合而成，对生物体内的脂类代谢具有调节作用，同时对于辅助免疫系统发挥免疫功能的肠道微生物群落也有调节作用。但是，如果体内甘油酯类成分过量，或者甘油酯类成分过分吸收、异常代谢、排泄缓慢，则会导致人体出现动脉粥样硬化、高血脂和肥胖等疾病。

[0003] 植物油中的主要成分为甘油酯类成分，这些成分都具有很好的抗肿瘤效果，因此就需要控制甘油酯类成分的含量，使其既能够发挥抗肿瘤效果又不会过量引起副作用。但是由于甘油酯类成分难以分离获得，因而迫切需要开发一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法来对油进行质量控制。

[0004] 现有技术中，高效液相色谱-示差折光检测法是脂肪和食用油法定标准的检测方法，在过去的几十年里，二维气相色谱、同位素标记质谱、酶联甘油三酯检测和柱后反应检测方法已经被用于植物油中甘油酯类成分的测定，然而以上方法高度依赖甘油酯类成分的标准品，而甘油酯类标准品极难获得且品种和数量非常有限，如何在没有标准品或少用标准品的情况下绝对定量油中甘油酯类成分目前存在困难。

[0005] 现有技术中，由于脂肪酶可以高效水解甘油酯类成分，例如甘油三酯、甘油二酯和甘油一酯，所以目前普遍应用商品化的甘油三酯试剂盒能高效检测生物样品中的甘油酯类成分，尤其是血液和组织样品。但是，目前商品化或改良的甘油三酯试剂盒没有应用在油样品中甘油酯类成分的绝对定量。

发明内容

[0006] 鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法，能够在不用或少用对照品的情况下绝对定量油中的甘油酯类成分。

[0007] 本发明通过以下技术方案得以实现：

[0008] 一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法，该方法包括如下步骤：

[0009] 用LC-APCI/MS表征技术对样品油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分子量；

[0010] 利用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分；

[0011] 用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，得到回收率数值；

[0012] 利用改良的甘油三酯试剂盒和甘油或单个甘油酯标准品水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过等摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量。

[0013] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述用LC-APCI/MS表征技术对样品油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分子量的方法如下：

[0014] 步骤一，调整色谱条件，使各个甘油脂类成分实现色谱分离；

[0015] 步骤二，液相色谱-大气压化学电离质谱联用，对各个甘油脂类成分定性，获得理论摩尔分子量。

[0016] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述的靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分的方法如下：

[0017] （1）样品油经过合适的前处理，用溶剂定量溶解样品油，得到样品油溶液，在优化的色谱条件下，各成分实现基线分离，便于后续的各甘油酯类成分的含量检测分析；

[0018] （2）靶向收集策略可依赖ELSD、MS、紫外检测器，在优化的检测器条件下，便于各甘油酯类成分靶向收集；

[0019] （3）合适浓度的油样品，在优化的色谱和检测器条件下，连续进样五次，分别统计各甘油酯类成分的保留时间和峰面积的差异，判断分析系统的稳定性和重复性；

[0020] （4）靶向收集策略：运用优化的色谱和检测器条件下，各甘油酯类成分实现基线分离，用聚乙烯管分别收集各甘油酯类成分，在常温下用氮气吹干所收集样品，用于样品化合物含量测定和回收率评价。

[0021] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述的用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，其方法如下：

[0022] 步骤一，配制样品油溶液，将样品油溶液用溶剂逐步稀释成系列浓度的多个浓度的样品；

[0023] 步骤二，将步骤一所得的多个浓度的样品进入液相色谱仪进行色谱分析，色谱条件选用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分时所用的色谱条件和检测器，根据分析结果，根据色谱峰面积及浓度的对数计算样品中各个甘油酯类成分的标准曲线；

[0024] 步骤三，靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分常温下用氮气吹干后用溶剂复溶，分别进入液相色谱仪进行色谱分析，色谱条件选用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分时所用的色谱条件和检测器，得到各个甘油酯类成分的色谱峰面积（Ad）；

[0025] 步骤四，收集回收率计算：采用公式 （针对UV和/或MS检测器）或 （针对ELSD检测器）计算所收集的各甘油酯类成分吹干
后的回收率，其中R是回收率、n是稀释倍数、Ad是收集后各甘油酯类成分的检测峰面积、A0是收集后各甘油酯类成分的理论响应峰面积、k是各甘油酯类成分的标准曲线斜率、C0为原始样品溶液浓度；其中当使用MS检测器时候，Ad、A0分别表示收集后各甘油酯类成分的检测峰面积和理论响应峰面积相对一定浓度内标响应峰面积的比值。

[0026] 上述的理论响应峰面积A0是由进样量、分流比及样品标准曲线理论计算确定。

[0027] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述的利用改良的甘油三酯试剂盒和甘油或单个甘油酯标准品水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过等摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量，其方法如下：

[0028] 对商品化甘油三酯试剂盒的R2液进行改良，得到改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液；

[0029] 分三个批次利用靶向收集策略收集样品油中的各个甘油酯类成分并用氮气吹干；

[0030] 向三个批次靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分中分别添加相同量的溶剂，得到各个甘油酯类成分的溶液，再向各溶液中加入30倍溶液体积量的改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液，得到各个甘油酯类成分的混合液；

[0031] 配制对照品溶液，用溶液梯度稀释该对照品溶液，得到系列浓度的对照品溶液。

[0032] 精密吸取与各个甘油酯类成分的溶液相等体积的系列浓度的对照品稀释液，加入30倍溶液体积量的改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液，得到系列浓度对照品稀释液的混合溶液，重复三批次；

[0033] 将各个甘油酯类成分的混合液、系列浓度对照品稀释液的混合溶液分别涡旋，后放入37℃恒温箱孵育水解15min；

[0034] 将水解后的各个甘油酯类成分的混合液、系列浓度对照品稀释液的混合溶液分别吸取加入到96孔板后，加入2-4倍混合液体积量的商品化甘油三酯试剂盒的R1酶溶液，反应5min，用酶标仪550nm下测定吸收度；

[0035] 根据吸收度及浓度各取平均值计算对照品的响应值对浓度的标准曲线，再依据所述标准曲线和三个批次各个甘油酯类成分的混合液的吸收度响应值计算靶向收集策略分离并收集的样品油中的各个甘油酯类成分的浓度，取平均值；

[0036] 计算各甘油酯类成分在油中所占的质量百分含量，其计算公式为：

[0037] 其中C为靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分分别添加相同量的溶剂后，各个甘油酯类成分溶液的浓度，C0为靶向收集策略进样的样品油的浓度，M为各甘油酯类成分的理论摩尔分子量，Rs是分流比，R为靶向收集的各甘油酯类成分吹干后的回收率，运用公式所测得的值就是油中各甘油酯的质量百分含量。上述的分流比Rs是由三通阀确定，为一常数。

[0038] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，先添加改良的R2反应液，后加R1反应液，可以克服浓度相差太大时，高浓度的甘油酯类成分水解不完全，同时防止在此过程中产生的激发光淬灭的现象，利于浓度跨越太大的甘油酯类复杂成分的绝对定量。

[0039] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液为在商品化甘油三酯试剂盒的R2液中加入0～400KU/L的脂蛋白脂肪酶。

[0040] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述对照品包括甘油、三油酸甘油酯和/或单个的甘油酯，所述甘油酯还包括甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯中的一种或几种的组合。

[0041] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述溶剂包括异丙醇、乙醇、甲醇、氯仿、正己烷、二甲基亚砜、水、TWEEN系列、SPAN系列、TRITON系列表面活性剂中的一种或几种的组合，更优选的，所述溶剂为异丙醇。

[0042] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，优选的，所述样品油为包含甘油酯的植物油和/或动物油及其相关制剂。

[0043] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，更优选的，所述样品油为鸦胆子油。

[0044] 上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法中，更优选的，所述的靶向收集策略和无标准品评价回收率策略用ELSD、MS或紫外检测器作为检测设备。

[0045] 本发明还对上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法进行了验证，步骤如下：

[0046] 用溶剂梯度稀释对照品溶液，制备一系列浓度的对照品稀释液；

[0047] 优化HPLC-ELSD的色谱和检测器条件，使样品油中与对照品一致的甘油酯成分具有较好的峰型和分离度；

[0048] 将样品油溶液和系列浓度的对照品稀释液进样分析，根据峰面积和对照品浓度制备对照品的标准曲线；

[0049] 根据对照品的标准曲线，及与对照品一致的甘油酯成分的峰面积计算出样品油中与对照品一致的甘油酯成分的含量，并换算成质量百分含量；

[0050] 将所获得质量百分含量数值与酶水解绝对定量方法所获得的甘油酯含量数值运用ANOVA进行数学统计，判断所测得的含量值有无显著性差异性。

[0051] 本发明还提供上述的绝对定量油中甘油酯类成分的方法在定量油中的甘油酯类成分中的应用。

[0052] 本发明的突出效果为：

[0053] 本发明基于液相色谱-大气压化学电离质谱（LC-APCI-MS）定性表征、靶向收集技术、无标准品评价回收率策略，结合改良的商品化甘油三酯试剂盒，能够仅利用甘油或单个甘油酯标准品来绝对定量油中的甘油酯类成分。

附图说明

[0054] 图1是实施例实验流程示意图；

[0055] 图2是鸦胆子油9个甘油三酯类化合物的结构及理论摩尔分子量图；

[0056] 图3a是HPLC-ELSD色谱分析条件的漂移管温度参数优化图；

[0057] 图3b是HPLC-ELSD色谱分析条件的载气流量参数优化图；

[0058] 图4a是鸦胆子油在HPLC-ELSD优选色谱条件下的色谱图；

[0059] 图4b三油酸甘油酯HPLC-ELSD标准曲线图

[0060] 图5a是鸦胆子油逐步稀释得到的鸦胆子油中P1-P9的标准曲线图；

[0061] 图5b是收集到的P1-P9成分的回收率图；

[0062] 图6a是三油酸甘油酯与甘油的标准曲线图；

[0063] 图6b是试剂盒测定的鸦胆子油中9个甘油三酯类成分的绝对含量和HPLC-ELSD测定三油酸甘油酯的含量图。

具体实施方式

[0064] 以下便结合实施例附图，对本发明的具体实施方式作进一步的详述，以使本发明技术方案更易于理解、掌握。

[0065] 实施例

[0066] 本实施例提供一种绝对定量油中甘油酯类成分的方法，如图1所示，用LC-APCI/MS表征技术对样品油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分子量；利用靶向收集策略收集样品油中各个甘油酯类成分；用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算，得到回收率数值；利用改良的甘油三酯试剂盒和甘油或单个甘油酯标准品水解、测定各甘油酯类成分的摩尔含量，通过等摩尔换算法换算甘油的含量绝对定量样品油中各个甘油酯类成分的质量百分含量。

[0067] 本实施例运用上述方法绝对定量油中的甘油酯类成分包括如下步骤：

[0068] （1）以三油酸甘油酯和甘油为对照品，用异丙醇为溶剂，配置成浓度为9mmol/L的三油酸甘油酯溶液和浓度为9mmol/L的甘油溶液，然后将上述两种溶液用异丙醇稀释成浓度 为 9mmol/L、5.4mmol/L、3.6mmol/L、1.8mmol/L、0.9mmol/L、0.054mmol/L、0.018mmol/L和0mmol/L的系列三油酸甘油酯溶液，浓度为9mmol/L、5.4mmol/L、3.6mmol/L、1.8mmol/L、0.9mmol/L、0.054mmol/L、0.018mmol/L和0mmol/L的系列甘油溶液。

[0069] （2）以鸦胆子油（广州白云山明兴制药有限公司生产）为样品油，精密称量，用异丙醇为溶剂配置成浓度为25.9mg/mL的溶液，然后再用异丙醇稀释成浓度为25.9mg/mL、8.925mg/mL、8.288mg/mL、6.475mg/mL、5.180mg/mL、3.885mg/mL、2.590mg/mL、1.943mg/mL、
1.295mg/mL、0.648mg/mL的10个梯度的系列鸦胆子油溶液。

[0070] （3）用LC-APCI/MS表征技术对鸦胆子油溶液中的甘油酯类成分定性并获得理论摩尔分子量：

[0071] 选用高速液相色谱-大气压化学电离质谱（UFLC-APCI-MS），调整色谱条件使各个甘油酯类成分实现色谱分离以便对各个甘油酯类成分定性，获得理论摩尔分子量。

[0072] 经过色谱条件摸索，最后条件为：大气压化学电离质谱，正离子模式，喷雾电压4500V，毛细管温度350℃，雾化器和干燥器的流速分别为3L/min和5L/min，质谱质量扫描范围500～900m/z，分流模式，分流比为0.3419；UFLC条件：色谱柱为Agilent Zorbax Extend C18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm)；流动相：乙腈-异丙醇-正己烷(66:20:14,v/v/v)，采用等度洗脱；流速1mL/min；柱温25℃。

[0073] 结果如图2所示，图2中P、S、O、L与Ln分别是棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的羧酸简写，数字代序号和表化合物的理论摩尔分子量。

[0074] 本实施例鸦胆子油中共检测出9个甘油酯类成分，定义为P1-P9，对应图中的序号1-9，他们的理论摩尔分子量依次为P1878.7363、P2880.7520、P3854.7363、P4882.7676、P5856.7520、P6884.7833、P7884.7833、P8858.7676和P9886.7989。

[0075] 其中，P1-P6、P8和P9化合物文献中已经鉴定，分别为油酸亚麻酸亚油酸甘油酯（OLnL，P1）、1,2-二亚油酸-3-油酸甘油酯（OLL，P2）、1,2-二亚油酸-3-软脂酸甘油酯（LLP，P3）、1,3-二油酸-2-亚油酸甘油酯（OLO，P4）、油酸亚油酸软脂酸甘油酯（OLP，P5）、三油酸甘油酯（OOO，P6）、软脂酸亚油酸硬脂酸甘油酯（SLP，P8）和1,2-二油酸-3-硬脂酸甘油酯（SOO，P9），P7的[M+H]+为885.4，碎片离子有601.8及605.9，它们与化合物P4(OLO)及P9(SOO)相似，所以P7鉴定为亚油酸油酸硬脂酸甘油酯（SOL，P7）。

[0076] （4）利用靶向收集策略收集鸦胆子油中的甘油酯类成分P1-P9：

[0077] 鸦胆子油溶液进入液相色谱仪进行色谱分析，优化色谱条件，使P1-P9的色谱峰实现基线分离，并优化检测器，使色谱峰的分离度更大；

[0078] 经过条件摸索和色谱稳定性及重现性考察，最终确定使用HPLC-ELSD分析分离样品，HPLC条件：安捷伦1100，二元泵、自动进样器，色谱柱为Agilent Zorbax Extend C18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm)；流动相：乙腈-异丙醇-正己烷(66:20:14,v/v/v)，采用等度洗脱；流速1mL/min；柱温25℃；检测器为ELSD检测器，优选条件如图3a、图3b所示，检测温度75℃；载气流量1700mL/min，分流比为0.3419，进样浓度为25.9mg/mL的鸦胆子油溶液，进样量10μL；结果如色谱图图4a所示，鸦胆子油中的9个甘油酯类成分在HPLC-ELSD分离良好。

[0079] 收集各个色谱峰所对应的液体，在常温下氮气吹干，得到甘油酯类成分P1-P9。

[0080] （5）用无标准品评价回收率策略对靶向收集策略收集的样品油中的各个甘油酯类成分进行回收率计算：

[0081] 用HPLC-ELSD进行色谱分析，HPLC条件：安捷伦1100，二元泵、自动进样器，色谱柱为Agilent Zorbax Extend C18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm)；流动相：乙腈-异丙醇-正己烷(66:20:14,v/v/v)，采用等度洗脱；流速1mL/min；柱温25℃；检测器为ELSD检测器，优选条件如图3a、图3b所示，检测温度75℃；载气流量1700mL/min，分流比为0.3419，进样量10μL；

[0082] 取（2）所得的浓度为25.9mg/mL、8.925mg/mL、8.288mg/mL、6.475mg/mL、5.180mg/mL、3.885mg/mL、2.590mg/mL、1.943mg/mL、1.295mg/mL、0.648mg/mL的10个梯度的系列鸦胆子油溶液，进液相色谱系统分析，根据色谱峰面积及浓度对数计算鸦胆子油中P1-P9的标准曲线；结果如表1和图5a所示：

[0083] 将收集得到的P1-P9用异丙醇70μL溶解，分别进入液相色谱仪进行色谱分析，得到P1-P9的色谱峰面积Ad；

[0084] 表1

[0085]分析物 校准曲线 相关系数 线性范围(mg/mL)
P1 y=1.6970x+4.4946 0.9960 0.648～25.9
P2 y=1.8749x+6.3761 0.9894 0.648～25.9
P3 y=1.6798x+4.4353 0.9973 0.648～25.9
P4 y=1.8338x+7.5463 0.9871 0.648～25.9
P5 y=1.6943x+6.0466 0.9926 0.648～25.9
P6 y=1.8130x+8.0310 0.9880 0.648～25.9
P7 y=1.6902x+4.6279 0.9978 0.648～25.9
P8 y=1.6595x+6.7597 0.9898 0.648～25.9

[0086]P9 y=1.7259x+5.8003 0.9947 0.648～25.9

[0087] 计算回收率，计算回收率所采用的公式为：

[0088]

[0089] 其中，R是回收率、n是稀释倍数、Ad是靶向收集策略收集的鸦胆子油中的各个甘油酯类成分的色谱峰面积、A0是靶向收集策略收集的鸦胆子油中的各个甘油酯类成分的理论响应峰面积、k是鸦胆子油中各甘油酯类成分的标准曲线斜率。

[0090] 结果如图5b所示，P1-P9的回收率是0.826531133、1.030117、0.803976667、0.997285633、0.8925294、0.9529084、0.958316433、0.942161633、0.946469767。

[0091] （6）用改良的商品化甘油三酯试剂盒测定样品油中的甘油酯类成分水解后得到的甘油的含量，结合得到的回收率数值和理论摩尔分子量，绝对定量样品油中的各个甘油酯类成分的质量百分含量，其方法如下：

[0092] 取（1）制备的系列浓度的对照品稀释液各浓度各5μL，加入商品化甘油三酯试剂盒的R2液150μL，后放入37℃恒温箱孵育水解15min；再转移100μL到96孔板后，加入200μL商品化甘油三酯试剂盒的R1酶溶液，反应5min，用酶标仪550nm下测定吸收度。重复前面步骤三次，取吸光度平均值，根据吸光度和浓度计算标准曲线，如图6a所示，三油酸甘油酯的标准曲线为：y=0.0755x+0.0287，R2=0.9951;甘油的标准曲线为：y=0.079x+0.0134，R2=0.9917，可以看到两条线性基本吻合，说明R2酶溶液完全水解甘油三酯类成分，所以可以利用甘油来绝对定量甘油三酯类成分。

[0093] 向靶向收集策略收集的三个批次的P1-P9分别加入5μL的异丙醇溶剂，加入150μL改良的商品化甘油三酯试剂盒的R2液，得到P1-P9的混合液；

[0094] 三次重复精密吸取5μL系列浓度的对照品甘油稀释液，加入150μL商品化甘油三酯试剂盒的R2液，得到系列浓度对照品稀释液的混合溶液；

[0095] 将P1-P9的混合液、系列浓度对照品甘油稀释液的混合溶液分别涡旋，后放入37℃恒温箱孵育水解15min；

[0096] 将水解后的各个甘油酯类成分的混合液、系列浓度对照品稀释液的混合溶液分别吸取100μL加入到96孔板后，加入200μL商品化甘油三酯试剂盒的R1酶溶液，反应5min，用酶标仪550nm下测定吸收度；

[0097] 根据对照品甘油的吸光度与浓度标准曲线：y=0.079x+0.0134，R2=0.9917，和P1-P9的混合液的吸收度响应值计算靶向收集策略收集的P1-P9的浓度，取平均值；

[0098] 计算各甘油酯类成分在油中所占的质量百分含量，其计算公式为：

[0099] 其中C为靶向收集策略收集的P1-P9分别添加相同量的溶剂后，P1-P9溶液的浓度，C0为靶向收集策略进样的样品油溶液的浓度，M为各甘油酯类成分的理论摩尔分子量，Rs是分流比，R为靶向收集的各甘油酯类成分吹干后的回收率，运用公式所测得的值就是油中各甘油酯的质量百分含量。

[0100] 结果如图6b和表2所示，图6b为鸦胆子油中9个甘油三酯类成分的绝对含量，其中P1-P9为甘油三酯试剂盒测定的结果，P6'为利用对照品并采用HPLC-ELSD测定三油酸甘油酯的结果：

[0101] 表2：P1～P9各个成分在鸦胆子油中所占的质量百含量

[0102]

[0103] 9个甘油三酯类成分含量共占鸦胆子油质量的94.72%。

[0104] （7）绝对定量油中甘油酯类成分的方法的验证，该方法如下：

[0105] 用异丙醇制备三油酸甘油酯对照品溶液，制备一系列浓度的对照品稀释液；

[0106] 优化HPLC-ELSD的色谱和检测器条件，使鸦胆子油中的三油酸甘油酯（P6）成分具有较好的峰型和分离度；

[0107] 将鸦胆子油溶液和系列浓度的三油酸甘油酯对照品稀释液进样分析，根据峰面积2
和对照品浓度制备三油酸甘油酯的标准曲线，为y=1.7767x+9.9091，R=0.9985；

[0108] 根据对照品的标准曲线如图4b，及鸦胆子油中P6成分的峰面积计算出P6成分的质量百分含量为24.02%；

[0109] 酶水解绝对定量方法所获得的P6成分含量为24.83%，运用ANOVA进行数学统计，判断所测得的含量值与HPLC-ELSD测定值无显著性差异性。因此，基于靶向收集和酶水解，本方法在没有甘油三酯标准品的情况下，利用甘油可以绝对定量鸦胆子油中多个甘油三酯类化合物。

[0110] 由实施例可见，本发明基于液相色谱-大气压化学电离质谱（LC-APCI-MS）定性表征、靶向收集技术、无标准品评价回收率策略，结合改良的商品化甘油三酯试剂盒，能够仅利用甘油或单个甘油酯标准品来绝对定量油中的甘油酯类成分。