表皮生长因子重组乳酸菌及其应用

摘要

本发明提供了一种重组猪表皮生长因子的编码基因、含有所述编码基因的乳酸菌及其应用，属于生物基因工程领域。重组猪表皮生长因子是一种非常重要的多肽类生长因子，在维持动物肠道健康中发挥着非常重要的作用，但与大多基因工程兽药一样存在着生产量不足、价格昂贵、产品需纯化、给药困难等问题。为获取大量的重组猪表皮生长因子，本发明采用乳酸菌表达系统对密码子优化后的重组猪表皮生长因子基因进行异源表达，并利用上述重组乳酸菌作为活菌制剂或饲料添加剂以增强猪非特异性免疫力。

权利要求

1.一种编码重组猪表皮生长因子的基因，其特征在于，所述基因为如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

2.一种包含了如权利要求1所述编码重组猪表皮生长因子的基因的质粒。

3.如权利要求2所述的质粒，其特征在于，所述质粒为PCYT。

4.一种包含了如权利要求2所述的质粒的乳酸菌菌株。

5.如权利要求4所述的乳酸菌菌株，其特征在于，所述菌株为乳酸乳球菌。

6.如权利要求4所述的乳酸菌菌株，其特征在于，所述菌株为乳酸乳球菌NZ9000。

7.一种重组猪表皮生长因子的表达方法，包括如下步骤：

1)以权利要求4至6中任一项所述乳酸菌菌株接种培养，加入Nisin进行诱导表达；

2)收集重组猪表皮生长因子蛋白。

8.权利要求4至6中任一项所述的乳酸菌菌株在制备动物饲料中的新用途。

9.一种含有乳酸菌的动物饲料，其特征在于，所述乳酸菌为如权利要求4至6中任一项所述的乳酸菌菌株。

说明书

表皮生长因子重组乳酸菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种含有表皮生长因子的乳酸菌，以及经优化的表皮生长因子的编码基因及其蛋白在重组乳酸菌中表达方法和应用。

背景技术

[0002] 动物肠道不仅是动物体内最大的消化吸收器官，是所有营养物质最终的吸收场所，同时也是体内最大的免疫器官，仔猪肠道健康发育是快速生长与高成活率的生理基础。新生仔猪由于肠道处于快速发育之中，结构与功能不完善，养分的消化吸收与免疫屏障功能有很大的局限性，难以适应营养与环境的变化，增加了饲养的困难。仔猪哺乳期间，初乳和常乳中都含有高水平的、可促进肠道发育和成熟的生长因子，如谷氨酰胺、表皮生长因子、类胰岛素生长因子和多胺等，断奶后，这些因子消失，对肠细胞生长、分化及细胞功能的发育产生不良影响。

[0003] 表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)是一种非常重要的多肽类生长因子，在维持动物肠道健康中发挥着非常重要的作用。在肠道中，可以调节消化腺的分泌，刺激黏膜增生，影响营养物质的转运，而且在肠道组织的成熟、再生和修复以过程中都起重要的作用。猪表皮生长因子作为猪乳中含量较高的生长因子之一，它对初生仔猪胃肠道发育有着极其重要影响。早期断奶是缩短母猪生育周期的重要手段，而早期断奶导致的断奶应激是影响早期断奶仔猪生产性能的主要原因，通过在饲料中添加表皮生长因子可以缓解断奶应激。尽管猪表皮生长因子凭借其独特的理化特性以及显著的生理作用，作为饲料添加剂具有广阔的发展前景，但是目前生产的猪表皮生长因子都是从乳产品中获得或利用大肠杆菌表达系统表达所得，这两种途径都具有一定的局限性，从乳中分离猪表皮生长因子的量有限，很难满足市场需要，而利用大肠杆菌表达系统表达的猪表皮生长因子，由于宿主菌大肠杆菌的局限性不能直接作为饲料添加使用，存在着分离纯化的难题，增加了成本，很难满足市场需要。因此，开发出有效的、成本较低的猪表皮生长因子将进一步拓展其在生猪养殖和疾病防御方面的应用。

[0004] 乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是一类可发酵碳水化合物并产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌的统称。它们在自然界分布广泛，在工业、农业和医药行业等与人类生活密切相关的重要领域应用价值很高。乳酸菌在食品工业中应用广泛，是被公认为安全的（generally recognized as safe，GRAS）食品级微生物。乳酸菌是肠道益生菌，有多种生理功能，如控制肠内感染、抗肿瘤活性等，还能促进小肠局部细胞免疫和体液免疫。利用乳酸菌在肠胃道、泌尿、生殖系统或粘膜部位粘附存活且无病原性等特点，将其开发成为蛋白多肽类药物粘膜给药递呈载体的研究，受到了广泛的重视。因此，发明人尝试采用重组乳酸菌表达猪表皮生长因子，并利用重组乳酸菌作为猪表皮生长因子的药物呈递系统应用到生猪养殖和疾病预防领域。但是，发明人经过实验尝试直接以基因库猪表皮生长因子基因转入重组乳酸菌的方式表达猪表皮生长因子，但是由于种属差异，猪表皮生长因子的表达量极低，因此需要寻找出更适合的猪表皮生长因子基因。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是：首先，是提供一种更适合于乳酸菌表达系统表达的猪表皮生长因子基因；其次，是开发出有效的、成本较低的表皮生长因子给药剂型或给药途径。

[0006] 因此，本发明的一个目的是提供一种编码重组猪表皮生长因子的基因，所述基因为：

[0007] 1）如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或

[0008] 2）与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性且编码重组猪表皮生长因子的核苷酸序列。

[0009] 本发明还提供了一种包含了上述所述编码重组猪表皮生长因子的基因的质粒。所述的质粒优选为原核表达质粒。最优选为PCYT质粒。

[0010] 本发明还提供了一种包含有上述所述质粒的乳酸菌菌株。所述的乳酸菌为乳酸乳球菌、植物乳酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌或发酵乳杆菌。优选地，所述菌株为乳酸乳球菌，更优选的所述菌株为乳酸乳球菌L.lactis NZ9000。

[0011] 本发明还提供了一种重组猪表皮生长因子的表达方法，包括如下步骤：

[0012] 1）以上述所述乳酸菌菌株接种培养，加入Nisin进行诱导表达；

[0013] 2）收集重组猪表皮生长因子蛋白。

[0014] 本发明还提供了上述所述乳酸菌菌株在制备食品及动物饲料中的新用途。

[0015] 本发明还提供了一种含有乳酸菌的动物饲料，所述乳酸菌为可表达细胞因子的重组乳酸菌。作为优选的所述乳酸菌为可表达猪表皮生长因子的重组乳酸菌。

[0016] 本发明的有益效果主要有：

[0017] 本发明利用乳酸菌作为肠道益生菌的优势，制备了表达猪表皮生长因子的重组乳酸菌。该重组乳酸菌甚至可以不经灭活处理直接添加到饲料中，猪进食后，该重组乳酸菌可在肠道内增殖，并稳定的表达表皮生长因子，有效促进生猪肠道发育，从而提高生猪生长速度，带来较好的经济效益。同时也在很大程度上降低了含有猪表皮生长因子饲料的制作成本。基于本发明理念，也完全可以加入含有其他来源的表皮生长因子的乳酸菌制备成相应来源动物饲料甚至是人用食品。

[0018] 本发明表达的猪表皮生长因子在猪肠道内原位表达，避免了传统表皮生长因子制备过程所需的复杂、繁琐、高成本的分离纯化过程，大大节约了表皮生长因子的制备成本。

[0019] 本发明提供的猪表皮生长因子可通过重组乳酸菌在肠道内表达而有效促进生猪肠道发育，提高生猪生长速度。这种表皮生长因子的递呈方式相对于成本低，更易接受，且无侵害性。同时，这样也可以尽量避免直接服用表皮生长因子原蛋白而造成的在消化系统中的损失。

[0020] 此外，乳酸菌自身作为一种常见的猪饲料添加剂，能够提高仔猪免疫力，促进肠道正常菌群的快速形成。这就从另外一方面抑制了有害菌群在肠道的繁殖，一定程度上预防了仔猪腹泻和其他胃肠道疾病的发生。

附图说明

[0021] 图1表示重组猪表皮生长因子优化前后核苷酸序列比较。

[0022] 其中，偶数行（即“原始序列”对应的行）为猪表皮生长因子天然基因核苷酸序列，即密码子优化前的序列；奇数行（即“优化序列”对应的行）为本发明的重组猪表皮生长因子的基因核苷酸序列，即密码子优化后的序列。

[0023] 图2-a、图2-b为重组猪表皮生长因子密码子优化前后在乳酸菌表达宿主中CAI指数。

[0024] 其中，图2-a表示猪表皮生长因子天然基因核苷酸序列在乳酸菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.48；图2-b表示优化后的本发明的重组猪表皮生长因子密码子在乳酸菌表达宿主中CAI指数经过程序计算为0.94。

[0025] 图3-a、图3-b为猪表皮生长因子密码子优化前后在乳酸菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图。

[0026] 其中，图3-a表示猪表皮生长因子天然基因核苷酸序列在乳酸菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，从图中可以看出：猪表皮生长因子天然基因核苷酸序列的低利用率密码子出现百分比为54%；图3-b表示优化后的本发明的重组猪表皮生长因子密码子在乳酸菌表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化后的本发明的重组猪表皮生长因子密码子序列的低利用率密码子出现百分比为1%。

[0027] 图4-a、图4-b为重组猪表皮生长因子密码子优化前后在乳酸菌表达宿主中平均GC碱基含量分布区域图。

[0028] 其中，图4-a表示猪表皮生长因子天然基因核苷酸序列在乳酸菌表达宿主中平均GC碱基含量为：52.93%；图4-b表示优化后的本发明的重组猪表皮生长因子密码子在乳酸菌表达宿主中平均GC碱基含量为：32.63%。

[0029] 图5-a、图5-b为重组猪表皮生长因子密码子优化前后mRNA的二级结构预测图。

[0030] 图5-a猪表皮生长因子天然基因mRNA的二级结构预测图，图5-b为密码子优化后的本发明的重组猪表皮生长因子mRNA的二级结构预测图。

[0031] 图6为重组猪表皮生长因子表达质粒构建过程图。

[0032] 图7为重组猪表皮生长因子基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。

[0033] 其中，泳道1为500bp DNA Ladder；泳道2为两端含有Nsi I和Xho I酶切位点的重组猪表皮生长因子基因PCR产物。

[0034] 图8为表达载体PCYT-poEGF的酶切鉴定图。

[0035] 其中，泳道1为500bp DNA Ladder；泳道2为Nsi I和Xho I双酶切PCYT-poEGF载体的电泳鉴定图。

[0036] 图9为重组猪表皮生长因子促BALB/3T3细胞增殖的活性检测（MTT法）。实验结果显示，与阴性对照相比，本发明表达的猪表皮生长因子可明显促进BALB/3T3细胞增殖。

具体实施方式

[0037] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，应理解，引用实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0038] 实施例1重组猪表皮生长因子的基因优化设计

[0039] 发明人根据GenBank已公开的猪表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）的cDNA序列(GenBank登录号：NP_999185.1)，对该基因进行密码子优化后得到本发明的重组猪表皮生长因子基因，如SEQ ID No：1所示。下面是对猪表皮生长因子基因进行密码子优化，优化前后各参数对比如下：

[0040] 1.密码子适应指数（Codon Adaptation Index，CAI）

[0041] 由图2-a可知，密码子没有优化前，猪表皮生长因子基因在乳酸菌中密码子适应指数（CAI）为0.48。由图2-b可知，通过密码子优化后，使得本发明的猪表皮生长因子基因在乳酸菌中CAI指数为0.94。通常CAI=1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差，因此可以看出经过了密码子优化后得到的基因序列可以提高猪表皮生长因子基因在乳酸菌中的表达水平。

[0042] 2.最优密码子使用频率（Frequency of Optimal Codons，FOP）

[0043] 由图3-a可知，基于乳酸菌表达载体，密码子没有优化前，猪表皮生长因子基因序列的低利用率密码子出现百分比为54%。这条未进行优化的基因含有串联稀有密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，通过密码子优化后，本发明的猪表皮生长因子基因在乳酸菌系统中出现低利用率密码子的频率为1%。

[0044] 3.GC碱基含量（GC curve）

[0045] GC含量理想分布区域为30%-70%，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a、图4-b的猪表皮生长因子基因的GC碱基平均含量分布区域图对比可知，由图中显示猪表皮生长因子基因中在优化前GC碱基平均含量为52.93%，由图4-b中显示最终得到优化后重猪表皮生长因子基因的GC碱基平均含量为32.63%，更有利于猪表皮生长因子基因的表达。

[0046] 4.优化前后顺式作用元件情况如下：

[0047]顺式作用元件 优化后 优化前
结合位点(GGTAAG) 0 0
结合位点(GGTGAT) 0 0
PolyA(AATAAA) 0 0
PolyA(ATTAAA) 0 0
不稳定序列(ATTTA) 0 0
PolyT(TTTTTT) 0 0
PolyA(AAAAAAA) 0 1

[0048] 5.优化前后回文以及重复序列情况如下：

[0049]优化后 优化前
最大同向重复序列 None Size:8Distance:78Frequency:2
最大反向重复序列 None None
最大对向重复序列 None None

[0050] 6.mRNA的二级结构预测图

[0051] 在DNA转录成mRNA后，由于mRNA是单链线性分子，通过自身回折使得互补的碱基对相遇，通过氢键结合而成的发卡结构(Hairpin)。5’发卡结构可以在翻译起始阶段起调控作用。但是如果发卡结构很长，解链所需的能量很高，就有可能影响到翻译。所以需要表达的序列应该尽量避免长而且能量高的发卡结构。通过密码子优化后，由图5-a、图5-b猪表皮生长因子密码子优化前后mRNA的二级结构预测图可知，优化后的5’发卡结构和解链所需的能量更适于目的蛋白的表达。

[0052] 实施例2重组猪表皮生长因子基因的表达质粒构建

[0053] 将优化后的重组猪表皮生长因子全基因（如SEQ ID No：1所示）合成的片段，构建到pUC57质粒（购自南京金斯瑞科技有限公司）中，得到一种长期保存质粒，记为pUC57-poEGF质粒。以pUC57-poEGF质粒为模板，上、下游引物分别引入Nsi I和Xho I酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：

[0054] 上游引物：

[0055] P1：GCCATGCATTGAATTCTTATTCTG

[0056] 下游引物：

[0057] P2：GTTCTCGAGTTATCTAAGTTCCCAC

[0058] 反应总体积50μL，其中浓度为10μmol/L引物各加2.5μL，浓度为10mmol/L的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA polymerase（购自Theromo-Fisher scientific），2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5s、56℃30s、72℃15s，25个循环后，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示产物大小与预期大小（159bp）一致。（如图7所示）

[0059] 将得到的基因产物用DNA凝胶回收试剂盒（购自北京天根生化科技有限公司）纯化。纯化后，用Nsi I和Xho I（购自New England Biolabs公司）双酶切，用T4连接酶（购自New England Biolabs公司）连接到PCYT质粒（购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心）中，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自北京天根生化科技有限公司）中，在含有25μg/mL的氯霉素（购自Amersco公司）的LB固体培养基中37℃培养过夜。第二天筛选阳性克隆菌测序，提取质粒，酶切后电泳鉴定目标条带大小正确（如图8所示）。经测序，与预期序列完全一致，即得到重组猪表皮生长因子的表达质粒，记为PCYT-poEGF。

[0060] 实施例3乳酸乳球菌感受态的制备及转化

[0061] 1、乳酸乳球菌感受态细胞的制备

[0062] 将贮存L.lactics NZ9000甘油菌（购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心）接种于10mL GM17培养基（购自青岛海博生物），30℃过夜静置培养。将1mL过夜培养物接种于50mL含2.5%甘氨酸的SGM17培养基（购自青岛海博生物）中，30℃静置培养至OD600值为0.5左右，冰浴，用OSPS缓冲液（0.5M蔗糖、10%甘油）洗涤菌体，再用OSPS缓冲液重悬细胞，-70℃保存或直接使用。

[0063] 2、乳酸乳球菌的电转化

[0064] 将质粒PCYT-poEGF和乳酸乳球菌感受态细胞在电转化杯中混合，使用2500V（电容25μ，电阻200Ω）脉冲输出，电转化乳酸乳球菌。将转化后的菌体，加入预冷的SMG17MC（GM17+20mM CaCl2+2mM MgCl2），30℃静置孵育2h。洗涤细胞，涂布含氯霉素（7.5mg/mL）的GM17琼脂糖固体培养基。

[0065] 转化后涂布的平板上出现抗氯霉素的阳性克隆。将重组单菌落接种于含有氯霉素（终浓度7.5μg/mL）的液体GM17培养基中，30℃恒温静置培养过夜，再按1%的接种量转接到5mL新鲜的含氯霉素（终浓度7.5μg/mL）的液体GM17培养基中，Nisin（购自Sigma）诱导检测猪表皮生长因子的表达情况。

[0066] 实施例4重组猪表皮生长因子在乳酸菌中的表达和含量测定

[0067] 将构建好的乳酸乳球菌重组猪表皮生长因子表达菌株以1:100的接种量过夜培养，第二天取培养液按3:100接种，4h后加入50ng/mL的Nisin进行诱导表达，诱导5h后，将菌液于4℃4000rgm离心5min，用预冷的PBS缓冲液洗菌体3次；收集后的菌体置于冰上搅动20min。用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。

[0068] 重组猪表皮生长因子的含量用ELISA试剂盒（猪表皮生长因子试剂盒，购自北京冬歌生物科技有限公司）测定。测定方法按照试剂盒提供的标准步骤操作。通过检测，测得Nisin诱导表达组每克湿菌体表达EGF为1.2ug；而未加入Nisin诱导的对照组没有表达。

[0069] 实施例5乳酸菌表达重组猪表皮生长因子生物学活性测定

[0070] 本发明通过检测重组猪表皮生长因子对BALB/3T3细胞的增殖作用来测定其生物学活性。所用的细胞株为BALB/3T3细胞(小鼠的成纤维细胞,购自中科院上海细胞所)。BALB/3T3细胞按照50000个/孔的浓度在24孔板上培养。12h后，加入按实施例4方法制备的50uL待检测样品（PCYT-poEGF）或阴性对照（PCYT-NUC，其中NUC是乳酸菌的核酸蛋白酶基因，该研究中作为无关蛋白对照组，对照组样品的制备方法跟实施例4一致）。24h后，加入MTT（终浓度为500ug/ml,购自Sigma），继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加400uLDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，吸光值越大说明细胞活力越强，促增殖作用越明显。

[0071] 由图9可以看出，PCYT-poEGF能明显刺激BALB/3T3细胞的增殖，而阴性对照组（PCYT-NUC）增殖不明显。这说明，乳酸乳球菌表达的猪表皮生长因子具有生物学活性。本发明制备的表达猪表皮生长因子的乳酸菌制备工艺简单，不需要经过繁琐的分离纯化工艺，将重组乳酸菌以饲料添加剂的方式喂养生猪即可促进猪的肠道发育，从而增加生长速度，具有广阔的应用前景。