一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒

摘要

本发明提供一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒，所述试剂盒中包括红细胞裂解液和DNA提取液，且所述红细胞裂解液包含以下组分：4.5～5.5mmol/L的氯化钠、0.8～1.2%（v/v）的曲拉通100、300～340mmol/L的葡萄糖和0.008～0.012mol/L的三羟甲基氨基甲烷。本发明解决了现有全血核酸提取试剂盒的缺陷，提供一种操作快速简单、提取效率高、使用安全、制造成本低的人类全血白细胞中DNA快速提取试剂盒。应用该试剂盒，可以对用于PCR技术检测的临床全血样本白细胞中DNA进行快速提取，提取得到全血中的白细胞DNA和白细胞内病毒的DNA。

权利要求

1.一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒，所述试剂盒中包括红细胞裂解液和DNA提取液，所述红细胞裂解液包含以下组分：浓度为5mmol/L的氯化钠，浓度为1.0％(v/v)的曲拉通100，浓度为320mmol/L的葡萄糖，浓度为0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷，余量为无菌水，且使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值使得所述红细胞裂解液的pH值为8.0～8.4；

所述DNA提取液包含0.6～1.0mol/L的氯化钾，0.4～0.8mol/L的乙二胺四乙酸，

0.8～1.2％(m/v)的十二烷基硫酸钠，余量为无菌水，且使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值使得所述DNA提取液的pH值为8.0～8.4；或，所述DNA提取液包含莎梵婷0.01～

0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2％和乙醇0.05～1％。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述红细胞裂解液的pH值为8.2。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，在所述DNA提取液包含0.6～

1.0mol/L的氯化钾，0.4～0.8mol/L的乙二胺四乙酸，0.8～1.2％(m/v)的十二烷基硫酸钠，余量为无菌水时，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值使得所述DNA提取液的pH值为

8.2。

4.权利要求1～3中任意一项所述的试剂盒在荧光PCR检测技术中的应用。

说明书

一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒。

背景技术

[0002] 自PCR技术在上世纪八十年代问世以来，其在分子生物学相关领域的应用越来越广泛。尤其是近年来，随着人们对临床诊断精度灵敏度要求的提高，以及个体化医疗概念的提出和推广，PCR技术凭借其在临床诊断中快速、敏感、特异等优点，已经迅速广泛的应用到了临床诊疗，通过检测患者样本中的基因，从而帮助医生确定用药和治疗方案。

[0003] 而样本DNA提取是PCR技术运用的前提，人类外周血在人体内免疫反应及代谢中发挥着重要作用，可用于血液系统及其他众多系统疾病的分子监测，由于其在临床上取样简单易得，在临床诊断或研究中应用最为广泛。

[0004] 目前全血DNA提取方法主要有苯酚-氯仿法、离心柱法、磁珠法。其中苯酚-氯仿法操作复杂且含有大毒性的有机溶剂已少有使用；离心柱法仍然是目前使用最广泛的全血DNA提取方法，但其需要特殊的硅胶膜层析柱，且需要反复的离心清洗后才能洗脱获得DNA；磁珠法采用磁珠吸附、清洗洗脱获得DNA；这些方法操作过程中需要多次离心、换管、磁棒分离过程，操作复杂，提取时间较长，对操作要求较高，不利于临床诊疗或研究应用。

[0005] 目前国内外已有多种用于全血基因提取的试剂盒可以应用于临床。这些试剂盒所提供的全血DNA提取方法有很多缺点：如DNA提取过程复杂，样本处理耗时长；处理时，样本中的DNA存在不同程度的耗损，尤其对于高浓度样本，裂解不充分，富集不完全，造成DNA丢失而使样本定量偏低；处理步骤多，需要多次开盖换管、离心、漂洗多次，磁棒分离过程，易造成样本间交叉污染和环境气溶胶污染。提取过程需要多种仪器或特殊器材，制造成本较高，对操作要求高。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种人类全血DNA快速提取试剂盒及其从人类全血白细胞中提取DNA的方法，解决现有全血核酸提取试剂盒的缺陷，提供一种操作快速简单、提取效率高、使用安全、制造成本低的人类全血白细胞中DNA快速提取试剂盒。应用该试剂盒，可以对用于PCR技术检测的临床全血样本白细胞中DNA进行快速提取。

[0007] 因此，本发明提供一种人类全血白细胞中DNA提取试剂盒，所述试剂盒中包括红细胞裂解液和DNA提取液，且所述红细胞裂解液包含以下组分：4.5～5.5mmol/L的氯化钠、0.8～1.2%（v/v）的曲拉通100、300～340mmol/L的葡萄糖和0.008～0.012mol/L的三羟甲基氨基甲烷。

[0008] 优选的，在所述红细胞裂解液中，所述氯化钠的浓度为5mmol/L，所述曲拉通100的浓度为1.0%（v/v），所述葡萄糖的浓度为320mmol/L，所述三羟甲基氨基甲烷的浓度为0.01mol/L，余量为无菌水，且使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值使得所述红细胞裂解液的pH值为7.8～8.6，优选8.0～8.4，更优选8.2。

[0009] 在本发明一种具体实施方式中，所述DNA提取液包含0.6～1.0mol/L的氯化钾，0.4～0.8mol/L的乙二胺四乙酸，0.8～1.2%（m/v）的十二烷基硫酸钠，余量为无菌水，且使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值使得所述DNA提取液的pH值为7.8～8.6，优选8.0～
8.4，更优选8.2。

[0010] 在本发明的另一种具体实施方式中，所述DNA提取液包含莎梵婷（surfactin）0.01～0.5mmol/L，氯化钾20～300mmol/L，十二烷基磺酸钠0.01～2%和乙醇0.05～1%。

[0011] 本发明还提供一种如上所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤，步骤A，去除红细胞：向全血中加入红细胞裂解液，充分震荡混匀，得到混合物，对其进行离心分离，去上清，留下白色沉淀物；步骤B，提取白细胞中DNA：向步骤A中所得白色沉淀物中加入所述DNA提取液，用移液器吹打混匀，静置使白细胞充分裂解而释放出其中的DNA，得到用于PCR扩增的DNA溶液。

[0012] 在上述方法中，优选地，重复步骤A两次；即对步骤A中的白色沉淀物再加入红细胞裂解液，充分震荡混匀，使沉淀重新悬浮而得到混合液，对其进行离心分离，去上清，留下白色沉淀物。

[0013] 优选地，步骤A中全血体积在100微升以上，且全血与红细胞裂解液的体积比为1：1～5。优选步骤A中离心分离的转速为10000～13000转/分钟，离心分离的时间为1～
3分钟。

[0014] 优选地，步骤A中全血与步骤B中DNA提取液的体积比为1：0.25～1。

[0015] 本发明还提供一种如上所述的试剂盒在荧光PCR检测技术中的应用。

[0016] 本发明的试剂盒中含有独特的红细胞裂解液，其使得全血样本中的红细胞特异性裂解，分离出全血中的有核细胞；再在DNA提取液的作用下得到全血中的白细胞DNA和白细胞内病毒的DNA。通过使用本发明中的试剂盒，能极大地避免提取过程中DNA的损失，大大增加了全血DNA的提取效率；本发明使用较少的操作步骤，减少管间交叉污染和对环境的污染；本发明提取步骤简单，无需加热，仅需进行一次或两次离心去除上清液，再加入DNA提取液，即可完成整个提取，大大缩短了提取时间，有利于临床诊断工作效率的提高。本发明的试剂盒制造成本低廉，无需特殊物料或仪器，仅需离心机和移液器，使用安全。本发明能同时抑制Dnase和Rnase活性，且对后续实验不产生影响。本发明的提取效率高于常见全血DNA提取方法。

具体实施方式

[0017] 实施例1

[0018] 1、人类全血白细胞中DNA提取试剂盒及其中试剂的配制方法：

[0019] ①红细胞裂解液的配制：先在容量瓶中加入少量无菌水，称取并加入使浓度最终为5mmol/L的氯化钠，加入体积比最终为1%的曲拉通溶液，加入最终浓度为320mmol/L的葡萄糖，加入最终浓度为0.01mol/L的三羟甲基氨基甲烷；加入无菌水定容至所需体积，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至8.2；高压灭菌10分钟。

[0020] ②DNA提取液的配制：先在容量瓶中加入少量无菌水，称取并加入使浓度最终为0.8mol/L的氯化钾，加入最终浓度为0.6mol/L的乙二胺四乙酸，加入最终浓度为1%的十二烷基硫酸钠（质量体积比）；加入无菌水定容至所需体积，充分混匀溶解，使用氢氧化钠或盐