本发明提供一种细胞培养装置或细胞共培养装置，其包含可通透薄层，所述薄层具有供细胞在其上贴附并生长的上表面和下表面。所述上表面和下表面上可分别接种和培养不同的细胞。本发明还提供对两种或更多种细胞进行培养的方法。本发明还提供了对细胞与细胞之间的近程相互作用进行测试的方法。
1.细胞培养装置，其包含可通透薄层，其中所述薄层具有供细胞在其上贴附并生长的上表面和下表面；其中所述薄层的下表面附着有下基板，其具有一个或更多个通孔，使得所述通孔与所述薄层共同限定出一个或更多个下部细胞培养孔；其中所述薄层的上表面附着有上基板，其具有一个或更多个通孔，使得所述通孔与所述薄层共同形成一个或更多个上部细胞培养孔，其中所述上部细胞培养孔至少部分处于与所述下部细胞培养孔相对应的位置；其中所述的可通透薄层是微孔膜，其孔径使得细胞不能通过，而细胞培养基能够通过。
2.权利要求1的细胞培养装置，其中所述可通透薄层是柔性膜。
3.权利要求1或2的细胞培养装置，其中所述上基板中通孔的大小和位置与所述下基板中的通孔相对应，使得所述上部细胞培养孔与所述下部细胞培养孔彼此完全对应。
4.权利要求1或2的细胞培养装置，其中下基板的上表面和上基板的下表面中的一个包含一个或更多个凸起，而另一个包含与所述凸起的大小和位置相匹配的一个或更多个凹陷，使得下基板、可通透薄层和上基板依次叠放在一起，并通过将所述凸起插入对应的凹陷中而实现固定。
5.权利要求3的细胞培养装置，其中下基板的上表面和上基板的下表面中的一个包含一个或更多个凸起，而另一个包含与所述凸起的大小和位置相匹配的一个或更多个凹陷，使得下基板、可通透薄层和上基板依次叠放在一起，并通过将所述凸起插入对应的凹陷中而实现固定。
6.权利要求5的细胞培养装置，其中下基板的下表面和上基板的上表面中的一个包含一个或更多个凸起，而另一个包含与所述凸起的大小和位置相匹配的一个或更多个凹陷，使得多个所述细胞培养装置能够依次叠放在一起，并通过将所述凸起插入对应的凹陷中而避免相对移动。
7.权利要求1、2、5和6中任一项的细胞培养装置，其中所述通孔的直径为1至10mm，和/或所述通孔的深度为0.8至3.0mm，和/或其中所述通孔之间的距离为1.5至10mm。
8.权利要求3的细胞培养装置，其中所述通孔的直径为1至10mm，和/或所述通孔的深度为0.8至3.0mm，和/或其中所述通孔之间的距离为1.5至10mm。
9.权利要求4的细胞培养装置，其中所述通孔的直径为1至10mm，和/或所述通孔的深度为0.8至3.0mm，和/或其中所述通孔之间的距离为1.5至10mm。
10.权利要求1、2、5和6中任一项的细胞培养装置，其中所述薄层的上表面和/或下表面涂覆有促进细胞贴附、铺展和/或增殖的材料。
11.权利要求3的细胞培养装置，其中所述薄层的上表面和/或下表面涂覆有促进细胞贴附、铺展和/或增殖的材料。
12.权利要求4的细胞培养装置，其中所述薄层的上表面和/或下表面涂覆有促进细胞贴附、铺展和/或增殖的材料。
13.权利要求7的细胞培养装置，其中所述薄层的上表面和/或下表面涂覆有促进细胞贴附、铺展和/或增殖的材料。
14.权利要求8或9的细胞培养装置，其中所述薄层的上表面和/或下表面涂覆有促进细胞贴附、铺展和/或增殖的材料。
15.利用权利要求1、2、5、6、8、9和11-13中任一项的细胞培养装置进行的细胞培养方法，其包括将所述细胞培养装置置于细胞培养容器中。
16.利用权利要求3的细胞培养装置进行的细胞培养方法，其包括将所述细胞培养装置置于细胞培养容器中。
17.利用权利要求4的细胞培养装置进行的细胞培养方法，其包括将所述细胞培养装置置于细胞培养容器中。
18.利用权利要求7的细胞培养装置进行的细胞培养方法，其包括将所述细胞培养装置置于细胞培养容器中。
19.利用权利要求10的细胞培养装置进行的细胞培养方法，其包括将所述细胞培养装置置于细胞培养容器中。
20.利用权利要求14的细胞培养装置进行的细胞培养方法，其包括将所述细胞培养装置置于细胞培养容器中。
21.权利要求15的细胞培养方法，其包括以下步骤：
a)将所述细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上的下部细胞培养孔中；
c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上的上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞。
22.权利要求16-20中任一项的细胞培养方法，其包括以下步骤：a)将所述细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上的下部细胞培养孔中；
c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上的上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞。
25.权利要求21、23和24中任一项的细胞培养方法，其中将多个所述细胞培养装置置于同一细胞培养容器中。
26.权利要求22的细胞培养方法，其中将多个所述细胞培养装置置于同一细胞培养容器中。
a)将权利要求1、2、5、6、8、9和11-13中任一项的细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上的下部细胞培养孔中；
c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上的上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞；
d)对所述第一或第二细胞的性状或参数进行评价，并与参照细胞进行比较。
a)将权利要求3的细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上的下部细胞培养孔中；
c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上的上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞；
d)对所述第一或第二细胞的性状或参数进行评价，并与参照细胞进行比较。
a)将权利要求4的细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上的下部细胞培养孔中；
c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上的上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞；
d)对所述第一或第二细胞的性状或参数进行评价，并与参照细胞进行比较。
a)将权利要求7的细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上的下部细胞培养孔中；
c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上的上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞；
d)对所述第一或第二细胞的性状或参数进行评价，并与参照细胞进行比较。
a)将权利要求10的细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上的下部细胞培养孔中；
c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上的上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞；
d)对所述第一或第二细胞的性状或参数进行评价，并与参照细胞进行比较。
a)将权利要求14的细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上的下部细胞培养孔中；
c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上的上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞；
d)对所述第一或第二细胞的性状或参数进行评价，并与参照细胞进行比较。
细胞培养装置
技术领域
[0001] 本发明一般地涉及生物学及医学领域。特别地，本发明涉及细胞培养，尤其是多种细胞的共培养。
背景技术
[0002] 细胞培养是生物学及医学领域的重要技术，其目的是使细胞在体外条件下进行生长和增殖。
[0003] 应用最为广泛的细胞培养形式是在培养容器中合适的培养基中对一种细胞进行培养，例如单层培养。这种培养的缺点是无法准确地模拟细胞在体内的真实环境。例如，这种培养无法实现不同细胞种类之间的通信，而这在体内环境中对细胞的性状有重要的影响。
[0004] 为了使得体外细胞培养环境尽可能接近体内真实环境，人们开发了多细胞共培养技术。在共培养技术中，将两种或更多种细胞置于同一培养环境中(例如同一培养基中)。
[0005] 细胞共培养主要分为直接共培养和非直接共培养。直接共培养是指将不同细胞直接接种在同一培养容器中，使得不同的细胞彼此直接接触。直接共培养的缺点是难以清楚地观察不同种细胞的生长，并且难以分离特定的目的细胞用于后续研究。非直接共培养是将不同细胞培养在不同的载体上，再将所述载体置于同一培养环境中。非直接培养系统的实例有康宁(Corning)公司的Transwell共培养系统以及Millipore公司的Millicell悬挂式小室等。这些系统的缺点是只能进行非直接共培养，不能实现两种贴壁细胞的直接共培养。另外一种共培养方法是采用条件培养基进行培养，这种方法试剂和人力消耗较大，操作繁琐。
发明内容
[0006] 本发明提供一种细胞培养装置或细胞共培养装置，其包含可通透薄层，所述薄层具有供细胞在其上贴附并生长的上表面和下表面。所述上表面和下表面可分别接种和培养不同的细胞。本发明的细胞培养装置能够实现细胞-细胞近程相互作用，从而模拟两种不同贴壁细胞的直接共培养。本发明的细胞培养装置能够同时实现两种、三种、四种或更多种不同细胞的共培养。本发明的细胞培养装置能够同时实现不同细胞的直接和间接共培养，从而更为准确地模拟体内细胞生长环境。本发明的装置还允许在共培养过程中容易地分离特定目的细胞。此外，本发明细胞培养装置的设计灵活性较大，可以按需要将多个本发明装置平行放于同一个培养容器中或者竖直叠放在一起。所述多个本发明装置可以各自为不同尺寸，也可以各自接种不同种细胞。这样，目的细胞被放置于类似于体内的三维微环境中，更能促进其生长并且模拟在体内的行为。
[0007] 本发明还提供了细胞培养方法，其包括在可通透薄层的两个表面上分别接种和培养不同的细胞。
[0008] 本发明还提供了测试细胞-细胞近程相互作用的方法，其包括在可通透薄层的两个表面(上表面和下表面)分别接种和培养不同的细胞，然后对所述细胞的性状或参数进行评价。
[0009] 本发明细胞培养方法的一般步骤如下：
[0010] (1)单种细胞培养：将制备好的细胞悬液加入到细胞培养孔中，待培养基渗入到膜表面后，通过所述的培养基更换通道加入新鲜的培养基；
[0011] (2)不同种细胞之间的直接共培养的方法：先将本发明的细胞培养装置倒置以使底面朝上，将一种或更多种贴壁细胞接种在下部细胞培养孔中，待细胞贴壁后，将装置翻转，在膜的上表面接种一种或多种细胞，从而上下两层的细胞之间直接共培养，但与此同时可以方便的收集上层的目的细胞；
[0012] (3)不同种细胞间的非直接共培养的方法：在培养皿中预先接种一种或多种贴壁细胞，待其铺满整个培养皿底部，将方法(1)中已接种好的细胞培养装置放入这个培养皿中，即可实现不同种细胞间的非直接共培养。
[0013] 与本领域常规的非直接共培养相比，本发明细胞培养装置下部细胞培养孔中的细胞能够通过近程相互作用更有效地对上部细胞培养孔中的细胞产生影响。因此，本发明的细胞培养装置特别适用于难以培养的细胞，或用于对单个细胞进行培养，例如用于干细胞、受精卵、胚胎的培养以及用于克隆技术中。
附图说明
[0014] 以下附图构成本说明书的一部分，其用于进一步展示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一幅或更多幅并与本文所述具体实施方案相结合，可以更好地理解本发明。在这些附图中，相同的附图标记代表相同的组件。
[0015] 图1是本发明细胞培养装置的一个实施方案的示意图。其中，图1a为主视图，图1b为侧视图，图1c为俯视图，图1d为剖视图，图1e为轴测图。其中附图标记如下：1-可通透薄层；2-下基板；3-上基板；4-上部细胞培养孔；5-凹陷；6-夹持部；7-培养基更换通道。
[0016] 图2是本发明细胞培养装置一个实施方案的示意图，其中5为凹陷，8为凹陷5相对于的凸起。
[0017] 图3是本发明细胞培养装置中细胞培养孔的照片。
[0018] 图4显示将本发明细胞培养装置与不同细胞培养容器的组合应用。
[0019] 图5显示了本发明细胞培养装置的夹持部和培养基更换通道。
[0020] 图6为实施例2中NIH-3T3细胞脱附后的照片。
[0021] 图7为与NIH-3T3细胞共培养前后的HL-60细胞的照片。
[0022] 图8为单独培养、与培养皿底部的与NIH-3T3细胞共培养以及与下部细胞培养孔中的与NIH-3T3细胞共培养的HL-60细胞的照片。
具体实施方式
[0023] 定义
[0024] 在具体描述本发明之前，首先对以下术语进行定义：
[0025] “可通透薄层”也可称为通透性薄层。可通透薄层对于细胞培养基而言是可通透的，它能够吸收、引导培养基进入本发明的细胞培养孔中。可通透薄层对于细胞而言是不通透的，即细胞不能穿过。可通透薄层的例子包括微孔膜，其孔径使得细胞不能通过，而细胞培养基能够通过。可通透薄层的厚度必须使得上层细胞与下层细胞能够方便地进行细胞通信等相互作用。
[0026] “近程相互作用”指本发明细胞与细胞之间发生的与直接接触时相似的相互作用。“近程相互作用”包括但不限于直接接触。不限于理论，本发明可通透薄层的上表面和下表面所培养的细胞之间距离很近，使得彼此所分泌的信号分子、生长因子等更容易进行交流，从而对彼此施加与直接接触时相似的相互作用。当上表面和下表面培养的都是贴壁细胞时，如神经元细胞，它们可通过树突，通过膜上的微米级的孔(例如，直径为8μm)可通过突触发生物理接触。此时的近程相互作用与直接接触时的情形更为接近。
[0027] 在一些实施方案中，本发明的细胞共培养装置包含可通透薄层。所述可通透薄层的上表面上可以附着有上基板。所述可通透薄层的下表面上可附着有下基板。在一个实施方案中，上基板、可通透薄层、下基板三者依次叠放，形成“三明治”结构。上基板具有一个或更多个通孔，使得所述通孔分别与所述薄层共同形成一个或更多个下部细胞培养孔。上基板具有一个或更多个通孔，使得所述通孔分别与所述薄层共同形成一个或更多个上部细胞培养孔。上部细胞培养孔至少部分处于与所述下部细胞培养孔相对应的位置。优选地，所述上基板上的通孔的大小和位置与所述下基板上的通孔相对应，使得所述上部细胞培养孔与所述下部细胞培养孔彼此完全对应。
[0028] 使用时，将一种或更多种第一细胞(例如饲养细胞)接种在下部细胞培养孔中，而将一种或更多种第二细胞接种在上部细胞培养孔中。上部细胞培养孔中的细胞与下部细胞培养孔中的细胞可通过可通透薄层中的孔发生近程相互作用，从而实现与直接共培养相似的培养效果。由于第二细胞与第一细胞不混杂在一起，在共培养后第二细胞可以方便地从上部细胞培养孔中分离用于后续用途。
[0029] 此外，本发明的细胞培养装置可置于细胞培养容器(如培养皿或培养板的孔)中。所述细胞培养容器的底部可以接种第三细胞，实现与所述第一细胞/第二细胞的非直接共培养。另外，可以按需要将多个本发明装置平行放于同一个细胞培养容器中或者竖直叠放在一起，以实现更多种不同细胞的复杂共同培养，从而更准确地模拟体内细胞环境。
[0030] 本发明细胞培养装置的可通透薄层优选为柔性膜。所述可通透薄层的上表面和/或下表面可涂覆有促进细胞贴附、铺展和/或增殖的材料，例如ECM和纤连蛋白以及胶原。作为替代或补充，所述可通透薄层的上表面和/或下表面可涂覆有温敏材料，所述温敏材料与细胞的粘附特性随温度发生改变，从而允许通过改变温度而使贴壁细胞脱壁。使用这样的温敏材料，可以避免在收集细胞时对细胞造成机械损伤或化学损伤(例如与吹打、酶处理相关的损伤)。这种温敏材料的一个实例是聚异丙基丙烯酰胺，例如Nunc生产的TMThermo UpCell Surface。
[0031] 本发明的上基板和下基板可采用透明的玻璃或医用塑料等为材料制成。优选地，所述装置的外部尺寸与实验室所用的细胞培养容器(培养皿或培养板的孔)的尺寸接近，使其适于放置在常规的细胞培养容器中而不显著晃动。优选地，上基板与下基板的构造完全相同，以提供制造方面的便利性。
[0032] 上基板和下基板可通过粘合剂与可通透薄层粘合在一起。或者，在一些实施方案中，下基板的上表面和上基板的下表面中的一个包含一个或更多个凸起，而另一个包含与所述凸起的大小和位置相匹配的一个或更多个凹陷，使得下基板、可通透薄层和上基板依次叠放在一起，并通过将所述凸起插入对应的凹陷中而实现固定。
[0033] 在一些实施方案中，下基板的下表面和上基板的上表面中的一个包含一个或更多个凸起，而另一个包含与所述凸起的大小和位置相匹配的一个或更多个凹陷，使得可以将多个本发明细胞培养装置依次叠放在一起，并通过将所述凸起插入对应的凹陷中而避免相对移动。例如，上基板的下表面包含一个或更多个凸起，上表面包含与所述凸起的位置和大小相对应的一个或更多个凹陷，而下基板的结构与上基板相同。在这种情况下，可以方便地实现上基板与下基板的固定以及多个不同细胞培养装置之间的固定，而同时提供制造方面的便利性。
[0034] 在一个具体实例中，上基板的下表面有四个小圆柱，高2mm直径为1.5mm，完全与下基板上对应的四个孔相嵌，从而将薄膜夹紧。
[0035] 所述的上下连通的孔设有1-120个，孔的尺寸和形状可以根据实验需求设计，孔的大小为1～10mm，孔深为0.8～3.0mm，各孔之间的距离为1.5～10mm，孔深和直径之间的比例使得液体易于在各孔间流动。
[0036] 在一些实施方案中，所述细胞培养装置上具有夹持部，其适于用镊子夹取。夹持部可以便于操作本发明的细胞培养装置(特别是在其置于与其大小十分接近的细胞培养容器中时)，而避免污染细胞和培养基。在一些实施方案中，所述细胞培养装置上设置有培养基更换通道，以便于添加和移除培养基(特别是在其置于与其大小十分接近的细胞培养容器中时)。
[0037] 在一些实施方案中，本发明的细胞培养装置可以包含上基板和下基板二者之一。在这种实施方案中，可以用粘合剂将可通透薄层与基板固定在一起。在这种实施方案中，可以在本发明的细胞培养装置上设置支持件，以使得本发明的细胞培养装置与容器底部之间保持一定的空间距离。在一些实施方案中，本发明的细胞培养装置可以不包含上基板也不包含下基板。在这样的实施方案中，可以设置支持件以使得本发明的细胞培养装置与容器底部之间保持一定的空间距离。
[0038] 本发明还提供利用本发明细胞培养装置进行的细胞培养方法，特别是细胞共培养方法，其包括：
[0039] a)将所述细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
[0040] b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上，例如接种在下部细胞培养孔中；
[0041] c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上接种一种或更多种第二细胞，例如在上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞。
[0042] 可以按需要将多个本发明装置平行放于同一个培养容器中或者竖直叠放在一起，以实现更多种不同细胞的共同培养。
[0043] 本发明还提供利用本发明细胞培养装置来测试细胞-细胞近程相互作用的方法，其包括：
[0044] a)将所述细胞培养装置倒置于细胞培养容器中，以使所述薄层的下表面向上；
[0045] b)将一种或更多种第一细胞接种在所述下表面上，例如接种在下部细胞培养孔中；
[0046] c)在所述细胞贴壁后，将所述装置翻转以使所述薄层的上表面向上，并在所述薄层的上表面上接种一种或更多种第二细胞，例如在上部细胞培养孔中接种一种或更多种第二细胞；
[0047] d)对所述第一或第二细胞的性状或参数进行评价，并与参照细胞进行比较。
[0048] 实施例
[0049] 未特别指出时，实施例中所用材料和方法均为细胞生物学领域的常规技术。这些技术为本领域技术人员所知，并可在教科书、文献中容易地获得。
[0050] 实施例1：本发明细胞培养装置的制备
[0051] 所用的细胞培养装置由上基板、薄膜和下基板构成，三者之间构成“三明治”结构。上基板和下基板采用聚苯乙烯材料制成，外观为直径3.3cm的圆板。上基板和下基板上各有120个连通的圆柱形通孔，孔深为2mm，孔的直径为2mm。上基板和下基板的下表面各有四个小圆柱，高2mm直径为1.5mm，上基板和下基板的上表面各有四个孔，与小圆柱的大小和高度对应，从而将薄膜夹紧。薄膜为聚对苯二甲酸乙二醇酯膜(PET)，孔径为8μm。该装置在侧面设置有培养基更换通道，其为长1cm宽0.5cm的槽。该装置还设置有夹持部，尺TM
寸为长0.5mm宽0.2mm厚度0.2mm。薄膜表面交联有40wt％的温敏材料(Thermo UpCell Surface)。上基板、下基板和薄膜组装在一起，将这个装置放于75％乙醇中浸泡灭菌，并在超净台中风干。
[0052] 实施例2：接种NIH-3T3细胞
[0053] 1.接种
[0054] 将实施例1制备的细胞培养装置放置在直径为35mm的培养皿中，在其上表面加入6
浓度为2×10个/mL的NIH-3T3细胞悬液，待细胞悬液渗入孔中后，从侧面的通道加入新鲜培养基。培养基与装置的上表面齐平，但不覆盖上表面。细胞贴壁后，稍微加入新鲜培养基以覆盖住整个细胞培养装置进行培养。
[0055] 2.脱壁
[0056] 将装有细胞培养装置的培养皿放置在环境温度为20摄氏度左右，放置10分钟，然后在显微镜下观察到脱附的细胞团(图6)，将每个孔的细胞吸出并轻轻机械吹打，可以用于后续的检测或扩大培养。
[0057] 实施例3：贴壁细胞NIH-3T3与细胞HL-60的共培养
[0058] 所用的细胞培养装置的尺寸与实施例1中相同，只是中间的膜换成孔径为5μm的聚碳酸酯膜。薄膜表面未进行处理，将上基板、薄膜和下基板组装在一起，置于75％乙醇中浸泡灭菌，并放在超净台中风干。
[0059] 将浓度为2×106个/mL的NIH-3T3细胞接种在直径为35mm的培养皿底部，24小时后将培养基移除，并用PBS冲洗表面。然后将已灭菌风干的上述细胞培养装置放入其中，5
将浓度为2×10个/mL的HL-60细胞悬液滴在装置表面，待细胞悬液完全渗入孔内，从侧面的通道加入新鲜培养基。培养基的总体积与装置的上表面齐平，但不覆盖上表面，防止悬浮细胞HL-60的溢出。待共培养一段时间后，观察悬浮细胞HL-60的生长状况。图7a显示接种时的HL-60细胞，图7b是共培养后的细胞，共培养前后细胞数量明显增加，说明共培养利于目的细胞的生长。
[0060] 实施例4：本发明近程相互作用的证实-单细胞共培养实验
[0061] 所用的细胞培养装置与实施例3相同，向本发明细胞培养装置的各个孔中接种HL-60单细胞(图8a)。实验分为以下三组：
[0062] 1.对照组：将细胞HL-60单独培养7天；
[0063] 2.非直接共培养组：将细胞HL-60与培养皿底部的饲养层细胞NIH-3T3共培养7天；
[0064] 3.近程相互作用组：将HL-60细胞与位于下部细胞培养孔中的饲养层细胞NIH-3T3共培养7天。
[0065] 之后，观察孔中的细胞生长情况。其中，采用吖啶橙法对细胞进行染色。另外，采用同样方法观察第3组中下部细胞培养孔中NIH-3T3细胞的生长状况(图8f)。
[0066] 对照组：(1)一些孔中单细胞已死亡，孔内没有增殖的细胞，如图8b所示；(2)少数的孔中有稀疏的细胞生长，增殖较慢，如图8c所示。
[0067] 非直接共培养组：(1)约10％的孔内单细胞已死亡，孔内没有增殖的细胞；(2)大多数孔内有大量的细胞成团增殖，如图8d所示；
[0068] 近程相互作用组：(1)极少数的孔内单细胞已死亡，孔内没有增殖的细胞；(2)绝大多数孔内有大量的细胞成团增殖，如图8e所示。
[0069] 以上结果显示，NIH-3T3细胞能够在本发明细胞培养装置的下部细胞培养孔中稳定贴壁并增殖，并作为饲养细胞促进上部细胞培养孔中HL-60细胞生长和增殖。以上结果还证实，与本领域常规的非直接共培养相比，本发明细胞培养装置下部细胞培养孔中的细胞能够更有效地对上部细胞培养孔中的细胞产生影响(即近程相互作用)。
