草莓轻型黄边病毒的快速检测试剂盒及方法转让专利
申请号 : CN201310731171.7
文献号 : CN103710463B
文献日 : 2015-05-20
发明人 : 尚巧霞 , 陈柳 , 崔高峰 , 祝宁 , 冉策 , 陈笑瑜 , 邢冬梅 , 韩成贵 , 魏艳敏 , 赵晓燕 , 杨瑞 , 刘正坪 , 张志勇
申请人 : 北京农学院
摘要 :
本发明公开了检测草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）的专用引物及其应用。检测草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。利用本发明引物进行检测，检测过程快速、灵敏、操作简便，不需要其他贵重仪器和试剂，特别适合种苗繁育、脱毒培养、田间调查时快速检测和生产基层技术人员掌握应用。
权利要求 :
1.检测草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus)的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
2.一种检测草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus)的试剂盒，包括权利要求1所述的专用引物。
3.权利要求1所述专用引物在制备检测草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus)的试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂盒在鉴定草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus)病毒病中的应用。
5.一种检测草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus)或检测草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus)病毒病感染的方法，包括如下步骤：(1)提取待测生物样本的基因组RNA；
(2)以步骤(1)的基因组RNA为模板，用权利要求1所述的专用引物进行逆转录环介导恒温扩增；
(3)根据步骤(2)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus)或者是否感染草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus)病害。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述逆转录环介导恒温扩增的反应程序为：
60℃45分钟，80℃10分钟。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述逆转录环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列4所示DNA的浓度均为1.0μM，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的浓度均为0.1μM。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述环介导恒温扩增的体系包括：1.0μM序列表的序列1所示DNA，1.0μM序列表的序列4所示DNA，0.1μM序列表的序列2所示DNA，0.1μM序列表的序列3所示DNA，10×Bst buffer，4mM MgSO4，1.6mM dNTPs，0.4M Betaine，2mM DTT，5U AMV Reverse Transcriptase，25U RNase Inhibitor，8U Bst DNA polymerase，DEPC ddH2O，扩增体系总体积为25μl。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述逆转录环介导恒温扩增产物的检测方法为下述1)或2)所述的方法：
1)扩增产物中加入0.1μl荧光染料SYBR green I，肉眼直接观察，染有草莓轻型黄边病毒的样本会有沉淀物形成并呈现黄绿色，无草莓轻型黄边病毒侵染的样本透明并呈橘红色；
2)常规电泳和紫外成像方法，感染有草莓轻型黄边病毒的样本能形成瀑布型条带。
说明书 :
草莓轻型黄边病毒的快速检测试剂盒及方法
技术领域
[0001] 本发明涉及草莓轻型黄边病毒的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及方法。
背景技术
[0002] 草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus，SMYEV)分类学上隶属弯曲病毒科（Flexiviridae）马铃薯X病毒属（Potexvirus），为单分子线形正义ssRNA病毒，长5966bp。病毒粒子弯曲线状，长约470-580nm，宽为13nm。SMYEV侵染寄主植物后，会存在于寄主植物的表皮和叶肉细胞中，主要通过多种蚜虫以持久性方式传播，病毒在介体中不能复制，也不能通过介体后代传递；嫁接可以传播，种子、花粉和植物间相互接触不传播。草莓轻型黄边病毒侵染智利草莓（Fragaria chiloensis）和凤梨草莓（Fragaria nilgerrensis）后通常无症状，侵染野草莓（Fragaria vesca）症状表现为小叶凹陷、叶缘褪绿、植株长势衰退。单独侵染时使草莓植株稍微矮化，但复合侵染时会引起叶片黄化或失绿，植株矮化，叶缘不规则上卷，叶脉下弯或全叶扭曲，严重影响植物光合作用，导致减产降低。
[0003] 草莓轻型黄边病毒在草莓各栽培区分布较广，危害较重。由于草莓轻型黄边病毒蚜虫传播等原因，病毒病害防治困难，因此，建立高效灵敏的检测技术，成为解决种苗检测、早期鉴定等问题的关键，为草莓栽培提供保障。草莓轻型黄边病毒的检测技术目前包括指示植物的小叶嫁接法、血清学方法和反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）等。小叶嫁接法、血清学方法周期长、灵敏度较低、较为费时费工，反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测病毒灵敏度高，但需要特殊的仪器和试剂，检测时间也较长，在农业生产单位和技术推广部门很难应用检测。
[0004] 逆转录环介导等温扩增技术检测病毒操作简便，不需要特殊的仪器和试剂，操作简单，可以在恒温条件下快速检测，不需要长时间的温度循环，不需要昂贵的PCR仪，尤其是反转录和扩增反应都能在恒定温度下同时进行，大大的降低了检测时间，并且成本较低。反应完成后，通过荧光染色可以直接观察，也减少了时间，不需要电泳和紫外成像观察检测结果。逆转录环介导等温扩增技术与其他病毒检测方法相比，快速、简便、灵敏，目前尚未有将逆转录环介导等温扩增技术在草莓轻型黄边病毒检测上的应用。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供检测草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）的专用引物以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）的快速分子检测试剂盒及方法。
[0006] 本发明所提供的检测草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
[0007] 本发明还提供一种检测草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）的试剂盒，包括所述的专用引物。
[0008] 本发明所述专用引物在制备检测草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围
[0009] 上述专用引物或试剂盒在鉴定草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）病毒病中的应用也是本发明的保护范围。
[0010] 本发明还保护一种检测草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）或检测草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）病害发生危害的方法，包括如下步骤：
[0011] （1）提取待测生物样本的基因组RNA；
[0012] （2）以步骤（1）的基因组RNA为模板，用所述的专用引物进行逆转录环介导恒温扩增；
[0013] （3）根据步骤（2）的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）或者是否感染草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）病害。
[0014] 所述逆转录环介导恒温扩增的反应程序为：60℃45分钟，80℃10分钟。
[0015] 所述逆转录环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列1所示DNA和序列表的序列4所示DNA的浓度均为1.0μM，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的浓度均为0.1μM。
[0016] 所述逆转录环介导恒温扩增的体系包括：1.0μM序列表的序列1所示DNA，1.0μM序列表的序列4所示DNA，0.1μM序列表的序列2所示DNA，0.1μM序列表的序列3所示DNA，10×Bst buffer，4mM MgSO4，1.6mM dNTPs，0.4M Betaine，2mM DTT，5U AMV Reverse Transcriptase，25U RNase Inhibitor，8U Bst DNA polymerase，DEPC ddH2O，扩增体系总体积为25μl。
[0017] 所述逆转录环介导恒温扩增产物的检测方法有两种：
[0018] 1.扩增产物中加入0.1μl荧光染料SYBR green I，肉眼直接观察，染有草莓轻型黄边病毒的样本会有沉淀物形成并呈现黄绿色，无草莓轻型黄边病毒侵染的样本透明并呈橘红色；
[0019] 2.常规电泳和紫外成像方法，感染有草莓轻型黄边病毒的样本能形成瀑布型条带。
[0020] 本发明基于逆转录环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）的草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）检测试剂盒及方法，该试剂盒根据草莓轻型黄边病毒的基因保守区域设计了四个特异性引物，可以特异性的检测样品中草莓轻型黄边病毒。利用本发明试剂盒进行检测，检测过程快速、灵敏、操作简便，不需要其他贵重仪器和试剂，特别适合种苗繁育、脱毒培养、田间调查时快速检测和生产基层技术人员掌握应用。
附图说明
[0021] 图1为SMYEV RT-LAMP各反应温度扩增产物电泳检测；图1中，泳道M.DNA Marker AL2000；泳道1：60℃；泳道2：61℃；泳道3：62℃；泳道4：63℃；泳道5：64℃；泳道6：65℃。
[0022] 图2为SMYEV RT-LAMP不同反应时间扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：30min；泳道2：45min；泳道3：60min；泳道4：75min。
[0023] 图3为SMYEV RT-LAMP引物FIP/BIP不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M.DNA Marker AL2000；泳道1：1.0μM；泳道2：1.2μM；泳道3：1.4μM；泳道4：1.6μM；泳道5：1.8μM。
[0024] 图4为SMYEV RT-LAMP引物F3/B3不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：0.10μM；泳道2：0.15μM；泳道3：0.20μM；泳道4：0.25μM；
泳道5：0.30μM。
泳道5：0.30μM。
[0025] 图5为SMYEV RT-LAMP Mg2+不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：2mM；泳道2：4mM；泳道3：6mM；泳道4：8mM；5：10mM。
[0026] 图6为SMYEV RT-LAMP dNTPs不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：0.2mM；泳道2：0.4mM；泳道3.0.8mM；泳道4：1.2mM；泳道5：1.6mM；泳道6：2.0mM。
[0027] 图7为SMYEV RT-LAMP betaine不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：0.2M；泳道2：0.4M；泳道3：0.8M；泳道4：1.0M；泳道5：1.2M；泳道6：1.4M。
[0028] 图8为SMYEV RT-LAMP DTT浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：2.0mM；泳道2：2.4mM；泳道3：2.8mM；泳道4：3.2mM；泳道5：3.6mM；泳道6：4.0mM。
[0029] 图9为SMYEV RT-PCR灵敏度测定；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：提1 2 3 4 5 6 7
取的RNA原液做模板；泳道2-8依次为RNA原液稀释10、10、10、10、10、10和10 倍获得的稀释液。
取的RNA原液做模板；泳道2-8依次为RNA原液稀释10、10、10、10、10、10和10 倍获得的稀释液。
[0030] 图10为SMYEV RT-LAMP灵敏度测定；其中，泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：1 2 3 4 5 6 7
提取的RNA原液做模板；泳道2-8依次为RNA原液稀释10、10、10、10、10、10和10 倍获得的稀释液。
提取的RNA原液做模板；泳道2-8依次为RNA原液稀释10、10、10、10、10、10和10 倍获得的稀释液。
[0031] 图11为SMYEV RT-LAMP的特异性测定；其中，（a）为LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；（b）为LAMP产物加入SYBR green I检测；泳道M：DNA Marker AL2000；泳道1：健康植株样品RNA；泳道2-5依次为含SMoV,SVBV,SMYEV和SCV的植株样品RNA。
具体实施方式
[0032] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。
[0033] 实施例1、草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）逆转录环介导引物及其应用
[0034] 一、草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）逆转录环介导引物的获得
[0035] 根据美国NCBI中的GenBank发布的草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）RNA的cDNA序列（序列登录号分别为AJ577339、AJ577359、D12515、D12517、EF143351、EU107085和EU107086），通过软件DNAMAN7.0进行同源性分析后找出草莓轻型黄边病毒（Strawberry mild yellow edge virus）外壳蛋白基因3，端保守序列作为模板，使用在线软件Primer3Input（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/）设计RT-LAMP引物，并对设计的引物进行筛选，序列调整，验证，最终获得一组敏感性和特异性很高的LAMP引物。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下表1；
[0036] 表1SMYEV RT-LAMP检测引物组
[0037]引物 序列5’-3’
1 SMYEV-FIP CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT（序列表中序列1）
2 SMYEV-F3 TCAAGTTGGTGACCCTTTCC（序列表中序列2）
3 SMYEV-B3 CGAGGAACCAATGTCGTAGC（序列表中序列3）
4 SMYEV-BIP GCTTTGTCGGGGATCCTGGGAAGGCTAAGTCGAAGAGACC（序列表中序列4）[0038] 二、检测方法的优化：
1 SMYEV-FIP CAGATCAGCGACAATTTGGACTCCTGAGGAACTTGCTGCT（序列表中序列1）
2 SMYEV-F3 TCAAGTTGGTGACCCTTTCC（序列表中序列2）
3 SMYEV-B3 CGAGGAACCAATGTCGTAGC（序列表中序列3）
4 SMYEV-BIP GCTTTGTCGGGGATCCTGGGAAGGCTAAGTCGAAGAGACC（序列表中序列4）[0038] 二、检测方法的优化：
[0039] 本发明还对RT-LAMP检测方法的各种条件进行了优化，在反应条件优化的方法中使用的待测样品取自北京市昌平地区草莓种植园，田间样本表现为植株矮化、叶片黄化和畸形等症状，采集有典型症状的叶片，称取约0.2克新鲜叶片，采用植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，货号：RN09）提取待测样品中的RNA，经RT-PCR检测和PCR产物的序列测定，确定含有草莓轻型黄边病毒的样本，将提取的RNA置于-80℃保存备用。
[0040] RT-LAMP反应条件优化具体方法如下所述：
[0041] 1、最适温度的选择
[0042] RT-LAMP试剂盒中反应溶液的配置：10μM SMYEV-FIP和10μM SMYEV-BIP各2.5μl，10μM SMYEV-F3和10μM SMYEV-B3各0.25μl（由上海生工生物技术有限公司合成），10×Bst buffer2.5μl（北京天恩泽基因科技公司，货号：004147），50mM MgSO42μl，
10mM dNTPs4μl（北京艾德莱生物科技公司，货号：241639AH），12.5M Betaine0.8μl（上海生工生物工程有限公司，货号：BK185-100g），0.2M DTT0.25μl（上海生工生物工程有限公司，货号：D515939），10U/μl AMV Reverse Transcriptase0.5μl（promega公司，货号：
0000033974），40U/μl RNase Inhibitor0.625μl（北京百泰克生物技术有限公司，货号：
RP5601），8U Bst DNA polymerase1μl（北京天恩泽基因科技公司，货号：004192），感染草莓轻型黄边病毒的草莓叶片中提取的RNA1μl，加入DEPC ddH2O（Solarbio公司，货号：R1600）至总体积25μl。
10mM dNTPs4μl（北京艾德莱生物科技公司，货号：241639AH），12.5M Betaine0.8μl（上海生工生物工程有限公司，货号：BK185-100g），0.2M DTT0.25μl（上海生工生物工程有限公司，货号：D515939），10U/μl AMV Reverse Transcriptase0.5μl（promega公司，货号：
0000033974），40U/μl RNase Inhibitor0.625μl（北京百泰克生物技术有限公司，货号：
RP5601），8U Bst DNA polymerase1μl（北京天恩泽基因科技公司，货号：004192），感染草莓轻型黄边病毒的草莓叶片中提取的RNA1μl，加入DEPC ddH2O（Solarbio公司，货号：R1600）至总体积25μl。
[0043] 设置60、61、62、63、64、65℃共6个反应温度梯度，选出最适的温度。检测体系同前，温度不同，不同温度下反应时间均为45分钟，80℃热激10小时。
[0044] 检测结果：取5μl RT-LAMP扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
[0045] 检测结果显示不同温度反应条件下均能形成瀑布型条带，不同温度间的结果差异不显著（图1），因此确定其中最低的温度60℃为检测温度。
[0046] 2、最适时间的选择
[0047] 选择最适温度60℃，设置30、45、60、75分钟4个不同的反应时间，之后80℃热激10分钟。其余步骤同步骤1。检测结果显示不同反应时间，检测电泳条带有一定的差异，反应时间45分钟后，瀑布型条带最亮最清晰（图2），确定最适检测时间为45分钟。
[0048] 3、选择最适引物浓度
[0049] 将引物SMYEV-FIP/SMYEV-BIP终浓度设置1.0、1.2、1.4、1.6、1.8μM等5个不同处理，引物SMYEV-F3/SMYEV-B3终浓度暂定为0.1μM，其他条件不变，同步骤1，反应温度为60℃，反应时间45分钟，之后80℃热激10分钟。经电泳检测结果显示，待测引物SMYEV-FIP/SMYEV-BIP的不同终浓度均能形成清晰的瀑布型条带，不同浓度的引物对检测结果没有显著的影响（图3），因此选择其中最低的引物浓度，即SMYEV-FIP/SMYEV-BIP终浓度为1.0μM。
[0050] 将SMYEV-F3/SMYEV-B3终浓度设置0.1、0.15、0.2、0.25、0.3μM等5个不同处理，其他条件不变，同步骤1，反应温度为60℃，反应时间45分钟，之后80℃热激10分钟。经电泳检测结果显示，待测引物SMYEV-F3/SMYEV-B3的不同终浓度均能形成清晰的瀑布型条带（图4），本次测定的不同引物浓度对检测结果的影响差异较小，因此，最终确定引物SMYEV-F3/SMYEV-B3的检测浓度为0.1μM。
[0051] 4、Mg2+浓度的确定
[0052] 设置Mg2+终浓度2、4、6、8、10mM等5个不同处理，其他条件不变，同步骤1，反应2+
温度60℃，反应时间45分钟；之后80℃热激10分钟。检测结果显示不同浓度的Mg 对反
2+
应结果影响的差异较明显，Mg 终浓度为4mM时能够形成清晰的瀑布型条带（图5），因此，
2+
RT-LAMP检测时采用Mg 终浓度为4mM。
温度60℃，反应时间45分钟；之后80℃热激10分钟。检测结果显示不同浓度的Mg 对反
2+
应结果影响的差异较明显，Mg 终浓度为4mM时能够形成清晰的瀑布型条带（图5），因此，
2+
RT-LAMP检测时采用Mg 终浓度为4mM。
[0053] 5、dNTPs浓度的确定
[0054] 设置dNTPs终浓度0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mM等6个不同浓度处理，其他条件不变，同步骤1，反应温度60℃，反应时间45分钟，之后80℃热激10分钟。检测结果显示不同浓度的dNTPs对反应结果影响较明显，当采用1.6mM及以上浓度的dNTPs时，瀑布型条带均清晰（图6），因此，确定检测时最适dNTPs终浓度为1.6mM。
[0055] 6、Betaine浓度的确定
[0056] 设置Betaine终浓度0.2、0.4、0.8、1.0、1.2、1.4M等6个不同处理，其他条件不变，同步骤1，反应温度60℃，反应时间45分钟，之后80℃热激10分钟。检测结果显示不同浓度的Betaine对反应结果的产生有一定影响，当Betaine终浓度为0.4M及以上时，瀑布型条带较亮且呈明显的阶梯状（图7），因此，采用RT-LAMP检测时Betaine终浓度为0.4M。
[0057] 7、DTT浓度的确定
[0058] 设置DTT终浓度2.0、2.4、2.8、3.2、3.6、4.0mM等6个不同浓度处理，其他条件不变，同步骤1，反应温度60℃，反应时间45分钟，之后80℃热激10分钟。检测结果显示本次测定的不同浓度DTT对反应结果影响不明显，不同浓度的DTT均能形成瀑布型的清晰条带（图8），因此，确定检测时最适dNTPs终浓度为2mM。
[0059] 通过上述筛选实验，最终确定，草莓轻型黄边病毒基于逆转录环介导等温扩增技术的检测试剂盒的主要步骤：
[0060] 采用植物RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司，货号：RN09）提取待测样品中的RNA；
[0061] RT-LAMP试剂盒中反应溶液的配置：10μM SMYEV-FIP和10μM SMYEV-BIP各 2.5μl，10μM SMYEV-F3 和 10μM SMYEV-B3 各 0.25μl，10×Bst buffer2.5μl，50mM MgSO42μl，10mM dNTPs4μl，12.5M Betaine0.8μl，0.2M DTT0.25μl，10U/μl AMV Reverse Transcriptase0.5μl，40U/μl RNase Inhibitor0.625μl，8U Bst DNA polymerase1μl，提取的RNA1μl，加入DEPC ddH2O至总体积25μl；60℃恒温反应45分钟；
其中，SMYEV-FIP为序列表中序列1所示的DNA分子，SMYEV-BIP为序列表中序列4所示的DNA分子，SMYEV-F3为序列表中序列2的DNA分子；SMYEV-B3为序列表中序列3的DNA分子。
其中，SMYEV-FIP为序列表中序列1所示的DNA分子，SMYEV-BIP为序列表中序列4所示的DNA分子，SMYEV-F3为序列表中序列2的DNA分子；SMYEV-B3为序列表中序列3的DNA分子。
[0062] 检测结果：扩增产物中加入0.1μl荧光染料SYBR green I后，直接肉眼观察检测，染有草莓轻型黄边病毒的样本会呈现黄绿色，无草莓轻型黄边病毒侵染的样本呈橘红色；或者采用常规电泳和紫外成像方法进行检测，感染有草莓轻型黄边病毒的样本能够形成瀑布型条带。
[0063] 实施例2、本发明试剂盒及其应用效果监测
[0064] 一、RT-LAMP方法灵敏度检测：
[0065] 按照实施例1确定的最优的技术方案进行RT-LAMP和RT-PCR检测灵敏度的测定，检测的对象是上述反应条件优化过程中选用的感染草莓轻型黄边病毒的草莓叶片中提取的RNA得到RNA原液。
[0066] 将同样的RNA原液进行10倍梯度稀释后得到101、102、103、104、105、106和107倍稀释的稀释液，分别以不同稀释液作为模板进行RT-LAMP和RT-PCR扩增。
[0067] RT-PCR扩增反应主要有两步，第一步为反转录反应：10μM pd(N)90.5μl（Takara公司，货号：D3802），10μM Oligo dT180.5μl（Takara公司，货号：D511），10mM dNTP0.5μl，RNA10μl，加入DEPC ddH2O（Solarbio公司，货号：R1600）至总体积15μl，65℃5分钟，冰浴5分钟；随后加入5×RT Buffer4μl（Promega公司，货号：M531A23713934），Go Script TMReverse Transcriptase0.5μl（Promega公司，货号：A501c0000048754），Recombinant R
RNasin Rinbonuclease Inhibitor（Promega公司，货号：N251A0000053050）0.5μl，37℃反转录2.5小时，72℃15分钟。第二步为PCR扩增反应，采用2004年Thompson等报道的引物YT1/Y2（YT1CCGCTGCAGTTGTAGGGTA；Y2CATGGCACTCATTGGAGCTGGG），由上海生工生物技术有限公司合成，阳性样品能够扩增出的片段为861bp。PCR反应体系为2×Taq PCR Mix12.5μl（北京艾德莱生物科技有限公司，货号：242128AX），10μM引物YT11μl，10μM引物Y21μl，取cDNA模板2μl，加入DEPC ddH2O至总体积25μl。反应程序：94℃2分钟，
94℃30秒，60℃40秒，72℃60秒，35个循环，72℃延伸5分钟。
RNasin Rinbonuclease Inhibitor（Promega公司，货号：N251A0000053050）0.5μl，37℃反转录2.5小时，72℃15分钟。第二步为PCR扩增反应，采用2004年Thompson等报道的引物YT1/Y2（YT1CCGCTGCAGTTGTAGGGTA；Y2CATGGCACTCATTGGAGCTGGG），由上海生工生物技术有限公司合成，阳性样品能够扩增出的片段为861bp。PCR反应体系为2×Taq PCR Mix12.5μl（北京艾德莱生物科技有限公司，货号：242128AX），10μM引物YT11μl，10μM引物Y21μl，取cDNA模板2μl，加入DEPC ddH2O至总体积25μl。反应程序：94℃2分钟，
94℃30秒，60℃40秒，72℃60秒，35个循环，72℃延伸5分钟。
[0068] 结果显示，RNA原液、101、102倍稀释的稀释液进行RT-PCR反应后，可以检测到显3
著的条带，10倍稀释的稀释液作为模板的反应物，RT-PCR产物的电泳检测条带不清晰，尤
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其是10、10、10和10 倍稀释的稀释液作为模板的反应物，电泳检测没有可见条带（图9）。
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而进行RT-LAMP检测时，RNA原液、10、10、10、10和10 倍稀释的稀释液作为模板进行RT-LAMP检测后，均可以看到显著、清晰的条带（图10）。因此，RT-LAMP检测草莓叶片样本中的SMYEV比RT-PCR方法检测的灵敏度至少高100倍以上，并且RT-LAMP比RT-PCR节省时间，非常有利于草莓轻型黄边病毒的检测应用。
著的条带，10倍稀释的稀释液作为模板的反应物，RT-PCR产物的电泳检测条带不清晰，尤
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其是10、10、10和10 倍稀释的稀释液作为模板的反应物，电泳检测没有可见条带（图9）。
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而进行RT-LAMP检测时，RNA原液、10、10、10、10和10 倍稀释的稀释液作为模板进行RT-LAMP检测后，均可以看到显著、清晰的条带（图10）。因此，RT-LAMP检测草莓叶片样本中的SMYEV比RT-PCR方法检测的灵敏度至少高100倍以上，并且RT-LAMP比RT-PCR节省时间，非常有利于草莓轻型黄边病毒的检测应用。
[0069] 进行三次重复实验，结果一致。
[0070] 二、RT-LAMP方法特异性检测：
[0071] 选用感染草莓轻型黄边病毒(Strawberry mild yellow edge virus,SMYEV)的草莓叶片中提取的RNA和健康草莓植株叶片中提取的RNA作为阴性对照以及分别含有草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus,SVBV）、草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus,SMoV)、草莓皱缩病毒（Strawberry crinkle virus,SCV）等3种其他草莓的重要病毒的RNA进行本发明RT-LAMP检测体系的特异性检测（含有不同草莓病毒样品采集于北京市草莓种植园）。注：其中草莓镶脉病毒属于花椰菜花叶病毒属，为DNA病毒，但在感染病毒的植物细胞内存在前体RNA，可以利用RT-PCR进行检测（2007年杨洪一等报道）。
[0072] 检测体系采用优化后的RT-LAMP检测体系，加入三种其他病毒的RNA和健康草莓植株叶片中提取的RNA各1μl。其他试剂种类、用量和反应条件等均与优化后的本发明试剂盒一致。试验结果显示仅有SMYEV的RNA能够扩增出瀑布型条带，本RT-LAMP检测体系有很好的特异性（图11中a）。并且将反应产物中各加入0.1μl SYBR green I（Solarbio公司，货号：SR4110），可以肉眼观察到染有草莓轻型黄边病毒的样本有沉淀物形成且呈现黄绿色，其他样本均呈橘红色（图11中b）。