一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法

摘要

本发明属于益生菌微胶囊制备技术领域，具体地说是一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法。本发明对扩大培养过程中的温度、溶解氧、pH、时间和培养基进行优化控制，在胶囊制备过程中采用双层微胶囊结合真空包装。生产的枯草杆菌微胶囊在货架期内具有高活菌数、高抗逆性的优点。其产品不仅可应用于保健食品领域，也可应用于医药领域。本发明的菌株为益生菌，原料为无毒的天然化合物，可实现无污染物排放，绿色、安全、环保。

权利要求

1.一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: （1） 菌株的活化：将4℃的条件下保存小于一个月的枯草杆菌单菌落接种于种子培养基中，在32-45 ℃，100-300 rpm条件下培养12-24 h进行初次活化，然后按1-5%的接种量第二次将初次活化的枯草杆菌培养液接入种子培养基中，在相同条件下培养4-10 h进行再次活化,得活化种子液；

（2）扩大培养：将活化种子液按1-10%的接种量接种于pH6.5-8.5的装有奶粉-豆粕无菌培养基的发酵罐中，在35-45℃，溶解氧≥35%条件下发酵18-24 h，继续在25-35 ℃发酵18-48 h至内生芽孢生成率≥50%，得发酵液；

（3）洗涤：将发酵液于3000-10000 rpm速度下离心5-30 min,去除上清液，按体积比1：

1-5的比例将沉淀的菌体用无菌水振荡混匀，与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤

10

1-3次，随后用1-5%无菌奶粉液重新悬浮菌体，其活菌数≥ 10 cfu/ml，得菌悬液；

（4）单层微胶囊制备：按1-5%（W/V）的比例将无菌处理的海藻酸钠、0.1-1%（W/V）的阿魏酸和1-2%（W/V）的甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以10-30 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的1-10 ℃冷却的1-10%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴加边在100--300 rpm下搅拌，固化30-60 min，无菌水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

（5）双层微胶囊制备：用无菌处理后的0.5-5%壳聚糖对所得单层湿微胶囊进行覆膜

30-60 min，无菌水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

（6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。

2.根据权利要求1所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，对步骤（5）中所述双层湿微胶囊进行低温真空干燥为40 ℃以下的任何一种干燥方式，并真空包装。

3.根据权利要求1所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的枯草杆菌菌株指的是野生型枯草杆菌、基因工程的枯草杆菌中的一种或两种。

4.根据权利要求3所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述奶粉原料为全脂牛奶、脱脂牛奶、羊奶和马奶中的任一种，所述豆粕为玉米豆粕、大豆豆粕和花生粕的任一种。

5.根据权利要求3所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述的无菌方法为高温灭菌和过滤除菌中的任一种。

6.根据权利要求4或5所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（3）（4）（5）中的无菌水为生理盐水、磷酸缓冲液、自来水和蒸馏水的任一种。

说明书

一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及益生菌微胶囊制备技术领域，具体地说是一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法。

背景技术

[0002] 枯草杆菌 (Bacillus subtilis)，是一种好气性革兰氏阳性菌，有鞭毛。枯草杆菌的内生孢子耐高温（120 °C能存活20 min），耐酸碱(100%直达大小肠的活菌)。进入消化道后，在短期内迅速由休眠状态复活，繁殖成高含菌量的优势种群。进而消耗掉肠道内的氧气，产生过氧化氢、细菌素，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌（大肠杆菌、沙门氏杆菌）的生长，建立微生态平衡。从而预防腹泻、下痢等肠胃道疾病。枯草杆菌在临床医学上属于安全性的有益微生物，在保健食品中属于益生菌。

[0003] 益生菌是定植于人体肠道内、生殖系统内，能产生确切健康功效的生活的有益微生物的总称。随着对人们对益生菌了解、重视和研究的深入，益生菌正从保健向医疗领域延伸。然而，益生菌制品在从生产、保藏、运输、经口服过消化道到达肠道的过程中，需要经受一系列不良环境因素的影响，导致到达肠道的活菌数量大大减少，限制了益生菌生理功能的发挥。将益生菌包埋在微胶囊内可减轻环境不良因素的影响，从而提高益生菌的存活率。

[0004] 可用作微胶囊壁材的材料很多。有天然高分子聚合物、半合成高分子聚合物以及合成高分子聚合物，主要包括：碳水化合物，如海藻酸钠、壳聚糖、淀粉；植物胶类，如阿拉伯胶、κ-卡拉胶；动物蛋白，如牛奶、明胶；细菌多糖，如胶凝糖、黄原胶。用来包埋益生菌的壁材通常应具备如下特征：好的生物相容性和成膜性，合适的粘度、渗透性、亲水性和溶解性等；并具有性质稳定性、能与芯材配合，能生物降解等。对益生菌微胶囊的研究已有诸多报道，但在需氧益生菌微胶囊中还存在有很多不足，如：耐热性差、透气性强和存活期短的问题。解决这些问题的主要出路在于提高菌株的抗逆性和胶囊耐受性。

发明内容

[0005] 本发明公开一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法，旨在提高枯草杆菌的抗逆性、保藏期，大幅降低活菌经过消化道时的死亡率，使尽可能多的活菌到达肠道定植，起到益生保健作用。

[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案。

[0007] 一种货架期内具有高活菌数的枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

[0008] （1） 菌株的活化：将4℃左右的条件下保存小于一个月的枯草杆菌单菌落接种于种子培养基中，在32-45 ℃，100-300 rpm条件下培养12-24 h进行初次活化，然后按1-5%的接种量第二次将初次活化的枯草杆菌培养液接入种子培养基中，在相同条件下培养4-10 h进行再次活化,得活化种子液；

[0009] （2）扩大培养：将活化种子液按1-10%的接种量接种于pH6.5-8.5的装有的奶粉-豆粕无菌培养基的发酵罐中，在35-45℃，溶解氧≧35%条件下发酵18-24 h，继续在25-35 ℃发酵18-48 h至内生芽孢生成率≧50%，得发酵液；

[0010] （3）洗涤：将发酵液于3000-10000 rpm速度下离心5-30 min,去除上清液，按体积比1：1-5的比例将沉淀的菌体用无菌水振荡混均，与前述相同条件下离心去除上清液，10
反复洗涤1-3次，随后用1-5%无菌奶粉液重新悬浮菌体，其活菌数≥10 cfu/ml，得菌悬液；

[0011] （4）单层微胶囊制备：按1-5%（W/V）的比例将无菌处理的海藻酸钠、0.1-1%（W/V）的阿魏酸和1-2%（W/V）的甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以10-30 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的1-10 ℃冷却的1-10%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴加边在100 -300 rpm下搅拌，固化30-60 min，无菌水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

[0012] （5）双层微胶囊制备：将所得单层湿微胶囊与用无菌处理的0.5-5%壳聚糖中覆膜30-60 min，无菌水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

[0013] （6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。

[0014] 述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，对步骤（5）中所述双层湿微胶囊进行o低温真空干燥为40 C以下的任何一种干燥方式，并真空包装。

[0015] 所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的枯草杆菌菌株指的是野生型枯草杆菌、基因工程的枯草杆菌中的一种或两种。

[0016] 所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述奶粉原料为全脂牛奶、脱脂牛奶、羊奶和马奶中的任一种，所述豆粕为玉米豆粕、大豆豆粕和花生粕的任一种。

[0017] 所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，所述的无菌方法为高温灭菌和过滤除菌中的任一种。

[0018] 所述枯草杆菌微胶囊的制备方法，其特征在于，步骤（3）（4）（5）中的无菌水为生理盐水、磷酸缓冲液、自来水和蒸馏水的任一种。

[0019] 一种枯草杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

[0020] （1） 菌株的活化：将4℃保存小于一个月的枯草杆菌单菌落接种于种子培养基中，在32-45 ℃，100-300 rpm条件下培养12-24 h进行初次活化；然后按1-5%的接种量第二次接入种子培养基中，在相同条件下培养4-10 h进行再次活化,得活化种子液；

[0021] 所述枯草杆菌菌株为野生型枯草杆菌和基因工程的枯草杆菌中的任一种；所述种子培养基为改良LB培养基：10 g胰蛋白胨，10 g氯化钠，5 g酵母提取粉，5 g甘油，加水定o容至1000 mL，调pH至7.0-7.4，分装（固体培养基加1.5%琼脂）,在115 C下灭菌20 min，所用试剂均为分析纯。

[0022] （2）扩大培养：将活化种子液按1-10%的接种量接种于装有pH6.5-8.5的无菌奶粉-豆粕培养基的发酵罐中，在35-45℃，溶解氧≧35%条件下发酵18-24 h，继续在25-35 ℃发酵18-48 h至内生芽孢生成率≧50%，得发酵液；

[0023] 所述奶粉为全脂牛奶、脱脂牛奶、羊奶和马奶中的任一种，所述豆粕为玉米豆粕、大豆豆粕和花生粕的任一种，所述的无菌方法为高温灭菌和过滤除菌中的任一种。奶粉-豆粕培养基：过100目筛豆粕粉10-20克溶于1000毫升水，60℃保温30分钟，4000转/min离心10min后取上清得豆粕培养基；加20-200克奶粉至豆粕培养基中得奶粉-豆粕培养基。

[0024] （3）洗涤：将发酵液于3000-10000 rpm速度下离心5-30 min,去除上清，按体积比1：1-5的比例将沉淀的菌体用无菌水振荡混均，与前述相同条件下离心去除上清液，反10
复洗涤1-3次，随后用1-5%无菌奶粉液重新悬浮菌体（活菌数≥10 cfu/ml），得菌悬液。

[0025] 所述无菌水为生理盐水、磷酸缓冲液、自来水和蒸馏水的任一种。

[0026] （4）单层微胶囊制备：按1-5%（W/V）的比例将海藻酸钠、0.1-1%（W/V）阿魏酸和1-2%（W/V）甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以10-30 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的1-10 ℃冷却的1-10%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（100 -300 rpm），固化30-60 min，无菌水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

[0027] （5）双层微胶囊制备：将所得单层湿微胶囊与0.5-5%壳聚糖中覆膜30-60 min，无菌水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

[0028] （6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。

[0029] 所述的真空包装中用于脱氧的气体可以是N2或N2、CO2、H2的混合气。

[0030] 以上所述枯草杆菌微胶囊的制备方法所制备的枯草杆菌微胶囊应用于保健食品和医药领域。

[0031] 本发明的有益效果是：在扩大培养时采用优化的培养条件，包括温度、溶解氧、pH、时间和培养基，特别是双温度段培养，使之细胞大量繁殖和孢子大量形成；在胶囊制备中采用双层微胶囊结合真空包装使细胞处于良好的休眠环境。提高益生菌活菌的抗逆性、保藏期，大幅降低活菌经过胃时胃液的破坏作用，使尽可能多的活菌到达肠道定植，起到益生保健功能。

[0032] 本发明通过整合细胞生理特征与胶囊制备技术生产的枯草杆菌微胶囊具有货架期内高活菌数、高抗逆性的优点。其产品不仅可应用于保健食品领域，也可应用于医药领域。本发明的菌株为益生菌，原料为无毒的天然化合物，可实现无污染物排放，绿色、安全、环保。

具体实施方式

[0033] 为了更充分理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。

[0034] 以下实施例使用以下材料：

[0035] 所用水均符合国家“生活饮用水卫生标准”（GB 5749—2006）。

[0036] 野生菌：枯草芽孢杆菌B. subtilis 168。

[0037] 工程菌：枯草芽孢杆菌B. subtilis IBL 241 [WB800N/pHCMC05-svu022]。

[0038] 培养基原料：全脂奶粉，雀巢全脂奶粉，双城雀巢有限公司；豆粕，大豆豆粕，山东嘉冠油脂化工有限公司。

[0039] 种子培养基为改良LB种子培养基（1L）： 10 g胰蛋白胨，10 g氯化钠，5 g酵母提取粉，5 g甘油，加水定容至1000 mL，调pH至7.0-7.4，分装（固体培养基加1.5%琼脂）,在o115 C下灭菌20 min，所用试剂均为分析纯。

[0040] 实施例1

[0041] 一种枯草杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

[0042] （1） 菌株的活化：将保存于4℃保存小于一个月的枯草杆菌B. subtilis 168单菌落接种于种子培养基中，在37 ℃，200 rpm条件下培养16-20 h进行初次活化；然后按2%的接种量第二次接入种子培养基中，在相同条件下培养4-10 h进行再次活化,得活化种子液；

[0043] （2）扩大培养：将活化种子液按4-6%的接种量接种于装有奶粉-豆粕（5%脱脂奶粉与1%大豆豆粕4000rpm离心上清）的115℃高温灭菌的培养基（pH 7.5）的发酵罐中，在37 ℃，溶解氧≧30%条件下发酵20-24 h，继续在25 ℃发酵24-36 h至内生芽孢大量形成（芽孢生成率≧50%），得发酵液；

[0044] （3）洗涤：将发酵液于6000 rpm速度下离心15 min,去除上清，按体积比1：2的比例将沉淀的菌体用无菌自来水振荡混均，与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤210
次，随后用1%无菌脱脂奶粉液重新悬浮菌体（活菌数≥10 cfu/ml），得菌悬液；

[0045] （4）单层微胶囊制备：按2%（W/V）的比例将海藻酸钠、0.5%（W/V）阿魏酸和1%（W/V）甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以20 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的4℃冷却的5%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（200 rpm），固化40 min，无菌自来水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

[0046] （5）双层微胶囊制备：将所得单层湿微胶囊与1%壳聚糖中覆膜45 min，无菌自来水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

[0047] （6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。

[0048] 该枯草杆菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥1×109个/g,芽孢≧60%；淡黄色，无异味。

[0049] 以上制得的枯草杆菌干微胶囊产品可应用于保健食品和医药领域。

[0050] 实施例2

[0051] 一种枯草杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

[0052] （1） 菌株的活化：将保存于4℃保存小于一个月枯草杆菌B. subtilis 168单菌落接种于种子培养基中，在39 ℃，200 rpm条件下培养16-20 h进行初次活化；然后按2%的接种量第二次接入种子培养基中，在相同条件下培养4-10 h进行再次活化,得活化种子液；

[0053] （2）扩大培养：将活化种子液按4-6%的接种量接种于装有奶粉-豆粕（5%全脂奶粉与1%玉米豆粕）的115℃高温灭菌的培养基（pH 8.0）的发酵罐中，在39 ℃，溶解氧≧40%条件下发酵20-24 h，继续在30 ℃发酵36-48 h至内生芽孢大量形成（芽孢生成率≧50%），得发酵液；

[0054] （3）洗涤：将发酵液于4000 rpm速度下离心20 min,去除上清，按体积比1：3的比例将沉淀的菌体用无菌生理盐水（0.9%NaCl）振荡混均，与前述相同条件下离心去除上清10
液，反复洗涤2次，随后用1%无菌全脂奶粉液重新悬浮菌体（活菌数≥10 cfu/ml），得菌悬液；

[0055] （4）单层微胶囊制备：按3%（W/V）的比例将海藻酸钠、0.5%（W/V）阿魏酸和2%（W/V）甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以20 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的4℃冷却的4%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（200 rpm），固化40 min，无菌生理盐水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

[0056] （5）双层微胶囊制备：将所得单层湿微胶囊与2%壳聚糖中覆膜45 min，无菌生理盐水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

[0057] （6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。

[0058] 该枯草杆菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥1×1010个/g,芽孢≧80%；淡黄色，无异味。

[0059] 以上制得的枯草杆菌干微胶囊产品可应用于保健食品和医药领域。

[0060] 实施例3

[0061] 一种枯草杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

[0062] （1） 菌株的活化：将保存于4℃保存小于一个月的枯草杆菌B. subtilis 168单菌落接种于种子培养基中，在37 ℃，200 rpm条件下培养16-20 h进行初次活化；然后按2%的接种量第二次接入种子培养基中，在相同条件下培养4-10 h进行再次活化,得活化种子液；

[0063] （2）扩大培养：将活化种子液按4-6%的接种量接种于装有奶粉-豆粕（10%全脂奶粉与1%玉米豆粕）的115℃高温灭菌的培养基（pH 7.0）的发酵罐中，在39 ℃，溶解氧≧30%条件下发酵20-24 h，继续在28 ℃发酵36-48 h至内生芽孢大量形成（芽孢生成率≧50%），得发酵液；

[0064] （3）洗涤：将发酵液于4000 rpm速度下离心20 min,去除上清，按体积比1：3的比例将沉淀的菌体用无菌自来水振荡混均，与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤210
次，随后用1%无菌全脂奶粉液重新悬浮菌体（活菌数≥10 cfu/ml），得菌悬液；

[0065] （4）单层微胶囊制备：按3%（W/V）的比例将海藻酸钠、0.5%（W/V）阿魏酸和1%（W/V）甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以20 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的4℃冷却的3%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（200 rpm），固化40 min，无菌自来水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

[0066] （5）双层微胶囊制备：将所得单层湿微胶囊与2%壳聚糖中覆膜45 min，无菌自来水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

[0067] （6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。

[0068] 该枯草杆菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥2×1010个/g,芽孢≧80%；淡黄色，无异味。

[0069] 以上制得的枯草杆菌干微胶囊产品可应用于保健食品和医药领域。

[0070] 实施例4

[0071] 一种枯草杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

[0072] （1） 菌株的活化：将保存于4℃保存小于一个月的枯草杆菌B. subtilis 241单菌落接种于种子培养基中，在37 ℃，200 rpm条件下培养16-20 h进行初次活化；然后按2%的接种量第二次接入种子培养基中，在相同条件下培养4-10 h进行再次活化,得活化种子液；

[0073] （2）扩大培养：将活化种子液按4-6%的接种量接种于装有奶粉-豆粕（10%全脂奶粉与2%玉米豆粕）的110-115℃高温灭菌的培养基（pH 7.0）的发酵罐中，在39 ℃，溶解氧≧30%条件下发酵20-24 h，继续在28 ℃发酵36-48 h至内生芽孢大量形成（芽孢生成率≧50%），得发酵液；

[0074] （3）洗涤：将发酵液于4000 rpm速度下离心20 min,去除上清，按体积比1：3的比例将沉淀的菌体用无菌自来水振荡混均，与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤210
次，随后用1%无菌全脂奶粉液重新悬浮菌体（活菌数≥10 cfu/ml），得菌悬液；

[0075] （4）单层微胶囊制备：按2.5%（W/V）的比例将海藻酸钠、0.5%（W/V）阿魏酸和1%（W/V）甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以20 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的4℃冷却的3%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（200 rpm），固化60 min，无菌自来水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

[0076] （5）双层微胶囊制备：将所得单层湿微胶囊与2%壳聚糖中覆膜45 min，无菌自来水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

[0077] （6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。

[0078] 该枯草杆菌干微胶囊产品的保质期≥2年，活菌数≥5×1010个/g,芽孢≧90%；淡黄色，无异味。

[0079] 以上制得的枯草杆菌干微胶囊产品可应用于保健食品和医药领域。

[0080] 实施例5

[0081] 一种枯草杆菌微胶囊的制备方法，包括以下步骤：

[0082] （1） 菌株的活化：将保存于4℃保存小于一个月的枯草杆菌B. subtilis 168单菌落接种于种子培养基中，在32 ℃，100 rpm条件下培养24 h进行初次活化；然后按1%的接种量第二次接入种子培养基中，在相同条件下培养10 h进行再次活化,得活化种子液；

[0083] （2）扩大培养：将活化种子液按1%的接种量接种于装有奶粉-豆粕（2%羊奶粉与1%大豆豆粕）的110-115℃高温灭菌的培养基（pH 6.5）的发酵罐中，在35 ℃，溶解氧≧35%条件下发酵24 h，继续在25 ℃发酵48 h至内生芽孢大量形成（芽孢生成率≧50%），得发酵液；

[0084] （3）洗涤：将发酵液于3000 rpm速度下离心30 min,去除上清，按体积比1：1的比例将沉淀的菌体用无菌蒸馏水振荡混均，与前述相同条件下离心去除上清液，反复洗涤19
次，随后用1%无菌羊奶粉液重新悬浮菌体（活菌数≥10 cfu/ml），得菌悬液；

[0085] （4）单层微胶囊制备：按1%（W/V）的比例将海藻酸钠、0.1%（W/V）阿魏酸和1%（W/V）甘油加入菌悬液中，无菌条件下充分搅拌混匀，得菌胶液；以10 ml/min流速用注射泵将菌胶液注入无菌的1℃冷却的1%（M/V）的氯化钙溶液中，边滴边加搅拌（100 rpm），固化30 min，无菌蒸馏水洗涤三次，得单层湿微胶囊；

[0086] （5）双层微胶囊制备：将所得单层湿微胶囊与0.5%壳聚糖中覆膜60 min，无菌蒸馏水洗涤三次，得双层湿微胶囊；

[0087] （6）干燥保藏：将双层湿微胶囊进行低温真空干燥后在无菌条件下进行真空包装，得枯草杆菌干微胶囊。