胰癌的治疗和/或预防用药物组合物

摘要

本发明涉及用于胰癌的治疗和/或预防的药物组合物，所述药物组合物包含与CAPRIN‑1蛋白质或含有7－12个以上的连续氨基酸残基的其片段具有免疫学反应性的抗体或抗体片段作为有效成分。

权利要求

1.与CAPRIN-1蛋白质的片段具有免疫学反应性的抗体或抗体片段的用途，用于制备治疗和/或预防胰癌的药物组合物，其中所述CAPRIN-1蛋白质的片段是由序列号273、274、

275、266、267、268、269、270或272所示的氨基酸序列组成的多肽。

2.权利要求1所述的用途，其中所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

3.权利要求1所述的用途，其中所述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或多特异性抗体。

4.权利要求1－3中任一项所述的用途，其中所述抗体或抗体片段是任一以下的(a)－(y)：(a)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号37、38和39的互补决定区(CDR)，所述轻链可变区包含序列号41、42和43的CDR；

(b)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号47、48和49的CDR，所述轻链可变区包含序列号51、52和53的CDR；

(c)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号57、58和59的CDR，所述轻链可变区包含序列号61、62和63的CDR；

(d)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号67、68和69的CDR，所述轻链可变区包含序列号71、72和73的CDR；

(e)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号77、78和79的CDR，所述轻链可变区包含序列号81、82和83的CDR；

(f)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号87、88和89的CDR，所述轻链可变区包含序列号91、92和93的CDR；

(g)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号97、98和99的CDR，所述轻链可变区包含序列号101、

102和103的CDR；

(h)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号107、108和109的CDR，所述轻链可变区包含序列号

111、112和113的CDR；

(i)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号117、118和119的CDR，所述轻链可变区包含序列号

121、122和123的CDR；

(j)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号127、128和129的CDR，所述轻链可变区包含序列号

121、122和123的CDR；

(k)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号132、133和134的CDR，所述轻链可变区包含序列号

136、137和138的CDR；

(l)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号142、143和144的CDR，所述轻链可变区包含序列号

146、147和148的CDR；

(m)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号142、143和144的CDR，所述轻链可变区包含序列号

152、153和154的CDR；

(n)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号157、158和159的CDR，所述轻链可变区包含序列号

161、162和163的CDR；

(o)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号167、168和169的CDR，所述轻链可变区包含序列号

171、172和173的CDR；

(p)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号167、168和169的CDR，所述轻链可变区包含序列号

177、178和179的CDR；

(q)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号167、168和169的CDR，所述轻链可变区包含序列号

182、183和184的CDR；

(r)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号167、168和169的CDR，所述轻链可变区包含序列号

187、188和189的CDR；

(s)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号167、168和169的CDR，所述轻链可变区包含序列号

192、193和194的CDR；

(t)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号197、198和199的CDR，所述轻链可变区包含序列号

201、202和203的CDR；

(u)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号207、208和209的CDR，所述轻链可变区包含序列号

211、212和213的CDR；

(v)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号217、218和219的CDR，所述轻链可变区包含序列号

221、222和223的CDR；

(w)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号227、228和229的CDR，所述轻链可变区包含序列号

231、232和233的CDR；

(x)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号237、238和239的CDR，所述轻链可变区包含序列号

241、242和243的CDR；

(y)包含重链可变区和轻链可变区的且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体或抗体片段，所述重链可变区包含序列号247、248和249的CDR，所述轻链可变区包含序列号

251、252和253的CDR。

5.权利要求1－3中任一项所述的用途，其中所述抗体或抗体片段与抗肿瘤剂缀合。

6.权利要求4所述的用途，其中所述抗体或抗体片段与抗肿瘤剂缀合。

7.包含权利要求1－4中任一项所述的药物组合物与含有抗肿瘤剂的药物组合物的组合的用途，用于制备治疗和/或预防胰癌的组合的药物。

8.权利要求1－6中任一项所述的药物组合物或权利要求7所述的组合的药物的用途，用于制备治疗和/或预防胰癌的医药。

说明书

胰癌的治疗和/或预防用药物组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及针对CAPRIN-1的抗体或其片段作为胰癌的治疗剂和/或预防剂等的新医药用途。

背景技术

[0002] 癌是占全部死亡原因的第一位的疾病，当前所实施的治疗主要是手术疗法，其与放射线疗法和化学疗法联合实施。尽管近年来开发了新的手术法和发现了新的抗癌剂，但是现状是，除了一部分癌之外，癌的治疗成绩仍未改善。近年来，随着分子生物学和癌免疫学的发展，已经鉴定到了对癌特异性反应的抗体、细胞毒性T细胞所识别的癌抗原、编码癌抗原的基因等，提高了人们对以癌抗原为靶的特异性癌治疗法的期待（非专利文献1）。

[0003] 在癌治疗法中，为了减轻副作用，需要作为其抗原被识别的肽、多肽或蛋白质基本上不存在于正常细胞、但特异地存在于癌细胞。1991年，比利时Ludwig研究所的Boon等人通过使用自身癌细胞株和癌反应性T细胞的cDNA表达克隆法，分离了CD8阳性T细胞识别的人黑素瘤抗原MAGE1（非专利文献2）。此后，报导了采用基因表达克隆法鉴定由抗体识别的肿瘤抗原的SEREX(通过重组表达克隆法对抗原的血清学鉴定)法，其中所述的抗体是癌患者身体内对自身癌反应而产生的抗体（非专利文献3和专利文献1），根据该方法分离了若干在正常细胞几乎不表达的、癌特异性表达的癌抗原（非专利文献4－9）。进一步地，实施了使用以所述癌抗原的一部分为靶的、对癌抗原特异性反应的免疫细胞的细胞疗法、以及包含癌抗原的疫苗等的癌特异性免疫疗法的临床试验。

[0004] 另一方面，近年来以癌细胞上的抗原蛋白质为靶的、用于治疗癌的各种抗体药物大量上市。关注到作为癌特异性治疗药获得了一定的药效，但是成为癌特异性治疗药的靶的大部分抗原蛋白质在正常细胞中也有表达，抗体施与的结果是不仅伤害到癌细胞，而且还伤害到表达抗原的正常细胞，其结果产生的副作用成为问题。因此，如果能够鉴定到在癌细胞表面特异性表达的癌抗原，将以其为靶的抗体作为药物使用的话，能够期待通过较少副作用的抗体药物进行治疗成为可能。作为本领域技术人员的技术常识，已知胰癌的治疗是困难的，至今尚没有开发出对胰癌具有足够效果的有效药物。

[0005] 细胞质和增殖相关蛋白1(Cytoplasmic-and proliferation-associated protein1，CAPRIN-1)是已知在休止期的正常细胞发生活化和/或细胞分裂时表达，并在细胞内与RNA形成细胞内应激颗粒而参与mRNA的运输、翻译的控制等的细胞内蛋白质，由于发现在乳癌细胞等的癌细胞表面特异性表达，开展了将其用于作为癌治疗的抗体药物的靶的研究（专利文献2）。但是，专利文献2没有认识到CAPRIN-1在胰癌细胞上表达，也没有教导CAPRIN-1能够成为胰癌的抗原蛋白质。

[0006] 现有技术文献

[0007] 专利文献

[0008] 专利文献1：美国专利第5698396号

[0009] 专利文献2：国际公开：WO2010/016526

[0010] 非专利文献

[0011] 非专利文献1：秋吉毅，“癌和化学疗法”，1997年，第24卷，p551－519（癌和化学疗法社，日本）

[0012] 非专利文献2：Bruggen P.等人，Science，254：1643－1647（1991）

[0013] 非专利文献3：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92：11810－11813（1995）

[0014] 非专利文献4：Int.J.Cancer，72：965－971（1997）

[0015] 非专利文献5：Cancer Res.，58：1034－1041（1998）

[0016] 非专利文献6：Int.J.Cancer，29：652－658（1998）

[0017] 非专利文献7：Int.J.Oncol.，14：703－708（1999）

[0018] 非专利文献8：Cancer Res.，56：4766－4772（1996）

[0019] 非专利文献9：Hum.Mol.Genet.，6：33－39（1997）

[0020] 发明概述

[0021] 发明要解决的课题

[0022] 本发明的目的是鉴定在胰癌细胞的表面特异性地表达的癌抗原蛋白质，提供以该癌抗原蛋白质作为靶的抗体作为胰癌的治疗剂和/或预防剂的用途。

[0023] 用于解决课题的手段

[0024] 本发明人等进行了努力研究，结果发现：使用源于狗的睾丸组织的cDNA文库和患乳癌的狗的血清，通过SEREX法，获得了编码与在源于荷癌生物体的血清中存在的抗体特异性结合的蛋白质的cDNA，以获得的基因和该基因的人、牛、马、小鼠、鸡同源性基因为基础，制作了具有序列号2～30中偶数的序列号所示的氨基酸序列的CAPRIN-1和针对这些CAPRIN-1的多种抗体。并且发现CAPRIN-1蛋白质的一部分在这些胰癌细胞的细胞表面特异性表达，发现针对CAPRIN-1的抗体破坏表达CAPRIN-1的胰癌细胞，从而完成了本发明。

[0025] 因此，本发明具有以下特征。

[0026] 本发明提供了用于胰癌的治疗和/或预防的药物组合物，特征在于包含抗体或其片段作为有效成分，所述抗体或其片段与CAPRIN-1蛋白质或包含7－12个以上的连续氨基酸残基的其片段具有特异的免疫学反应性。

[0027] 在实施方案中，CAPRIN-1蛋白质具有序列号2～30中偶数的序列号所示的氨基酸序列、或具有与该氨基酸序列80％以上、优选地85％以上、更优选地90％以上、进一步优选地95％以上、进一步更优选地97-99％以上序列同一性的氨基酸序列。

[0028] 在其它实施方案中，上述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

[0029] 在其它实施方案中，上述抗体是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、或多特异性抗体。

[0030] 在其它实施方案中，上述抗体是与具有序列号273或序列号266或序列号270或序列号272或序列号269所示氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80％以上、优选地85％以上、更优选地90％以上、进一步优选地95％以上、进一步更优选地97-99％以上序列同一性的氨基酸序列的多肽或其片段具有免疫学反应性的抗体。

[0031] 在其它实施方案中，上述抗体是任一以下（a）-（y）的抗体，且与CAPRIN-1蛋白质具有免疫学反应性的抗体；或者特征在于包含该抗体作为有效成分的用于胰癌的治疗和/或预防的药物组合物。

[0032] （a）抗体，其包含含有序列号37、38和39的互补决定区（CDR）的重链可变区和含有序列号41、42和43的CDR的轻链可变区。

[0033] （b）抗体，其包含含有序列号47、48和49的CDR的重链可变区和含有序列号51、52和53的CDR的轻链可变区。

[0034] （c）抗体，其包含含有序列号57、58和59的CDR的重链可变区和含有序列号61、62和63的CDR的轻链可变区。

[0035] （d）抗体，其包含含有序列号67、68和69的CDR的重链可变区和含有序列号71、72和73的CDR的轻链可变区。

[0036] （e）抗体，其包含含有序列号77、78和79的CDR的重链可变区和含有序列号81，82和83的CDR的轻链可变区。

[0037] （f）抗体，其包含含有序列号87，88和89的CDR的重链可变区和含有序列号91，92和93的CDR的轻链可变区。

[0038] （g）抗体，其包含含有序列号97、98和99的CDR的重链可变区和含有序列号101，102和103的CDR的轻链可变区。

[0039] （h）抗体，其包含含有序列号107、108和109的CDR的重链可变区和含有序列号111，112和113的CDR的轻链可变区。

[0040] （i）抗体，其包含含有序列号117、118和119的CDR的重链可变区和含有序列号121，122和123的CDR的轻链可变区。

[0041] （j）抗体，其包含含有序列号127、128和129的CDR的重链可变区和含有序列号121，122和123的CDR的轻链可变区。

[0042] （k）抗体，其包含含有序列号132、133和134的CDR的重链可变区和含有序列号136、137和138的CDR的轻链可变区。

[0043] （l）抗体，其包含含有序列号142、143和144的CDR的重链可变区和含有序列号146、147和148的CDR的轻链可变区。

[0044] （m）抗体，其包含含有序列号142、143和144的CDR的重链可变区和含有序列号152、153和154的CDR的轻链可变区。

[0045] （n）抗体，其包含含有序列号157、158和159的CDR的重链可变区和含有序列号161、162和163的CDR的轻链可变区。

[0046] （o）抗体，其包含含有序列号167、168和169的CDR的重链可变区和含有序列号171、172和173的CDR的轻链可变区。

[0047] （p）抗体，其包含含有序列号167、168和169的CDR的重链可变区和含有序列号177、178和179的CDR的轻链可变区。

[0048] （q）抗体，其包含含有序列号167、168和169的CDR的重链可变区和含有序列号182、183和184的CDR的轻链可变区。

[0049] （r）抗体，其包含含有序列号167、168和169的CDR的重链可变区和含有序列号187、188和189的CDR的轻链可变区。

[0050] （s）抗体，其包含含有序列号167、168和169的CDR的重链可变区和含有序列号192、193和194的CDR的轻链可变区。

[0051] （t）抗体，其包含含有序列号197、198和199的CDR的重链可变区和含有序列号201、202和203的CDR的轻链可变区。

[0052] （u）抗体，其包含含有序列号207、208和209的CDR的重链可变区和含有序列号211、212和213的CDR的轻链可变区。

[0053] （v）抗体，其包含含有序列号217、218和219的CDR的重链可变区和含有序列号221、222和223的CDR的轻链可变区。

[0054] （w）抗体，其包含含有序列号227、228和229的CDR的重链可变区和含有序列号231、232和233的CDR的轻链可变区。

[0055] （x）抗体，其包含含有序列号237、238和239的CDR的重链可变区和含有序列号241、242和243的CDR的轻链可变区。

[0056] （y）抗体，其包含含有序列号247、248和249的CDR的重链可变区和含有序列号251、252和253的CDR的轻链可变区。

[0057] 在本发明的其它实施方案中，本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂缀合。

[0058] 本发明进一步提供了组合的药物，其包含本发明的上述药物组合物与含有抗肿瘤剂的药物组合物的组合。

[0059] 本发明进一步提供了胰癌的治疗和/或预防方法，包括将本发明的上述药物组合物或上述组合的药物施与受试者。

[0060] 本发明使用的针对CAPRIN-1的抗体破坏胰癌细胞。因此，针对CAPRIN-1的抗体对于胰癌的治疗和／或预防是有用的。

[0061] 用于实施发明的方案

[0062] 本发明中使用的针对CAPRIN-1蛋白质，具体而言针对具有序列号2－30中偶数的序列号的氨基酸序列的肽的抗体的抗肿瘤活性，可以如下所述，通过研究在生物体内对荷癌动物的肿瘤增殖的抑制，或者通过研究对在生物体外表达该多肽的肿瘤细胞是否显示通过免疫细胞或补体介导的细胞毒性，来进行评价。

[0063] 其中，编码包含序列号2－30中偶数的序列号(即，序列号2，4，6……28，30)的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的碱基序列，分别在序列号1-29中奇数的序列号(即，序列号1，3，5……27，29)中显示。

[0064] 序列表的序列号6、8、10、12和14所示的氨基酸序列是作为与在源于荷癌狗的血清中存在的抗体特异性结合的多肽而被分离出的CAPRIN-1的氨基酸序列，另外，序列号2和4所示的氨基酸序列是作为其人同源因子(同源物或直向同源物)而被分离出的CAPRIN-1的氨基酸序列，序列号16所示的氨基酸序列是作为其牛同源因子而被分离出的CAPRIN-1的氨基酸序列，序列号18所示的氨基酸序列是作为其马同源因子而被分离出的CAPRIN-1的氨基酸序列，序列号20－28所示的氨基酸序列是作为其小鼠同源因子而被分离出的CAPRIN-1的氨基酸序列，序列号30所示的氨基酸序列是作为其鸡同源因子而被分离出的CAPRIN-1的氨基酸序列(参照下述的实施例1)。已知CAPRIN-1在休止期的正常细胞发生活化和/或细胞分裂时表达。

[0065] 根据本研究，可以明确CAPRIN-1蛋白质在胰癌细胞的细胞表面表达。本发明中，优选使用与CAPRIN-1蛋白质分子内的、在胰癌细胞的细胞表面表达的部分结合的抗体。作为在胰癌细胞的细胞表面表达的CAPRIN-1蛋白质中的部分肽，可以列举包含序列表的序列号2－30中除了序列号6和序列号18以外的偶数编号所示的氨基酸序列中的氨基酸残基编号（aa）50－98、氨基酸残基编号（aa）233－343、或氨基酸残基编号（aa）527－C末端的区域内的连续7－12个以上例如8-11个以上的氨基酸残基的多肽，具体可以列举例如序列号271或序列号273（例如在序列号273所示的氨基酸序列中也优选序列号274或序列号275所示氨基酸序列的区域）、或者作为癌细胞的细胞表面表达的CAPRIN-1蛋白质中的部分肽可以例举序列号266（例如在序列号266所示的氨基酸序列中，也优选序列号267或序列号268所示氨基酸序列的区域）或序列号270或序列号272或序列号269所示氨基酸序列、或与所述氨基酸序列具有80％以上、优选地85％以上、更优选地90％以上、进一步优选地95％以上、例如
96％以上、97％以上、98％以上、99％以上等的序列同一性的氨基酸序列，本发明使用的抗体包含与这些肽结合的且表现抗肿瘤活性的所有抗体。

[0066] 本发明中使用的针对上述CAPRIN-1的抗体只要是可发挥抗肿瘤活性，就可以是任何种类的抗体，包含例如单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体例如合成抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体(diabody)、三特异性抗体(triabody)等）、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体(scFv)等、人抗体、它们的抗体片段例如Fab、F(ab’)2、Fv等。这些抗体和其片段还可以利用本领域技术人员公知的方法制备。在本发明中，期望是可与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合的抗体，优选为单克隆抗体，但只要可稳定地生产均质的抗体，则也可以是多克隆抗体。另外，当受试者是人时，为了避免或抑制排斥反应，期望是人抗体或人源化抗体。

[0067] 这里，“与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合”是指与CAPRIN-1蛋白质特异性地结合，与CAPRIN-1蛋白质以外的蛋白质实质上不结合。

[0068] 本发明中可使用的抗体的抗肿瘤活性，可以如下所述，通过研究在生物体内对荷癌动物的肿瘤增殖的抑制，或者通过研究对在生物体外表达该多肽的肿瘤细胞是否显示通过免疫细胞或补体介导的细胞毒活性，来进行评价。

[0069] 进一步地，本发明中作为胰癌的治疗和/或预防的对象的受试者是人、宠物、家畜类、竞技用动物等哺乳动物，优选的受试者是人。

[0070] 以下对于与本发明相关的抗原的制备、抗体的制备、以及药物组合物进行说明。

[0071] ＜抗体制备用抗原的制备＞

[0072] 作为用于获取本发明中使用的针对CAPRIN-1的抗体的致敏抗原使用的蛋白质或其片段，可以源自人、狗、牛、马、小鼠、大鼠、鸡等，对成为其来源的动物种类没有限制。但是优选考虑与在细胞融合中使用的亲本细胞的适合性来选择该蛋白质或其片段，一般来说，优选源于哺乳动物的蛋白质，特别优选源于人的蛋白质。例如当CAPRIN-1是人CAPRIN-1时，可以使用人CAPRIN-1蛋白质和/或其部分肽、表达人CAPRIN-1的细胞等。

[0073] 人CAPRIN-1和其同源物的碱基序列和氨基酸序列例如可以通过访问GenBank(美国NCBI)，利用BLAST、FASTA等的算法(Karlin和Altschul，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：5873-5877，1993；Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)来得到。

[0074] 在本发明中，当以人CAPRIN-1的碱基序列(序列号1或3)或氨基酸序列(序列号2或4)为基准时，包含与它们的ORF或成熟部分的碱基序列或氨基酸序列具有70％-100％、优选
80％-100％、更优选90％-100％、进一步优选95％-100％、例如97％-100％、98％-100％、
99％-100％或99.5％-100％的序列同一性的序列的核酸或蛋白质成为靶。这里，“％序列同一性”是将2个序列在导入空位或不导入空位的情况下以形成最大的类似度或一致度的方式比对(对齐)时，相同氨基酸(或碱基)相对于氨基酸(或碱基)的总数的百分比(％)。

[0075] CAPRIN-1蛋白质的片段具有从作为抗体识别的最小单位的表位(抗原决定簇)的氨基酸长度至小于该蛋白质的全长的长度。表位是指在哺乳动物、优选人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段，其最小单位包含约7－12个氨基酸残基、例如8-11个氨基酸残基。作为具体例子，可以列举序列号273、序列号266或序列号270或序列号272或序列号269所示氨基酸序列、或与该氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、进一步更优选地97-99％以上的序列同一性的氨基酸序列。

[0076] 上述的含有人CAPRIN-1蛋白质和/或其部分肽的多肽可以按照例如Fmoc法(芴基甲基氧基羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等的化学合成法进行合成(日本生化学会编、生化学实验讲座1、蛋白质的化学IV、化学修饰和肽合成、东京化学同人(日本)、1981年)。另外，也可以利用各种市售的肽合成仪通过常规方法进行合成。另外，使用公知的基因工程学方法(Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press、Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley＆Sons等)，制备编码上述多肽的多核苷酸，将该多核苷酸整合到表达载体中并导入宿主细胞，在该宿主细胞中生产多肽，由此可以得到目的多肽。

[0077] 编码上述多肽的多核苷酸可以通过公知的基因工程学方法和/或使用市售的核酸合成仪的常规方法来容易地制备。例如含有序列号1的碱基序列的DNA可以通过使用人染色体DNA或cDNA文库作为模板、使用以可扩增序列号1中记载的碱基序列的方式设计的一对引物进行PCR来制备。PCR的反应条件可以适当设定，可以列举例如，使用耐热性DNA聚合酶(例如Taq聚合酶等)和含有Mg2＋的PCR缓冲液，将由94℃30秒(变性)、55℃30秒－1分钟(退火)、72℃2分钟(延伸)组成的反应过程作为1个循环，例如进行30个循环后，在72℃反应7分钟的条件等，但不限定于此。对于PCR的方法、条件等，例如记载于Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，A compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology(1995)，John Wiley＆Sons(特别是第15章)中。

[0078] 另外，基于本说明书中的序列表的序列号1－30所示的碱基序列和氨基酸序列的信息，制备合适的探针和/或引物，使用该探针和/或引物来对人等的cDNA文库进行筛选，由此可以分离所需的DNA。cDNA文库优选由表达序列号2－30中偶数的序列号的蛋白质的细胞、器官或组织来制备。这样的细胞或组织的例子是源于睾丸、白血病、乳癌、淋巴瘤、脑肿瘤、肺癌、大肠癌、胰癌等的癌或肿瘤的细胞或组织。上述探针或引物的制备、cDNA文库的构建、cDNA文库的筛选、以及目的基因的克隆等的操作对于本领域技术人员而言是已知的，可以按照例如Sambrook等，Molecular Cloning，第2版，Current Protocols in Molecular Biology(1989)、Ausbel等(上述)等中记载的方法来进行。由这样所得的DNA，可以得到编码人CAPRIN-1蛋白质或其部分肽的DNA。

[0079] 作为上述宿主细胞，只要是可表达上述多肽的细胞，就可以是任意的细胞，作为原核细胞的例子可以列举大肠杆菌等，作为真核细胞的例子可以列举猴肾脏细胞COS1、中国仓鼠卵巢细胞CHO等哺乳动物细胞、人胎儿肾脏细胞株HEK293、胎小鼠皮肤细胞株NIH3T3、芽殖酵母、裂殖酵母等的酵母细胞、蚕细胞、非洲爪蟾卵细胞等，但不限于此。

[0080] 当使用原核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有能在原核细胞中复制的起点、启动子、核糖体结合部位、多克隆位点、终止子、抗药性基因、营养缺陷型互补基因等的表达载体。作为大肠杆菌用表达载体，可以例示pUC系、pBluescriptII、pET表达系统、pGEX表达系统等。如果将编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该载体转化原核宿主细胞后，培养所得的转化体，则可以在原核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。此时，也可以使该多肽作为与其他蛋白质的融合蛋白质来表达。

[0081] 当使用真核细胞作为宿主细胞时，作为表达载体，使用具有启动子、剪接区、多聚(A)添加部位等的真核细胞用表达载体。作为这种表达载体，可以例示pKA1、pCDM8、pSVK3、pMSG、pSVL、pBK-CMV、pBK-RSV、EBV载体、pRS、pcDNA3、pYES2等。与上述同样地，如果将编码上述多肽的DNA整合到这样的表达载体中，用该载体转化真核宿主细胞后，培养所得的转化体，则可以在真核宿主细胞中表达由上述DNA编码的多肽。当使用pIND/V5-His、pFLAG-CMV-2、pEGFP-N1、pEGFP-C1等作为表达载体时，可以作为添加了His标签(例如(His)6-(His)10)、FLAG标签、myc标签、HA标签、GFP等各种标签的融合蛋白质，而表达上述多肽。

[0082] 表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

[0083] 为了从宿主细胞中分离纯化目的多肽，可以将公知的分离操作组合来进行。可以列举例如，利用了脲等的变性剂和/或表面活性剂的处理、超声波处理、酶消化、盐析或溶剂分别沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换色谱法、疏水色谱法、亲和色谱法、反相色谱法等，但不限于此。

[0084] ＜抗体的结构＞

[0085] 抗体通常是至少含有2条重链和2条轻链的杂多聚体糖蛋白质。IgM是不同的，其是由2条相同的轻(L)链和2条相同的重(H)链构成的约150kDa的杂四聚体糖蛋白质。典型地，各个轻链通过1个二硫键与重链连接，但各种免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键的数目有变化。各个重链和轻链还具有链内二硫键。各个重链在一端具有可变区(VH区)，而且几个恒定区与其连接。各个轻链具有可变区(VL区)，在其相反的端具有1个恒定区。轻链的恒定区与重链最初的恒定区对齐，且轻链可变区与重链的可变区对齐。抗体的可变区通过特定区域表现被称为互补决定区(CDR)的特定的可变性，从而赋予抗体以结合特异性。可变区的相对保守的部分被称为构架区(FR)。完整的重链和轻链的可变区分别含有通过3个CDR连接的4个FR。3个CDR在重链中从其N末端依次被称为CDRH1、CDRH2、CDRH3，同样在轻链中被称为CDRL1、CDRL2、CDRL3。在抗体对抗原的结合特异性中，CDRH3最为重要。另外，各链的CDR通过FR区以接近的状态被保持在一起，与来自其他链的CDR一同有助于抗体的抗原结合部位的形成。恒定区不直接有助于抗体与抗原结合，但表现各种效应器功能，例如，对抗体依赖的细胞性细胞毒活性(ADCC)的参与、介由对Fcγ受体的结合而产生的吞噬作用、介由新生儿Fc受体(FcRn)的半衰期/清除速度、介由补体级联的C1q构成要素的补体依赖性细胞毒(CDC)。

[0086] ＜抗体的制备＞

[0087] 本发明的抗CAPRIN-1抗体是指与CAPRIN-1蛋白质的全长或其片段具有免疫学反应性的抗体。

[0088] 这里，“免疫学反应性”是指在生物体内抗体与CAPRIN-1抗原结合的特性，介由这种结合可以发挥破坏(例如，杀死、抑制或缩小)肿瘤的功能。即，本发明中使用的抗体只要能够与CAPRIN-1蛋白质结合而破坏胰癌，则不问其种类。

[0089] 抗体的例子包含单克隆抗体、多克隆抗体、合成抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体、抗体片段(例如Fab、F(ab’)2、Fv)等。另外，抗体是免疫球蛋白分子的任意类，例如IgG、IgE、IgM、IgA、IgD和IgY；或任意亚类，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等。

[0090] 抗体进而除了糖基化以外，也可以通过乙酰化、甲酰化、酰胺化、磷酸化、或聚乙二醇(PEG)化等被修饰。

[0091] 以下显示各种抗体的制备例。

[0092] 抗体为单克隆抗体时，例如将CAPRIN-1蛋白质、表达CAPRIN-1的胰癌细胞或其细胞株（例如Capan-2等）等施与小鼠而进行免疫，从该小鼠取出脾脏，将细胞分离，然后使该细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，从所得的融合细胞(杂交瘤)中选择产生具有癌细胞增殖抑制作用的抗体的克隆。将产生具有癌细胞增殖抑制作用的单克隆抗体的杂交瘤分离，培养该杂交瘤，利用常规的亲和纯化法从培养上清中纯化抗体，由此可进行制备。

[0093] 产生单克隆抗体的杂交瘤例如也可以如下地制备。首先，按照公知的方法，用致敏抗原对动物进行免疫。作为一般的方法，可以通过将致敏抗原向哺乳动物的腹腔内或皮下注射来进行。具体来说，可以将致敏抗原利用PBS(磷酸盐缓冲液，Phosphate-Buffered Saline)或生理盐水等稀释成合适量、进行悬浮，根据需要适量混合通常的佐剂，例如弗氏完全佐剂，乳化后，每4-21天对哺乳动物施与数次。另外，致敏抗原免疫时也可以使用合适的载体。

[0094] 这样将哺乳动物免疫，确认在血清中所需的抗体水平升高，然后从哺乳动物收集免疫细胞，进行细胞融合，作为优选的免疫细胞特别可以列举脾细胞。

[0095] 作为与上述免疫细胞融合的其它亲本细胞，使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。该骨髓瘤细胞可以优选使用公知的各种细胞株、例如P3U1(P3-X63Ag8U1)、P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.和Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等人，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人，Nature(1978)276，269-270)、FO(deSt.Groth，S.F.等人，J.Immunol.Methods(1980)35，1-
21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等人，Nature(1979)277，131-133)等。

[0096] 上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以按照公知的方法、例如Kohler和Milstein等的方法(Kohler，G.和Milstein，C.，Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等来进行。

[0097] 更具体地，上述细胞融合例如可在细胞融合促进剂的存在下、在通常的营养培养液中实施。作为融合促进剂，可以使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而根据需要为了提高融合效率，还可以添加使用二甲基亚砜等的助剂。

[0098] 免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例可以任意地设定。例如优选使免疫细胞相对于骨髓瘤细胞为1-10倍。作为上述细胞融合中使用的培养液，可以使用例如，对于上述骨髓瘤细胞株的增殖合适的RPMI1640培养液、MEM培养液，其他可以在这种细胞培养中使用的通常的培养液，进一步也可以合并使用胎牛血清(FCS)等的血清补液。

[0099] 细胞融合是将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，将预先加热至37℃左右的PEG溶液(例如平均分子量1000-6000左右)以通常30-60％(w/v)的浓度添加、混合，由此形成作为目的的杂交瘤。接着，反复进行逐渐添加合适的培养液、离心除去上清的操作，由此除去对于杂交瘤的发育不优选的细胞融合剂等。

[0100] 这样得到的杂交瘤可以通过在通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶脱氧核苷的培养液)中培养来选择。上述HAT培养液中的培养持续对于除了作为目的的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)灭绝的充分时间(通常数天-数周)。然后，实施通常的有限稀释法，进行产生目的抗体的杂交瘤的筛选和单克隆化。

[0101] 另外，除了对人以外的动物免疫抗原来得到上述杂交瘤以外，还可以将人淋巴细胞、例如感染了EB病毒的人淋巴细胞在体外(in vitro)用蛋白质、蛋白质表达细胞或其裂解物致敏，使致敏淋巴细胞与来自人的具有永久分裂能力的骨髓瘤细胞、例如U266(注册编号TIB196)融合，得到产生具有所需活性(例如，细胞增殖抑制活性)的人抗体的杂交瘤。

[0102] 这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养，另外，可在液氮中长期保存。

[0103] 即，使用所需抗原或表达所需抗原的细胞作为致敏抗原，按照通常的免疫方法免疫，将所得的免疫细胞利用通常的细胞融合法与公知的亲本细胞融合，利用通常的筛选法通过对单克隆抗体产生细胞(杂交瘤)进行筛选来制备。

[0104] 本发明中可使用的抗体的其它例子是多克隆抗体。多克隆抗体可以例如如下地得到。

[0105] 用天然的CAPRIN-1蛋白质、或作为与GST等的融合蛋白质而在大肠杆菌等微生物中表达的重组CAPRIN-1蛋白质、或其部分肽对小鼠、产生人抗体的小鼠、兔等小动物进行免疫，得到血清。通过将该血清利用例如硫酸铵沉淀、蛋白质A、蛋白质G柱、DEAE离子交换色谱、偶联有CAPRIN-1蛋白质或合成肽的亲和柱等进行纯化来制备。在下述的实施例中，制作针对CAPRIN-1蛋白质的兔多克隆抗体，确认了抗肿瘤效果。

[0106] 这里，作为产生人抗体的小鼠，已知例如KM小鼠(Kirin Pharma/Medarex)和Xeno小鼠(Amgen)(例如国际公开第WO02/43478号、国际公开第WO02/092812号等)。将这种小鼠用CAPRIN-1蛋白质或其片段进行免疫时，可以由血液得到完全人多克隆抗体。另外，可以从免疫后的小鼠中取出脾脏细胞，利用与骨髓瘤细胞的融合法制备人型单克隆抗体。

[0107] 抗原的调制可以根据使用了动物细胞的方法(日本特表2007-530068)或使用了杆状病毒的方法(例如国际公开第WO98/46777号等)等来进行。当抗原的免疫原性低时，使其与白蛋白等具有免疫原性的巨大分子结合而进行免疫即可。

[0108] 此外，可以使用基因重组型抗体，该基因重组型抗体通过将抗体基因由杂交瘤克隆，整合到合适的载体中，并将其导入宿主，使用基因重组技术而产生(参照例如Carl，A.K.Borrebaeck，James，W.Larrick，THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。具体来说，由杂交瘤的mRNA使用逆转录酶来合成抗体的可变区(V区)的cDNA。如果可得到编码目的抗体的V区的DNA，则将其与编码所需的抗体恒定区(C区)的DNA连接，将连接产物整合到表达载体中。或者也可以将编码抗体的V区的DNA整合到含有抗体C区的DNA的表达载体中。该DNA以在表达控制区域例如增强子、启动子的控制下表达的方式整合到表达载体中。接着可以用该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。

[0109] 本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体优选是单克隆抗体。但也可以是多克隆抗体或基因改变抗体(嵌合抗体、人源化抗体等)等。

[0110] 单克隆抗体包含人单克隆抗体、非人的动物单克隆抗体(例如小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、鸡单克隆抗体等)等。单克隆抗体可以通过培养杂交瘤来制备，所述杂交瘤通过将来自用CAPRIN-1蛋白质免疫的非人哺乳动物(例如小鼠、产生人抗体的小鼠等)的脾细胞与骨髓瘤细胞的融合来得到。在下述的实施例中，制备了单克隆抗体，并确认了针对胰癌的抗肿瘤效果。这些单克隆抗体包含具有序列号40、序列号50、序列号60、序列号70、序列号80、序列号90、序列号100、序列号110、序列号120、序列号130、序列号
135、序列号145、序列号160、序列号170、序列号200、序列号210、序列号220、序列号230、序列号240或序列号250的氨基酸序列的重链可变（VH）区和具有序列号44、序列号54、序列号
64、序列号74、序列号84、序列号94、序列号104、序列号114、序列号124，序列号139、序列号
149、序列号155、序列号164、序列号174、序列号180、序列号185、序列号190、序列号195、序列号204、序列号214、序列号224、序列号234、序列号244或序列号254的氨基酸序列的轻链可变（VL）区，其中，所述VH区包含序列号37、序列号47、序列号57、序列号67、序列号77、序列号87、序列号97、序列号107、序列号117、序列号127、序列号132、序列号142、序列号157、序列号167、序列号197、序列号207、序列号217、序列号227、序列号237或序列号247的氨基酸序列所示的CDR1、序列号38、序列号48、序列号58、序列号68、序列号78、序列号88、序列号
98、序列号108、序列号118、序列号128、序列号133、序列号143、序列号158、序列号168、序列号198、序列号208、序列号218、序列号228、序列号238或序列号248的氨基酸序列所示的CDR2和序列号39、序列号49、序列号59、序列号69、序列号79、序列号89、序列号99、序列号
109、序列号119、序列号129、序列号134、序列号144、序列号159、序列号169、序列号199、序列号209、序列号219、序列号229、序列号239或序列号249的氨基酸序列所示的CDR3；所述VL区包含序列号41、序列号51、序列号61、序列号71、序列号81、序列号91、序列号101、序列号
111、序列号121，序列号136、序列号146、序列号152、序列号161、序列号171、序列号177、序列号182、序列号187、序列号192、序列号201、序列号211、序列号221、序列号231、序列号241或序列号251的氨基酸序列所示的CDR1、序列号42、序列号52、序列号62、序列号72、序列号
82、序列号92、序列号102、序列号112、序列号122，序列号137、序列号147、序列号153、序列号162、序列号172、序列号178、序列号183、序列号188、序列号193、序列号202、序列号212、序列号222、序列号232、序列号242或序列号252的氨基酸序列所示的CDR2和序列号43、序列号53、序列号63、序列号73、序列号83、序列号93、序列号103、序列号113、序列号123、序列号
138、序列号148、序列号154、序列号163、序列号173、序列号179、序列号184、序列号189、序列号194、序列号203、序列号213、序列号223、序列号233、序列号243或序列号253的氨基酸序列所示的CDR3。

[0111] 嵌合抗体是将来自不同动物的序列组合而制备的抗体，例如是包含小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区的抗体等。嵌合抗体的制备可以使用公知的方法来进行，例如嵌合抗体可以通过将编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区的DNA连接，将其整合入表达载体中并导入宿主而产生来得到。

[0112] 多克隆抗体包含对产生人抗体的动物(例如小鼠)免疫CAPRIN-1蛋白质而得到的抗体。

[0113] 人源化抗体是也称为重构(reshaped)人抗体的改变抗体。人源化抗体通过将来自免疫动物的抗体的CDR移植到人抗体的互补决定区中来构建。其一般的基因重组方法也是已知的。

[0114] 具体来说，利用PCR法由以末端部具有重叠部分的方式制备的数个寡核苷酸合成DNA序列，该DNA序列是以将小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区(framework region；FR)连结的方式设计的。将所得的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，接着整合到表达载体中，将其导入宿主而使其产生，从而得到(参照欧洲专利申请公开第EP239400号、国际公开第WO96/02576号)。对经由CDR连接的人抗体的FR选择形成互补决定区良好的抗原结合部位的FR。根据需要，也可以替换抗体的可变区中的构架区的氨基酸，以形成重构人抗体的互补决定区合适的抗原结合部位(Sato K.等人，Cancer Research1993，53：851-856)。另外，也可以替换为各种来自人抗体的构架区(参考国际公开第WO99/51743号)。

[0115] 对经由CDR连接的人抗体的构架区选择形成互补决定区良好的抗原结合部位的构架区。根据需要，也可以替换抗体的可变区中的构架区的氨基酸，以形成重构人抗体的互补决定区合适的抗原结合部位(Sato K.等人，Cancer Research1993，53：851-856)。

[0116] 在制备嵌合抗体或人源化抗体后，可以将可变区(例如FR)和/或恒定区中的氨基酸用其它氨基酸替换等。

[0117] 氨基酸的替换例如是小于15个、小于10个、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下、或2个以下的氨基酸、优选1-5个氨基酸、更优选1个或2个氨基酸的替换，替换抗体与未替换抗体应在功能上等同。期望替换是保守的氨基酸替换，这是电荷、侧链、极性、芳香族性等性质类似的氨基酸间的替换。性质类似的氨基酸例如可以分类为碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)、酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸)、无极性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸)、支链氨基酸(苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸)等。

[0118] 作为抗体修饰物，可以列举例如与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。在本发明使用的抗体修饰物中，不限定结合的物质。为了得到这样的抗体修饰物，可以通过对所得的抗体实施化学修饰来得到。这些方法在本领域已经被确立。

[0119] 这里，“在功能上等同”是指成为对象的抗体与本发明使用的抗体具有同样的生物学或生物化学的活性，具体来说，是指具有破坏肿瘤的功能、以及在对人应用时本质上不发生排斥反应等。作为这样的活性，可以列举例如细胞增殖抑制活性、或结合活性。

[0120] 作为用于调制与某多肽在功能上等同的多肽的本领域技术人员熟知的方法，已知有在多肽中导入突变的方法。例如只要是本领域技术人员，就可以使用定点诱变法(Hashimoto-Gotoh，T.等人，(1995)Gene152，271-275、Zoller，MJ.和Smith，M.(1983)Methods Enzymol.100，468-500、Kramer，W.等人，(1984)Nucleic Acids Res.12，9441-9456、Kramer，W.和Fritz，HJ.，(1987)Methods Enzymol.154，350-367、Kunkel，TA.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.82，488-492、Kunkel(1988)Methods Enzymol.85，2763-2766)等，在本发明的抗体中导入适当的突变，由此制备与该抗体在功能上等同的抗体。

[0121] 可以利用本领域技术人员公知的方法得到识别由上述抗CAPRIN-1抗体所识别的CAPRIN-1蛋白质的表位的抗体。例如，可以通过下述方法等来得到：通过通常的方法(例如表位作图(epitope mapping)等)确定由抗CAPRIN-1抗体识别的CAPRIN-1蛋白质的表位，以具有该表位中所含的氨基酸序列的多肽为免疫原来制作抗体的方法；通过通常的方法确定制作的抗体的表位，选择表位与抗CAPRIN-1抗体相同的抗体的方法等。这里，“表位”是指在哺乳动物、优选人中具有抗原性或免疫原性的多肽片段，其最小单位包含约7－12个氨基酸、优选8-11个氨基酸。

[0122] 本发明中使用的抗体的亲和常数Ka(kon/koff)优选至少为107M-1、至少为108M-1、至8 -1 9 -1 9 -1 10 -1 10 -1
少为5×10 M 、至少为10M 、至少为5×10 M 、至少为10 M 、至少为5×10 M 、至少为
1011M-1、至少为5×1011M-1、至少为1012M-1、或者至少为1013M-1。

[0123] 本发明中使用的抗体可以与抗肿瘤剂缀合。抗体与抗肿瘤剂的结合可以经由具有与氨基、羧基、羟基、硫醇基等为反应性的基团(例如，琥珀酰亚胺基、甲酰基、2-吡啶基二硫基、马来酰亚胺基、烷氧基羰基、羟基等)的间隔物来进行。

[0124] 抗肿瘤剂的例子包含文献等中记载的公知的下述抗肿瘤剂，即紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、噻替哌、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa、卡波醌、meturedopa、uredopa、六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethilenethiophosphoramide)、三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、布拉他辛、布拉他辛酮、喜树碱、苔藓虫素、海绵多聚乙酰(callystatin)、cryptophycin1、cryptophycin8、海兔毒素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、spongistatin、苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯乙链脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素(calicheamicin)、达内霉素(dynemicin)、氯屈膦酸、埃斯培拉霉素(esperamicin)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、detorbicin、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(adriamycin)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类、例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酮
(testolactone)、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵
(elliptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、香茹多糖、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocine)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝吖啶nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2-乙基酰肼、甲苄肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)、杆孢菌素(roridine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌泊溴烷(pipobroman)、gacytosine、多西紫杉醇、瘤可宁、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、奥沙利铂、卡波铂、长春碱、足叶乙甙、异环磷酰胺、米托葸醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵(novantrone)、替尼泊苷、依达曲沙(edatrexate)、道诺霉素、氨蝶呤、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨(capecitabine)、以及它们的药学上可接受的（公知的）盐或（公知的）衍生物。

[0125] 另外，通过将本发明使用的抗体与抗肿瘤剂联合施与，能够获得更高的治疗效果。对于表达CAPRIN-1的癌患者，本手段能够适用于外科手术前后的任一时间均可。特别地，在手术后，对于使用现有的抗肿瘤剂单独处理的表达CAPRIN-1的癌，能够获得更高的癌再发防止和／或生存期间的延长。

[0126] 用于联合施与的抗肿瘤剂的例子包含文献等中记载的公知的下述抗肿瘤剂，即，紫杉醇、多柔比星、柔红霉素、环磷酰胺、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、噻替哌、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、benzodopa、卡波醌、meturedopa、uredopa、六甲蜜胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺(triethilenethiophosphoramide)、三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、布拉他辛、布拉他辛酮、喜树碱、苔藓虫素、海绵多聚乙酰(callystatin)、cryptophycin1、cryptophycin8、海兔毒素(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、艾榴塞洛素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、spongistatin、苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、甲氮芥、盐酸甲氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、乌拉莫司汀、卡莫司汀、氯乙链脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡奇霉素(calicheamicin)、达内霉素(dynemicin)、氯屈膦酸、埃斯培拉霉素(esperamicin)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素、更生霉素、detorbicin、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(adriamycin)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素、甲基丝裂霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)、二甲叶酸(denopterin)、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)、氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮杂尿苷(azauridine)、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类、例如卡普睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酮
(testolactone)、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸(frolinic acid)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、阿莫司汀(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatraxate)、defofamine、秋水仙胺(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵
(elliptinium)、埃博霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、香茹多糖、氯尼达明(lonidamine)、美登素(maytansine)、安丝菌素(ansamitocine)、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌、mopidanmol、二胺硝吖啶nitraerine、喷司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星、洛索蒽醌(losoxantrone)、足叶草酸(podophyllinic acid)、2-乙基酰肼、甲苄肼、雷佐生(razoxane)、根瘤菌素(rhizoxin)、西佐喃、锗螺胺(spirogermanium)、细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)、三乙撑亚胺苯醌(triaziquone)、杆孢菌素(roridine)A、蛇形菌素(anguidine)、聚氨酯、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥(mannomustine)、二溴甘露醇、二溴卫矛醇(mitolactol)、哌泊溴烷(pipobroman)、gacytosine、多西紫杉醇、瘤可宁、吉西他滨(gemcitabine)、6-硫鸟嘌呤、巯嘌呤、顺铂、奥沙利铂、卡波铂、长春碱、足叶乙甙、异环磷酰胺、米托葸醌、长春新碱、长春瑞滨、诺消灵(novantrone)、替尼泊苷、依达曲沙(edatrexate)、道诺霉素、氨蝶呤、希罗达(xeloda)、伊班膦酸盐(ibandronate)、伊立替康、拓扑异构酶抑制剂、二氟甲基鸟氨酸(DMFO)、视黄酸、卡培他滨(capecitabine)、以及它们的药学上可接受的（公知的）盐或（公知的）衍生物。上述中特别地优选使用环磷酰胺、紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨等。

[0127] 或者，在本发明使用的抗体中，也可以结合文献等中公知的211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153SM、212Bi、32P、175Lu、176Lu等放射性同位素。放射性同位素期望是可有效地用于治疗或诊断肿瘤的同位素。

[0128] 本发明使用的抗体是与CAPRIN-1具有免疫学反应性的抗体、或者是与CAPRIN-1特异性地结合的抗体，并且是显示对胰癌的细胞毒活性、或肿瘤增殖抑制作用的抗体。该抗体应该是具有在施与该抗体的对象动物中能够几乎避免或完全避免产生排斥反应的结构的抗体。作为这样的抗体，例如在对象动物为人时，可以列举人抗体、人源化抗体、嵌合抗体(例如人-小鼠嵌合抗体)、单链抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体、三特异性抗体等。这些抗体是重链和轻链的可变区都源于人抗体的抗体；或是重链和轻链的可变区包含来源于非人的动物抗体的互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)和来源于人抗体的构架区的抗体，或者是重链和轻链的可变区源于非人的动物抗体、且重链和轻链的恒定区源于人抗体的重组型抗体。优选的抗体是前2种抗体。

[0129] 这些重组型抗体可以如下制备。由杂交瘤等产生抗体的细胞克隆编码针对人CAPRIN-1的单克隆抗体(例如人单克隆抗体、小鼠单克隆抗体、大鼠单克隆抗体、兔单克隆抗体、鸡单克隆抗体等)的DNA，将其作为模板利用RT-PCR法等来制备编码该抗体的轻链可变区和重链可变区的DNA，基于Kabat EU编号系统(Kabat等、Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thEd.Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，Md.(1991))来确定轻链和重链的各可变区的序列或各CDR1、CDR2、CDR3的序列。

[0130] 进一步地，使用基因重组技术(Sambrook等，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))或DNA合成仪来制备编码这些各可变区的DNA或编码各CDR的DNA。其中，上述产生人单克隆抗体的杂交瘤可以通过在对产生人抗体的动物(例如小鼠)免疫人CAPRIN-1后，使从该免疫动物切除的脾细胞与骨髓瘤细胞融合来制备。与此不同，根据需要使用基因重组技术或DNA合成仪来制备编码源于人抗体的轻链或重链的可变区和恒定区的DNA。

[0131] 对于人源化抗体的情况，制备将编码源于人抗体的轻链或重链的可变区的DNA中的CDR编码序列替换成与它们对应的源于人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的CDR编码序列而得的DNA，将由此得到的DNA分别与编码源于人抗体的轻链或重链的恒定区的DNA连接，由此可以制备编码人源化抗体的DNA。

[0132] 对于嵌合抗体的情况，通过将编码源于人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的轻链或重链的可变区的DNA，分别与编码源于人抗体的轻链或重链的恒定区的DNA连接，可以制备编码嵌合抗体的DNA。

[0133] 对于单链抗体的情况，该抗体是将重链可变区和轻链可变区通过接头(linker)以直线状连接而成的抗体，通过将编码重链可变区的DNA、编码接头的DNA、和编码轻链可变区的DNA结合，可以制备编码单链抗体的DNA。其中，重链可变区和轻链可变区都源于人抗体，或者源于仅CDR被源于人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的CDR替换而得的人抗体。另外，接头包含12-19个氨基酸，可以列举例如15个氨基酸的(G4S)3(G.-B.Kim等，Protein Engineering Design and Selection2007，20(9):425-432)。

[0134] 对于双特异性抗体(diabody)的情况，该抗体是可与2个不同的表位特异性地结合的抗体，例如可以通过将编码重链可变区A的DNA、编码轻链可变区B的DNA、编码重链可变区B的DNA、和编码轻链可变区A的DNA以该顺序进行结合(其中编码轻链可变区B的DNA与编码重链可变区B的DNA可通过编码如上所述的接头的DNA来结合)，来制备编码双特异性抗体的DNA。其中，重链可变区和轻链可变区都源于人抗体，或者源于仅CDR被源于人以外的动物(例如小鼠、大鼠、鸡等)的抗体的CDR替换而得的人抗体。

[0135] 将如上所述制备的重组DNA整合到1个或多个合适的载体中，将其导入宿主细胞(例如哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等)，进行(共)表达，由此可以制备重组型抗体(P.J.Delves.，ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES.，1997WILEY、P.Shepherd和C.Dean.，Monoclonal Antibodies.，2000OXFORD UNIVERSITY PRESS；J.W.Goding.，Monoclonal Antibodies:principles and practice.，1993ACADEMIC PRESS)。

[0136] 由上述方法制备的本发明的抗体可以列举例如以下(a)-（y）的抗体。

[0137] （a）抗体，其包含含有序列号37，38和39的互补决定区（CDR）的重链可变区和含有序列号41，42和43的CDR的轻链可变区（例如包含序列号40的重链可变区和序列号44的轻链可变区的抗体）。

[0138] （b）抗体，其包含含有序列号47，48和49的CDR的重链可变区和含有序列号51、52和53的CDR的轻链可变区（例如包含序列号50的重链可变区和序列号54的轻链可变区的抗体）。

[0139] （c）抗体，其包含含有序列号57、58和59的CDR的重链可变区和含有序列号61、62和63的CDR的轻链可变区（例如包含序列号60的重链可变区和序列号64的轻链可变区的抗体）。

[0140] （d）抗体，其包含含有序列号67、68和69的CDR的重链可变区和含有序列号71、72和73的CDR的轻链可变区（例如包含序列号70的重链可变区和序列号74的轻链可变区的抗体）。

[0141] （e）抗体，其包含含有序列号77，78和79的CDR的重链可变区和含有序列号81，82和83的CDR的轻链可变区（例如包含序列号80的重链可变区和序列号84的轻链可变区的抗体）。

[0142] （f）抗体，其包含含有序列号87，88和89的CDR的重链可变区和含有序列号91，92和93的CDR的轻链可变区（例如包含序列号90的重链可变区和序列号94的轻链可变区的抗体）。

[0143] （g）抗体，其包含含有序列号97，98和99的CDR的重链可变区和含有序列号101，102和103的CDR的轻链可变区（例如包含序列号100的重链可变区和序列号104的轻链可变区的抗体）。

[0144] （h）抗体，其包含含有序列号107，108和109的CDR的重链可变区和含有序列号111，112和113的CDR的轻链可变区（例如包含序列号110的重链可变区和序列号114的轻链可变区的抗体）。

[0145] （i）抗体，其包含含有序列号117，118和119的CDR的重链可变区和含有序列号121，122和123的CDR的轻链可变区（例如包含序列号120的重链可变区和序列号124的轻链可变区的抗体）。

[0146] （j）抗体，其包含含有序列号127，128和129的CDR的重链可变区和含有序列号121，122和123的CDR的轻链可变区（例如包含序列号130的重链可变区和序列号124的轻链可变区的抗体）。

[0147] （k）抗体，其包含含有序列号132，133和134的CDR的重链可变区和含有序列号136，137和138的CDR的轻链可变区（例如包含序列号135的重链可变区和序列号139的轻链可变区的抗体）。

[0148] （l）抗体，其包含含有序列号142，143和144的CDR的重链可变区和含有序列号146，147和148的CDR的轻链可变区（例如包含序列号145的重链可变区和序列号149的轻链可变区的抗体）。

[0149] （m）抗体，其包含含有序列号142，143和144的CDR的重链可变区和含有序列号152，153和154的CDR的轻链可变区（例如包含序列号145的重链可变区和序列号155的轻链可变区的抗体）。

[0150] （n）抗体，其包含含有序列号157，158和159的CDR的重链可变区和含有序列号161，162和163的CDR的轻链可变区（例如包含序列号160的重链可变区和序列号164的轻链可变区的抗体）。

[0151] （o）抗体，其包含含有序列号167，168和169的CDR的重链可变区和含有序列号171，172和173的CDR的轻链可变区（例如包含序列号170的重链可变区和序列号174的轻链可变区的抗体）。

[0152] （p）抗体，其包含含有序列号167，168和169的CDR的重链可变区和含有序列号177，178和179的CDR的轻链可变区（例如包含序列号170的重链可变区和序列号180的轻链可变区的抗体）。

[0153] （q）抗体，其包含含有序列号167，168和169的CDR的重链可变区和含有序列号182，183和184的CDR的轻链可变区（例如包含序列号170的重链可变区和序列号185的轻链可变区的抗体）。

[0154] （r）抗体，其包含含有序列号167，168和169的CDR的重链可变区和含有序列号187，188和189的CDR的轻链可变区（例如包含序列号170的重链可变区和序列号190的轻链可变区的抗体）。

[0155] （s）抗体，其包含含有序列号167，168和169的CDR的重链可变区和含有序列号192，193和194的CDR的轻链可变区（例如包含序列号170的重链可变区和序列号195的轻链可变区的抗体）。

[0156] （t）抗体，其包含含有序列号197，198和199的CDR的重链可变区和含有序列号201，202和203的CDR的轻链可变区（例如包含序列号200的重链可变区和序列号204的轻链可变区的抗体）。

[0157] （u）抗体，其包含含有序列号207，208和209的CDR的重链可变区和含有序列号211，212和213的CDR的轻链可变区（例如包含序列号210的重链可变区和序列号214的轻链可变区的抗体）。

[0158] （v）抗体，其包含含有序列号217，218和219的CDR的重链可变区和含有序列号221，222和223的CDR的轻链可变区（例如包含序列号220的重链可变区和序列号224的轻链可变区的抗体）。

[0159] （w）抗体，其包含含有序列号227，228和229的CDR的重链可变区和含有序列号231，232和233的CDR的轻链可变区（例如包含序列号230的重链可变区和序列号234的轻链可变区的抗体）。

[0160] （x）抗体，其包含含有序列号237，238和239的CDR的重链可变区和含有序列号241，242和243的CDR的轻链可变区（例如包含序列号240的重链可变区和序列号244的轻链可变区的抗体）。

[0161] （y）抗体，其包含含有序列号247，248和249的CDR的重链可变区和含有序列号251，252和253的CDR的轻链可变区（例如包含序列号250的重链可变区和序列号254的轻链可变区的抗体）。

[0162] 其中，序列号67、68和69、序列号77、78和79、序列号87、88和89、序列号97、98和99、序列号107、108和109、序列号117、118和119、序列号127、128和129、序列号132、133和134、序列号142、143和144、序列号157、158和159、序列号167、168和169、序列号167、168和169、序列号197、198和199、序列号207、208和209、序列号217、218和219、序列号227、228和229、序列号237、238和239、序列号247、248和249所示的氨基酸序列分别是小鼠抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3，另外，序列号71、72和73、序列号81、82和83、序列号91、92和93、序列号101、102和103、序列号111、112和113、序列号121、122和123、序列号136、137和138、序列号
146、147和148、序列号152、153和154、序列号161、162和163、序列号171、172和173、序列号
177、178和179、序列号182、183和184、序列号187、188和189、序列号192、193和194、序列号
201、202和203、序列号211、212和213、序列号221、222和223、序列号231、232和233、序列号
241、242和243、序列号251、252和253所示的氨基酸序列分别是小鼠抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

[0163] 另外，序列号37、38和39、序列号47、48和49、序列号57、58和59所示的氨基酸序列是鸡抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3；进一步地，序列号41、42和43、序列号51、52和53、序列号61、62和63所示的氨基酸序列分别是鸡抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3。

[0164] 另外，本发明使用的人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体或多特异性抗体例如是以下的抗体（用抗体(a)例示）。

[0165] （i）抗体，其中重链的可变区包含序列号37、38和39的氨基酸序列和源于人抗体的构架区的氨基酸序列，且轻链的可变区包含序列号41、42和43的氨基酸序列和源于人抗体的构架区的氨基酸序列。

[0166] （ii）抗体，其中重链的可变区包含序列号37、38和39的氨基酸序列和源于人抗体的构架区的氨基酸序列，且重链的恒定区包含源于人抗体的氨基酸序列；以及轻链的可变区包含序列号41、42和43的氨基酸序列和源于人抗体的构架区的氨基酸序列，且轻链的恒定区包含源于人抗体的氨基酸序列。

[0167] （iii）抗体，其中重链的可变区包含序列号40的氨基酸序列且重链的恒定区包含源于人抗体的氨基酸序列；以及轻链的可变区包含序列号44的氨基酸序列且轻链的恒定区包含源于人抗体的氨基酸序列。

[0168] 另外，人抗体重链和轻链的恒定区和可变区的序列例如可以由NCBI(美国：GenBank、UniGene等)获得，例如对于人IgG1重链恒定区，可以参照注册编号J00228的序列，对于人IgG2重链恒定区，可以参照注册编号为J00230的序列，对于人IgG3重链恒定区，可以参照注册编号为X03604的序列，对于人IgG4重链恒定区，可以参照注册编号为K01316的序列，对于人轻链κ恒定区，可以参照注册编号为V00557、X64135、X64133等的序列，对于人轻链λ恒定区，可以参照注册编号为X64132、X64134等的序列。

[0169] 上述抗体优选具有细胞毒活性，由此可以发挥抗肿瘤效果。

[0170] 另外，可以明确上述抗体中的重链和轻链的可变区、CDR的特定序列仅仅是用于例示，并不限于特定的序列。制备可产生针对人CAPRIN-1的其它人抗体或非人的动物抗体(例如小鼠抗体)的杂交瘤，回收由杂交瘤产生的单克隆抗体，以与人CAPRIN-1的免疫结合性和细胞毒活性作为指标，来判定是否为目的抗体。由此识别产生单克隆抗体的目的杂交瘤后，如上所述，由该杂交瘤制备编码目的抗体的重链和轻链的可变区的DNA，进行序列确定，将该DNA用于其他抗体的制备。

[0171] 进一步地，本发明使用的上述抗体只要具有特异性地识别CAPRIN-1这样的特异性，则上述(i)至(iii)等的各抗体的特别是构架区的序列和/或恒定区的序列中可以有1个或数个(优选1个或2个)氨基酸的替换、缺失或添加。其中，数个是指2-5个、优选2个或3个。

[0172] 认为本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体对表达CAPRIN-1的胰癌细胞的抗肿瘤效果，是由以下机理所引起的。

[0173] CAPRIN-1表达细胞的效应细胞抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、和CAPRIN-1表达细胞的补体依赖的细胞毒性(CDC)。

[0174] 因此，本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体的活性评价，如以下实施例中具体所示的那样，可以通过在生物体外对表达CAPRIN-1的胰癌细胞测定上述ADCC活性或CDC活性来进行评价。

[0175] 可以认为，本发明中使用的抗CAPRIN-1抗体，与胰癌细胞上的CAPRIN-1蛋白质结合，通过上述活性而表现抗肿瘤作用，因此在胰癌的治疗或预防中是有用的。即，本发明提供以抗CAPRIN-1抗体为有效成分的、用于胰癌的治疗和/或预防的药物组合物。在以将抗CAPRIN-1抗体施与人体的目的(抗体治疗)使用时，为了使免疫原性降低，优选为人抗体和/或人源化抗体。

[0176] 另外，抗CAPRIN-1抗体与胰癌细胞表面上的CAPRIN-1蛋白质的结合亲和性越高，越可得到由抗CAPRIN-1抗体产生的更强的抗肿瘤活性。因此，如果可以获得与CAPRIN-1蛋白质具有高的结合亲和性的抗CAPRIN-1抗体，则可以期待更强的抗肿瘤效果，可以适合作为以胰癌的治疗和/或预防为目的的药物组合物。作为高的结合亲和性，如上所述，结合常数(亲和常数)Ka(kon/koff)优选至少为107M-1、至少108M-1、至少为5×108M-1、至少为109M-1、至9 -1 10 -1 10 -1 11 -1 11 -1
少为5×10M 、至少为10 M 、至少为5×10 M 、至少为10 M 、至少为5×10 M 、至少为
1012M-1、或至少为1013M-1。

[0177] ＜对表达抗原的细胞的结合＞

[0178] 抗体与CAPRIN-1蛋白质结合的能力可以利用如实施例中所述的使用了例如ELISA、蛋白质印迹法、免疫荧光和流式细胞仪分析等的结合分析来特定。

[0179] ＜免疫组织化学染色＞

[0180] 识别CAPRIN-1的抗体，可以利用本领域技术人员公知的方法中的免疫组织化学，使用由外科手术期间从患者得到的组织、或从担载了接种有自然地或在转染后表达CAPRIN-1的细胞系的异种移植组织的动物得到的组织进行低聚甲醛或丙酮固定而得的冷冻切片或用低聚甲醛固定并进行石蜡包埋而得的组织切片，进行有关与CAPRIN-1的反应性的试验。

[0181] 为了进行免疫组织化学染色，可以将对CAPRIN-1具有反应性的抗体用各种方法进行染色。例如通过与辣根过氧化物酶复合的山羊抗小鼠抗体或山羊抗兔抗体反应，能够可视化。

[0182] ＜药物组合物＞

[0183] 本发明的用于胰癌的治疗和/或预防的药物组合物的靶只要是表达CAPRIN-1基因的胰癌(细胞)即可，没有特别限定。

[0184] 本说明书中使用的“肿瘤”和“癌”这样的术语是指恶性新生物，可以互换使用。

[0185] 作为在本发明中成为对象的胰癌，是表达编码包含序列号2－30中偶数的序列号的氨基酸序列或由7－12以上连续氨基酸组成的其部分序列的多肽的基因的胰癌。

[0186] 胰癌中包含例如胰管癌（Pancreatic ductal carcinoma）、浸润性胰管癌（Invasive pancreatic ductal carcinoma）、胰癌的腺癌（Adenocarcinoma）、腺泡细胞癌（Acinar Cell Carcinoma）、腺扁平上皮癌（Adenosquamous Carcinoma）、巨细胞瘤（Giant cell tumor）、胰管内乳头粘液性肿瘤（Intraductal papillary-mucinous neoplasm（IPMN））、粘液性囊腺癌（Mucinous cystic neoplasm（MCN））、胰母细胞瘤（Pancreatoblastoma）、浆液性囊腺癌（Serous cystadenocarcinoma）、实性假乳头状瘤（Solid-pseudopapillary tumor（SPT））、胃泌素瘤（Gastrinomas(Zollinger-Ellison综合征)）、胰高血糖素瘤（Glucagonomas）、胰岛素瘤（Insulinomas）、多发性内分泌腺瘤1型（Multiple Endocrine Neoplasia Type-1（MEN1）（Wermer综合征））、非功能性胰岛细胞肿瘤（Nonfunctional Islet Cell Tumor）、生长抑素瘤（Somatostatinomas）、产生VIP的瘤（VIPomas），但不限于此。

[0187] 另外，成为对象的动物是哺乳动物，是包含例如灵长类、宠物、家畜类、竞技用动物等的哺乳动物，特别优选人、狗和猫。

[0188] 本发明使用的抗体作为药物组合物应用的情形，可以利用本领域公知的方法进行制剂。例如，可以以与水或水以外的药学上可接受的液体的无菌性溶液、或悬浮液剂的注射剂的形式非经口地使用。例如，认为可以与药理学上可接受的载体或介质、具体来说为灭菌水和/或生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、运载体(vehicle)、防腐剂、结合剂等适当组合，通过以一般被认可的制药实施所要求的单位用量方式混和来进行制剂化。这些制剂中的有效成分量是能够得到所指示的范围的合适用量。

[0189] 用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水这样的运载体按照通常的制剂实施来配制。

[0190] 作为注射用的水溶液，可以列举例如生理盐水、含有葡萄糖和/或其它辅助剂，例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠的等渗液，也可以与适当的溶解助剂，例如醇、具体为乙醇、多元醇例如丙二醇、聚乙二醇、非离子性表面活性剂例如聚山梨醇酯80(TM)、HCO-60合并使用。

[0191] 作为油性液可以列举芝麻油、大豆油，其可以与作为溶解助剂的苯甲酸苄酯、苄醇合并使用。另外，还可以与缓冲剂例如磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液、镇痛剂例如盐酸普鲁卡因、稳定剂例如苄醇、苯酚、抗氧化剂配合。制备的注射液通常填充到合适的安瓿中。

[0192] 施与为经口或非经口，优选非经口施与，具体来说，可以列举注射剂型、经鼻施与剂型、经肺施与剂型、经皮施与型等。作为注射剂型的例子，可以通过例如静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射等全身或局部性地施与。

[0193] 另外，可以根据患者的年龄、体重、性别、症状等选择合适的施与方法。作为含有抗体或含有编码抗体的多核苷酸的药物组合物的施与量，可以例如以一次每1kg体重为0.0001mg至1000mg的范围来选择。或者可以例如以每个患者0.001-100000mg/个体的范围来选择施与量，但不必限于这些数值。施与量、施与方法根据患者的体重、年龄、性别、症状等不同而变化，只要是本领域技术人员就可以适当选择。

[0194] 通过将本发明的药物组合物施与受试者，能够治疗和/或预防胰癌。

[0195] 进一步地，本发明也包括胰癌的治疗和/或预防方法，所述方法包括将本发明的药物组合物与如上所例示的抗肿瘤剂或与包含抗肿瘤剂的药物组合物组合，联合施与受试者。本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂能够同时地或者分别地施与受试者。在分别地施与的情形，任一药物组合物可以在先也可以在后，它们的施与间隔、施与量、施与途径和施与次数可由专业医师适当选择。同时施与的其它药物剂型还包含例如将本发明的抗体或其片段与抗肿瘤剂在药理学上可接受的载体(或介质)中混合并进行制剂化而得的药物组合物。另外，对于含有抗肿瘤剂的上述药物组合物和剂型的任一者，可以适用对于含有本发明的抗体的药物组合物和剂型的处方、制剂化、施与途径、用量、癌等的说明。因此，本发明还提供了用于胰癌的治疗和/或预防的组合的药物（也称为“药物试剂盒”），其包含本发明的药物组合物和含有如上例示的抗肿瘤剂的药物组合物。

[0196] 另外，本发明也提供了用于胰癌的治疗和/或预防的药物组合物，其包含本发明的抗体或其片段、抗肿瘤剂以及药理学上可接受的载体。

[0197] 或者，抗肿瘤剂也可以缀合至本发明的抗体或其片段。所述缀合物能与上述同样地，与药理学上可接受的载体（或介质)混合并制剂化，做成药物组合物。实施例[0198] 以下，基于实施例更为具体地说明本发明，但本发明的范围不限于这些具体例。

[0199] [实施例1]通过SEREX法的胰癌抗原蛋白的鉴定

[0200] (1)cDNA文库的制作

[0201] 通过酸胍-酚-氯仿方法(Acid guanidium-Phenol-Chloroform法)从健康狗的睾丸组织提取总RNA，并且使用Oligotex-dT30mRNA纯化试剂盒(宝酒造社制)，按照试剂盒附带的说明书纯化多聚A RNA。

[0202] 使用如此获得的mRNA(5μg)合成狗睾丸cDNA噬菌体文库。在cDNA噬菌体文库的制作中使用cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA合成试剂盒、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning试剂盒(STRATAGENE公司制)，按照试剂盒中附带说明书制作文库。制作的cDNA噬菌体文库的大小是7.73×105pfu/ml。

[0203] (2)利用血清对cDNA文库的筛选

[0204] 使用上述制作的狗睾丸cDNA噬菌体文库进行免疫筛选。具体地，感染宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)使得Φ90×15mm的NZY琼脂糖平板上形成2210个克隆，在42℃培养3－4小时，形成溶菌斑(噬斑)，用渗透了IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)的硝酸纤维素膜(Hybond C Extra:GE Healthcare Bio-Scinece公司制)在37℃覆盖该平板4小时，由此使蛋白质诱导、表达，在该膜上转印蛋白质。然后回收该膜，并浸入到含有0.5％脱脂奶粉的TBS(10mM Tris-HCl，150mM NaCl pH值7.5)中，在4℃振摇过夜，由此抑制非特异性反应。使该滤膜与稀释了500倍的患病狗血清在室温下反应2－3小时。

[0205] 作为上述患病狗的血清，使用由患有乳癌的狗中收集的血清。这些血清在－80℃保存，在即将使用前进行前处理。血清的前处理方法利用以下的方法。即，使宿主大肠杆菌(XL1-Blure MRF’)感染没有插入外来基因的λZAP表达噬菌体后，在NZY平板培养基上于37℃培养过夜。接着在平板中加入含有0.5MNaCl的0.2M NaHCO3pH值8.3的缓冲液，在4℃静置15小时后，将上清液作为大肠杆菌/噬菌体提取液回收。接着，使回收的大肠杆菌/噬菌体提取液流经NHS-柱(GE Healthcare Bio-Science公司制)，将源于大肠杆菌·噬菌体的蛋白质固定化。使患病狗的血清流经固定了该蛋白质的柱进行反应，将吸附在大肠杆菌和噬菌体上的抗体从血清中除去。将直接流过该柱的血清级分用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释
500倍。将所得物用作免疫筛选材料。

[0206] 将该处理血清和印迹了上述融合蛋白的膜用TBS-T(0.05％吐温20/TBS)洗涤4次，然后与作为二次抗体的已经用含有0.5％脱脂奶粉的TBS稀释5000倍的山羊抗狗IgG(Goat anti Dog IgG－h+I HRP conjugated：BETHYL Laboratories公司制)在室温反应1小时，通过使用NBT/BCIP反应液(Roche公司制)的酶显色反应来检测，从Φ90x15mm的NZY琼脂糖平板上收集与显色反应阳性部位相对应的集落，并将其溶解于500μl的SM缓冲液(100mM NaCl，10mM MgClSO4，50mM Tris-HCl，0.01％明胶，pH值7.5)中。以与上述同样的方法重复二次、三次筛选，直至显色反应阳性集落单一化，从而筛选30940个与血清中的IgG反应的噬菌体克隆，并分离了5个阳性克隆。

[0207] (3)分离的抗原基因的同源性检索

[0208] 为了对通过上述方法分离的5个阳性克隆进行碱基序列分析，实施将噬菌体载体转换成质粒载体的操作。具体地，将宿主大肠杆菌(XL1-Blue MRF’)调制成吸光度OD600为1.0的溶液，将该溶液200μl与250μl纯化的噬菌体溶液、以及1μl ExAssist辅助噬菌体(STRATAGENE公司制)混合，随后在37℃反应15分钟。添加3ml LB培养基，在37℃培养2.5－3小时，立即用70℃的水浴保温20分钟，然后进行4℃、1000×g、15分钟的离心分离，收集上清液作为噬菌粒溶液。随后，将噬菌粒宿主大肠杆菌(SOLR)调制成吸光度OD600为1.0的溶液，将该溶液200μl与10μl纯化的噬菌体溶液混合，随后在37℃反应15分钟。将50μl接种于含有氨苄青霉素(终浓度:50μg/ml)的LB琼脂培养基，并且在37℃培养过夜。收集转化的SOLR单集落，在含有氨苄青霉素(终浓度：50μg/ml)的LB培养基中在37℃培养后，使用QIAGEN plasmid Miniprep Kit(QIAGEN公司制)纯化具有目的插入物的质粒DNA。

[0209] 使用序列号31记载的T3引物和序列号32记载的T7引物，通过引物步移法，对纯化的质粒进行插入物全长序列的分析。通过该序列分析，获得了序列号5、7、9、11、13所记载的基因序列。使用该基因的碱基序列和氨基酸序列(序列号6、8、10、12、14)来进行同源性检索程序BLAST检索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，从而进行与已知基因的同源性检索，结果判明获得的5个基因均是编码CAPRIN-1的基因。就被翻译为蛋白质的区域而言，这五个基因之间的序列同一性为碱基序列100％，氨基酸序列99％。就被翻译为蛋白质的区域而言，该基因与编码人同源因子的基因的序列同一性为：94％的碱基序列同一性、98％的氨基酸序列同一性。人同源因子的碱基序列示于序列号1、3，氨基酸序列示于序列号2、4。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，所获得的狗基因与编码牛同源因子的基因的序列同一性为:94％的碱基序列同一性、97％的氨基酸序列同一性。牛同源因子的碱基序列示于序列号15，氨基酸序列显示于序列号16。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码牛同源因子的基因之间的序列同一性为：94％的碱基序列同一性、93％－97％的氨基酸序列同一性。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，所获得的狗基因与编码马同源因子的基因的序列同一性为：93％的碱基序列同一性、97％的氨基酸序列同一性。马同源因子的碱基序列示于序列号17，氨基酸序列示于序列号18。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码马同源因子的基因之间的序列同一性为：93％的碱基序列同一性、96％的氨基酸序列同一性。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，所获得的狗基因与编码小鼠同源因子的基因的序列同一性为：87％－89％的碱基序列同一性、
95％－97％的氨基酸序列同一性。小鼠同源因子的碱基序列示于序列号19、21、23、25、27，氨基酸序列示于序列号20、22、24、26、28。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码小鼠同源因子的基因之间的序列同一性为：89％－91％的碱基序列同一性、95％－96％的氨基酸序列同一性。此外，就被翻译为蛋白质的区域而言，所获得的狗基因与编码鸡同源因子的基因的序列同一性为：82％的碱基序列同一性、87％的氨基酸序列同一性。鸡同源因子的碱基序列示于序列号29，氨基酸序列示于序列号30。另外，就被翻译为蛋白质的区域而言，编码人同源因子的基因与编码鸡同源因子的基因之间的序列同一性为:81％－82％的碱基序列同一性、86％的氨基酸序列同一性。

[0210] （4）人胰癌细胞中的CAPRIN-1基因表达分析

[0211] 对于通过上述方法获得的基因，利用RT-PCR法研究人的各种胰癌细胞株的4种癌细胞株（Capan-2、MIAPaCa-2、PANC-1、BxPC-3）中的表达。逆转录反应如下进行。即，使用TRIZOL试剂(invitrogen公司制)并按照附带的说明书从各组织50－100mg和各细胞株5－10×106个细胞中提取总RNA。使用该总RNA，利用Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(invitrogen公司制)按照附带的说明书合成cDNA。PCR反应使用取得的基因特异性引物(在序列号33和34中记载)如下进行。即，以使通过逆转录反应制备的样品为0.25μl，上述引物为各2μM，dNTP为各0.2mM、ExTaq聚合酶(宝酒造社制)为0.65U的方式添加各试剂和附带的缓冲液，调节至总量25μl，使用Thermal Cycler(BIO RAD公司制)，将94℃30秒、60℃30秒、72℃30秒的循环重复30次。另外，上述基因特异性引物扩增序列号1的碱基序列（人CAPRIN-1基因）中的第698位－第1124位碱基的区域。为了进行比较对照，同时使用GAPDH特异性引物(在序列号35和36中记载)。结果确认了在全部的人胰癌细胞株中表达。

[0212] [实施例2]针对人CAPRIN-1的多克隆抗体的制备

[0213] 将按照WO2010/016526的实施例3制备的人CAPRIN-1重组蛋白质1mg与等容量的不完全弗氏佐剂（IFA）溶液混合，将其每2周施与一次，在兔的皮下施与4次。然后采集血液，得到含有多克隆抗体的抗血清。进一步地使用蛋白G载体（GE Healthcare Science公司制）将该抗血清纯化，得到针对CAPRIN-1的多克隆抗体。另外，将没有施与抗原的兔的血清与上述同样地使用蛋白G载体进行纯化而得到抗体，将该得到的抗体作为对照抗体。

[0214] [实施例3]人胰癌中CAPRIN-1蛋白质的表达分析

[0215] （1）人胰癌细胞上的CAPRIN-1蛋白质的表达分析

[0216] 对于确认了CAPRIN-1基因的表达的4种人胰癌细胞株（Capan-2、MIAPaCa-2、PANC-1、BxPC-3），研究了其细胞表面上是否表达CAPRIN-1蛋白质。在1.5ml容量的微量离心管中分别离心分离上述确认了基因表达的各人胰癌细胞株的106个细胞。添加实施例2制备的针对源自CAPRIN-1的多克隆抗体2μg（5μl），并悬浮于95μl的包含0.1％胎牛血清的PBS中后，在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，悬浮于5μl FITC标记的山羊抗兔IgG抗体（Santa Cruz公司制）和95μl的包含0.1％胎牛血清（FBS）的PBS中，冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，使用Becton Dickinson株式会社的FACS Calibur测定荧光强度。另一方面，替代针对CAPRIN-1的多克隆抗体而使用实施例2制备的对照抗体，进行与上述同样的操作作为对照。结果，与对照相比较，任一添加了抗人CAPRIN-1多克隆抗体的胰癌细胞的荧光强度均增强20％以上。由此可以确认，CAPRIN-1蛋白质在上述人胰癌细胞株的细胞膜表面上表达。并且，上述荧光强度的增强率利用各细胞的平均荧光强度(MFI值)的增加率表示，通过以下算式来算出。

[0217] 平均荧光强度的增加率(荧光强度的增强率)(％)＝((与抗人CAPRIN-1抗体反应的细胞的MFI值)－(对照MFI值))÷(对照MFI值)×100。

[0218] （2）人胰癌组织中CAPRIN-1蛋白质的表达

[0219] 使用石蜡包埋的人胰癌组织阵列(BIOMAX公司制)的40个胰癌组织样本，进行免疫组织化学染色。将人胰癌组织阵列在60℃处理3小时后，放入装满了二甲苯的染色瓶中，将每隔5分钟替换二甲苯的操作进行3次。接着用乙醇和PBS-T代替二甲苯，进行同样的操作。在装满了含有0.05％吐温20的10mM柠檬酸缓冲液(pH值6.0)的染色瓶中加入人胰癌组织阵列，在125℃处理5分钟后，在室温下静置40分钟以上。将切片周围的多余水分用Kimwipe擦去，用DAKOPEN圈定，适当滴加Peroxidase Block(DAKO公司制)。在室温下静置5分钟后，加入到装满了PBS-T的染色瓶中，将每隔5分钟替换PBS-T的操作进行3次。作为封闭液，加入含有10％FBS的PBS-T溶液，在保湿室内、在室温下静置1小时。接着加入将实施例2制备的针对源自CAPRIN-1的多克隆抗体用含有5％FBS的PBS-T溶液调制成10μg/ml而得的溶液，在保湿室内、在4℃静置过夜，用PBS-T进行10分钟3次洗涤后，滴加适量的Peroxidase Labelled Polymer Conjugated(DAKO公司制)，在保湿室内、在室温下静置30分钟。利用PBS-T洗涤3次每次10分钟后，加入DAB显色液(DAKO公司制)，在室温下静置10分钟左右后，丢弃显色液，用PBS-T洗涤3次每次10分钟后，用蒸馏水漂洗，依次加入到70％、80％、90％、95％、100％的各乙醇溶液中各1分钟，然后在二甲苯中静置过夜。取出载玻片，用Glycergel Mounting Medium(DAKO公司制)封片后，进行观察。作为其结果，在全部40份胰癌组织样本中，确认有
36份样本(90％)强表达CAPRIN-1。

[0220] [实施例4]针对CAPRIN-1的多克隆抗体对胰癌细胞的抗肿瘤效果（ADCC活性）[0221] 研究了针对CAPRIN-1的抗体能否破坏表达CAPRIN-1的胰癌细胞。使用实施例2获得的针对人CAPRIN-1的多克隆抗体进行评价。将确认了CAPRIN-1表达的人胰癌细胞Capan-2和MIAPaCa-2分别106个收集到50ml容量的离心管中，加入100μCi的铬51，在37℃孵育2小时。然后用含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基洗涤3次，向96孔V底板中每孔添加各103个
5
细胞。向其中分别添加上述针对人CAPRIN-1的多克隆抗体1μg，进一步地分别添加2×10 个从人外周血分离的淋巴细胞，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到破坏的肿瘤细胞中释放至培养上清液中的铬（Cr）51的量，算出针对人CAPRIN-1的多克隆抗体对各胰癌细胞的ADCC活性。作为其结果，在使用自没有免疫抗原的兔的外周血制备的对照抗体进行同样操作的情形，相对于Capan-2和MIAPaCa-2而言，为分别不到0.7％；在没有添加抗体的情形也是不到0.5％，与之相反，在添加针对人CAPRIN-1的多克隆抗体的情形，对Capan-2和MIAPaCa-2分别确认了14％和11％的ADCC活性。因此，明确了通过使用针对CAPRIN-1的抗体的ADCC活性，能够破坏表达CAPRIN-1的胰癌细胞。另外，细胞毒活性是如上所述，将本发明使用的针对CAPRIN-1的抗体、淋巴细胞和摄入了铬51的103个肿瘤细胞混合并培养4小时，培养后测定释放至培养基的铬51量，通过以下计算式＊算出的显示针对肿瘤细胞的细胞毒活性的结果。

[0222] ＊式：细胞毒活性（％）＝自添加了针对CAPRIN-1的抗体和淋巴细胞时的肿瘤细胞的铬51游离量÷自添加了1N盐酸的肿瘤细胞的铬51游离量×100

[0223] [实施例5]针对CAPRIN-1的小鼠和鸡单克隆抗体的制备

[0224] 将实施例2中制备的人CAPRIN-1重组蛋白质100μg与等量的MPL＋TDM佐剂（Sigma公司制）混合，将该混合物用作1只小鼠的抗原溶液。将抗原溶液施与6周龄的Balb/c小鼠（日本SLC公司制）的腹腔内，每1周施与一次，再施与3次和24次，完成免疫。从最后免疫起3日后分别取出脾脏，然后将其在两片无菌的载玻片之间磨碎，将用PBS(-)(日水社制)洗涤并以1500转/分钟离心10分钟移除上清液的操作重复3次，获得脾脏细胞。将获得的脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0（由ATCC购入）以10∶1的比例混合，向其中添加通过使加热至37℃的200μl含有10％FBS的RPMI1640培养基与800μl PEG1500(Boehringer公司制)混合而制得的PEG溶液，静置5分钟以进行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟，移除上清液后，将细胞用150ml添加了2％当量的Gibco公司制的HAT溶液的含有15％FBS的RPMI1640培养基(HAT选择培养基)悬浮，并且以每孔各100μl接种于15块96孔板(Nunc公司制)中。在37℃、5％CO2的条件下培养7天，获得脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合的杂交瘤。

[0225] 以由制备的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和力作为指标来筛选杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml以每孔100μl的量添加至96孔板，并使该板在4℃静置18小时。各孔用PBS-T洗涤3次后，以每孔400μl的量添加0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液(SIGMA公司制)，使该板在室温静置3小时。移除溶液，用每孔400μl的PBS-T洗涤各孔3次后，以每孔100μl的量添加上述获得的杂交瘤的各培养上清液，使该板在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次，然后以每孔100μl的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记抗小鼠IgG（H＋L）抗体（Invitrogen公司制），并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且静置15－30分钟，进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止该反应，使用吸光度计测定在450nm的吸光度值和在595nm的吸光度值。作为其结果，选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。

[0226] 将选出的杂交瘤以每孔0.5个的量添加至96孔板并培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。进一步培养这些孔中的细胞，以从克隆的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和力作为指标，选择杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml以每孔100μl的量添加至96孔板，并在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次，然后以每孔400μl的量添加0.5％BSA溶液，并在室温静置3小时。移除溶液，用每孔400μl的PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μl的量添加上述获得的杂交瘤的各培养上清液，并在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，以每孔100μl的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记抗小鼠IgG（H＋L）抗体（Invitrogen公司制），并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且静置15-30分钟，进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止该反应，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。作为其结果，获得了产生与CAPRIN-1蛋白显示反应性的小鼠单克隆抗体的150个杂交瘤株。

[0227] 接下来，在这些小鼠单克隆抗体当中选出与表达CAPRIN-1的癌细胞的细胞表面显示反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml容量的微量离心管中离心分离106个人乳癌细胞株MDA-MB-231V，向其中添加上述各杂交瘤的培养上清液100μl，在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，添加用含有0.1％FBS的PBS稀释500倍的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体（Invitrogen公司制），并在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，使用Becton Dickinson株式会社的FACSCaliber测定荧光强度。另一方面，使用将没有任何处理的6周龄的Balb/c小鼠的血清用杂交瘤培养用培养基稀释了500倍的物质代替抗体，进行与上述同样的操作，作为对照。作为其结果，选出了与对照相比荧光强度强的、即与乳癌细胞的细胞表面反应的小鼠单克隆抗体22个（小鼠单克隆抗体＃1－＃22）。

[0228] 另外，为了制备鸡单克隆抗体，将实施例2制备的序列号2所示的抗原蛋白质（人CAPRIN-1）300μg与等量的弗氏完全佐剂混合，将其作为1只鸡的抗原溶液。将抗原溶液施与7周龄鸡的腹腔内后，每4周一次施与7次，完成免疫。最后一次免疫后第4天分别取出脾脏，然后将其在两片无菌的载玻片之间磨碎，将用PBS(-)(日水社制)洗涤并以1500转/分钟离心10分钟移除上清液的操作重复3次，获得脾脏细胞。将获得的脾脏细胞与鸡骨髓瘤细胞以
5:1的比例混合，其中所述鸡骨髓瘤细胞是自使用鸟类网状内皮组织增殖症病毒的鸡通过转化法建立的轻链缺损的鸡骨髓瘤细胞，向其中添加通过使加热至37℃的200μl含有10％FBS的IMDM培养基与800μl PEG1500(Boehringer公司制)混合而制得的PEG溶液，静置5分钟以进行细胞融合。以1700转/分钟离心5分钟，移除上清液后，将细胞用300ml添加了2％当量的Gibco公司制的HAT溶液的含有10％FBS的IMDM培养基(HAT选择培养基)悬浮，并且以每孔各100μl接种于30块96孔板(Nunc公司制)中。在37℃、5％CO2的条件下培养7天，获得脾脏细胞与鸡骨髓瘤细胞融合的杂交瘤。

[0229] 以由制备的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和力作为指标来筛选杂交瘤。将实施例2中制备的CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml以每孔100μl的量添加至96孔板，并使该板在4℃静置18小时。各孔用PBS-T洗涤3次后，以每孔400μl的量添加0.5％牛血清白蛋白(BSA)溶液(SIGMA公司制)，使该板在室温静置3小时。移除溶液，用每孔400μl的PBS-T洗涤各孔3次后，以每孔100μl的量添加上述获得的杂交瘤的各培养上清液，使该板在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次，然后以每孔100μl的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记的抗鸡IgY抗体（SIGMA公司制），并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且静置15－30分钟，进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止该反应，使用吸光度计测定在450nm的吸光度值和在595nm的吸光度值。作为其结果，选出了多个产生吸光度值高的抗体的杂交瘤。

[0230] 将选出的杂交瘤以每孔0.5个的量添加至96孔板并培养。1周后，观察到在孔中形成单个集落的杂交瘤。进一步培养这些孔中的细胞，以从克隆的杂交瘤产生的抗体对CAPRIN-1蛋白的结合亲和力作为指标，选择杂交瘤。将人CAPRIN-1蛋白溶液1μg/ml以每孔100μl的量添加至96孔板，并在4℃静置18小时。将各孔用PBS-T洗涤3次，然后以每孔400μl的量添加0.5％BSA溶液，并在室温静置3小时。移除溶液，用每孔400μl的PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μl的量添加上述获得的杂交瘤的各培养上清液，并在室温静置2小时。用PBS-T洗涤各孔3次后，以每孔100μl的量添加用PBS稀释5000倍的HRP标记的抗鸡IgY抗体（SIGMA社制），并且在室温静置1小时。用PBS-T洗涤孔3次后，以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并且静置15－30分钟，进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止该反应，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。作为其结果，获得了产生与CAPRIN-1蛋白显示反应性的单克隆抗体的多个杂交瘤株。

[0231] 接下来，在这些单克隆抗体当中选出与表达CAPRIN-1的癌细胞的细胞表面显示反应性的单克隆抗体。具体地，在1.5ml容量的微量离心管中离心分离5×105个人乳癌细胞株MDA-MB-231V，向其中添加上述各杂交瘤的培养上清液100μl，在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，添加用含有0.1％FBS的PBS稀释30倍的FITC标记山羊抗鸡IgG（H＋L）抗体（SouthernBiotech公司制），并在冰上静置1小时。在用PBS洗涤后，使用Becton Dickinson株式会社的FACSCaliber测定荧光强度。另一方面，使用杂交瘤培养用培养基进行与上述同样的操作，用作对照的样本。作为其结果，选出了与对照相比荧光强度强的、即与表达CAPRIN-1的乳癌细胞的细胞表面反应的3个单克隆抗体（鸡单克隆抗体＃1、＃2、＃3）。

[0232] [实施例6]选出的抗体所具有的特征

[0233] (1)抗CAPRIN-1单克隆抗体的可变区基因的克隆

[0234] 自分别产生实施例5选出的22个小鼠单克隆抗体和3个鸡单克隆抗体的各杂交瘤株提取mRNA，对产生小鼠单克隆抗体的杂交瘤使用对源自小鼠FR1的序列和源自小鼠FR4的序列特异的引物，对产生鸡单克隆抗体的杂交瘤使用对源自鸡FR1的序列和源自鸡FR4的序列特异的引物，通过RT-PCR法，获得全部的抗CAPRIN-1单克隆抗体的重链可变（VH）区和轻链可变（VL）区的基因。为了确定序列，将这些基因克隆入pCR2.1载体（Invitrogen公司制）。

[0235] （1）-1RT-PCR

[0236] 自106个产生小鼠单克隆抗体的各杂交瘤株，使用mRNA micro purification kit（GE Healthecare公司制）制备mRNA，使用SuperScriptII1st strand synthesis kit（Invitrogen公司制）逆转录获得的mRNA来合成cDNA。遵循各试剂盒所附的方法实施这些操作。使用获得的cDNA通过PCR法进行抗体基因的扩增。为了获得VH区基因，使用对小鼠重链FR1序列特异的引物（序列号257）和对小鼠重链FR4序列特异的引物（序列号258）。另外，为了获得VL区基因，使用对小鼠轻链FR1序列特异的引物（序列号259）和对小鼠轻链FR4特异的引物（序列号260）。参考Jones，S.T.和Bending，M.M.Bio/Technology9，88－89（1991）设计这些引物。使用Ex-taq（TakaraBio公司制）进行PCR。向10×EX Taq缓冲液5μl、dNTP混合物（2.5mM）4μl、引物（1.0μM）各2μl、Ex Taq（5U/μl）0.25μl加入cDNA样品，用无菌水调至总量50μl。94℃处理2分钟后，以变性94℃1分钟、退火58℃30秒、延伸反应72℃1分钟的组合30个循环的条件实施。

[0237] 另外，自106个产生鸡单克隆抗体的各杂交瘤株，使用High Pure RNA Isolation Kit（Roche公司制）提取总RNA，使用PrimeScriptII1st strand cDNA Synthesis Kit（Takara公司制）合成cDNA。遵循各试剂盒所附的方法实施这些操作。以合成的cDNA为模板，使用KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO公司制)，按照常规方法通过PCR法分别扩增鸡抗体重链基因可变区和鸡抗体轻链基因可变区。为了获得鸡抗体VH区的基因，使用对鸡重链FR1序列特异的引物和对鸡重链FR4序列特异的引物。另外，为了获得VL区的基因，使用对鸡轻链FR1序列特异的引物和对鸡轻链FR4特异的引物。

[0238] （1）-2克隆

[0239] 使用上述得到的各PCR产物，利用琼脂糖凝胶进行电泳，切出VH区和VL区各自的DNA带。DNA片段使用QIAquick Gel purification kit(QIAGEN公司制)并按照附带的说明书来进行。纯化的各DNA使用TA克隆试剂盒(Invitrogen公司制)克隆到pCR2.1载体中。将连接的载体利用常规方法转化到DH5α感受态细胞(TOYOBO公司制)中。将各个转化体的各10个克隆在培养基(100μg/ml氨苄青霉素)中、在37℃培养过夜后，将各质粒DNA使用Qiaspin Miniprep kit(QIAGEN公司制)进行纯化。

[0240] （1）-3序列确定

[0241] 上述得到的各质粒中的VH区和VL区的基因序列分析，使用M13正向引物(序列号261)和M13反向引物(序列号262)，利用荧光测序仪(ABI公司制DNA测序仪3130XL)，并使用ABI公司制的BigDye Terminator Ver3.1循环测序试剂盒，按照其附带的说明书来进行。其结果可以确定各基因序列和氨基酸序列。

[0242] 即，这些单克隆抗体包含具有序列号40（序列号45）、序列号50（序列号55）、序列号60（序列号65）、序列号70（序列号75）、序列号80（序列号85）、序列号90（序列号95）、序列号
100（序列号105）、序列号110（序列号115）、序列号120（序列号125）、序列号130（序列号
131）、序列号135（序列号140）、序列号145（序列号150）、序列号160（序列号165）、序列号170（序列号175）、序列号200（序列号205）、序列号210（序列号215）、序列号220（序列号225）、序列号230（序列号235）、序列号240（序列号245）或序列号250（序列号255）的氨基酸序列的重链可变（VH）区（括号内是基因序列的序列号）和具有序列号44（序列号46）、序列号54（序列号56）、序列号64（序列号66）、序列号74（序列号76）、序列号84（序列号86）、序列号94（序列号96）、序列号104（序列号106）、序列号114（序列号116）、序列号124（序列号126）、序列号
139（序列号141）、序列号149（序列号151）、序列号155（序列号156）、序列号164（序列号
166）、序列号174（序列号176）、序列号180（序列号181）、序列号185（序列号186）、序列号190（序列号191）、序列号195（序列号196）、序列号204（序列号206）、序列号214（序列号216）、序列号224（序列号226）、序列号234（序列号236）、序列号244（序列号246）或序列号254（序列号256）的氨基酸序列的轻链可变（VL）区（括号内是基因序列的序列号），其中，所述VH区包含序列号37、序列号47、序列号57、序列号67、序列号77、序列号87、序列号97、序列号107、序列号117、序列号127、序列号132、序列号142、序列号157、序列号167、序列号197、序列号
207、序列号217、序列号227、序列号237或序列号247的氨基酸序列所示的CDR1、序列号38、序列号48、序列号58、序列号68、序列号78、序列号88、序列号98、序列号108、序列号118、序列号128、序列号133、序列号143、序列号158、序列号168、序列号198、序列号208、序列号
218、序列号228、序列号238或序列号248的氨基酸序列所示的CDR2和序列号39、序列号49、序列号59、序列号69、序列号79、序列号89、序列号99、序列号109、序列号119、序列号129、序列号134、序列号144、序列号159、序列号169、序列号199、序列号209、序列号219、序列号
229、序列号239或序列号249的氨基酸序列所示的CDR3，所述VL区包含序列号41、序列号51、序列号61、序列号71、序列号81、序列号91、序列号101、序列号111、序列号121，序列号136、序列号146、序列号152、序列号161、序列号171、序列号177、序列号182、序列号187、序列号
192、序列号201、序列号211、序列号221、序列号231、序列号241或序列号251的氨基酸序列所示的CDR1、序列号42、序列号52、序列号62、序列号72、序列号82、序列号92、序列号102、序列号112、序列号122，序列号137、序列号147、序列号153、序列号162、序列号172、序列号
178、序列号183、序列号188、序列号193、序列号202、序列号212、序列号222、序列号232、序列号242或序列号252的氨基酸序列所示的CDR2和序列号43、序列号53、序列号63、序列号
73、序列号83、序列号93、序列号103、序列号113、序列号123、序列号138、序列号148、序列号
154、序列号163、序列号173、序列号179、序列号184、序列号189、序列号194、序列号203、序列号213、序列号223、序列号233、序列号243或序列号253的氨基酸序列所示的CDR3。

[0243] 获得的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列示于序列号40、序列号50、序列号60、序列号70、序列号80、序列号90、序列号100、序列号110、序列号120、序列号130、序列号
135、序列号145、序列号160、序列号170、序列号200、序列号210、序列号220、序列号230、序列号240和序列号250，轻链可变区的氨基酸序列示于序列号44、序列号54、序列号64、序列号74、序列号84、序列号94、序列号104、序列号114、序列号124，序列号139、序列号149、序列号155、序列号164、序列号174、序列号180、序列号185、序列号190、序列号195、序列号204、序列号214、序列号224、序列号234、序列号244和序列号254。

[0244] 即，小鼠单克隆抗体＃1包含序列号70的重链可变区和序列号74的轻链可变区；＃2包含序列号80的重链可变区和序列号84的轻链可变区；＃3包含序列号90的重链可变区和序列号94的轻链可变区；＃4包含序列号100的重链可变区和序列号104的轻链可变区；＃5包含序列号110的重链可变区和序列号114的轻链可变区；＃6包含序列号120的重链可变区和序列号124的轻链可变区；＃7包含序列号130的重链可变区和序列号124的轻链可变区；＃8包含序列号135的重链可变区和序列号139的轻链可变区；＃9包含序列号145的重链可变区和序列号149的轻链可变区；＃10包含序列号145的重链可变区和序列号155的轻链可变区；＃11包含序列号160的重链可变区和序列号164的轻链可变区；＃12包含序列号170的重链可变区和序列号174的轻链可变区；＃13包含序列号170的重链可变区和序列号180的轻链可变区；＃14包含序列号170的重链可变区和序列号185的轻链可变区；＃15包含序列号170的重链可变区和序列号190的轻链可变区；＃16包含序列号170的重链可变区和序列号195的轻链可变区；＃17包含序列号200的重链可变区和序列号204的轻链可变区；＃18包含序列号210的重链可变区和序列号214的轻链可变区；＃19包含序列号220的重链可变区和序列号224的轻链可变区；＃20包含序列号230的重链可变区和序列号234的轻链可变区；＃21包含序列号240的重链可变区和序列号244的轻链可变区；＃22包含序列号250的重链可变区和序列号254的轻链可变区。

[0245] 获得的鸡单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列示于序列号40、序列号50、序列号60，轻链可变区的氨基酸序列示于序列号44、序列号54、序列号64。

[0246] 即，鸡单克隆抗体＃1包含序列号40的重链可变区和序列号44的轻链可变区，其中重链可变区中的CDR1－3分别由序列号37、序列号38、序列号39的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1－3分别由序列号41、序列号42、序列号43的氨基酸序列组成；鸡单克隆抗体＃2包含序列号50的重链可变区和序列号54的轻链可变区，其中重链可变区中的CDR1－3分别由序列号47、序列号48、序列号49的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1－3分别由序列号51、序列号52、序列号53的氨基酸序列组成；鸡单克隆抗体＃3包含序列号60的重链可变区和序列号64的轻链可变区，其中重链可变区中的CDR1－3分别由序列号57、序列号58、序列号59的氨基酸序列组成，轻链可变区中的CDR1－3分别由序列号61、序列号62、序列号63的氨基酸序列组成。

[0247] （2）人-鸡嵌合重组抗体和小鼠-鸡嵌合抗体的制备

[0248] 将上述（1）获得的序列号40所示的鸡单克隆抗体＃1重链可变区基因扩增片段的两端用限制性酶处理后纯化，遵循常规方法插入这样的pcDNA4/myc-His（Invitrogen公司制）载体，所述pcDNA4/myc-His载体已插入了包含序列号263的源于鸡抗体的前导序列和包含序列号264的人IgG1H链恒定区。另外，将序列号44所示的鸡单克隆抗体＃1的轻链可变区基因扩增片段的两端用限制性酶处理后纯化，遵循常规方法插入这样的pcDNA3.1/myc-His（Invitrogen公司制）载体，所述pcDNA3.1/myc-His载体已插入了包含序列号263的源于鸡抗体的前导序列和包含序列号265的人IgG1L链恒定区。

[0249] 随后，将插入了序列号40所示的鸡单克隆抗体＃1的重链可变区的上述重组载体和插入了序列号44所示的鸡单克隆抗体＃1的轻链可变区的上述重组载体导入CHO-K1细胞（获自理研Cell Bank）。具体而言，将12孔培养板的每1孔中用1ml包含10％FBS的Ham氏F12培养基（Invitrogen公司制）培养的2×105个CHO-K1细胞使用PBS（-）洗净后，向每孔中新加入了1ml包含10％FBS的Ham氏F12培养基的孔中添加30μl溶解于OptiMEM（Invitrogen公司制）的上述各载体250ng和30μl Polyfect转染试剂（QIAGEN社制）的混合物。将导入了上述重组载体的CHO-K1细胞于添加了200μg/ml Zeocin（Invitrogen公司制）以及200μg/ml遗传霉素（Roche公司制）的包含10％FBS的Ham氏F12培养基中培养后，将上述导入了重组载体的CHO-K1细胞以96孔板中每孔中0.5个细胞那样播种，制备稳定产生具有鸡单克隆抗体＃1可变区的人-鸡嵌合抗体＃1（＃1）的细胞株。与上述方法同样地对鸡单克隆抗体＃2和＃3制备稳定产生人-鸡嵌合抗体＃2（＃2）和人-鸡嵌合抗体＃3（＃3）的细胞株。

[0250] 将制备的细胞株使用150cm2瓶以5×105个/ml在30ml不含血清的OptiCHO培养基（Invitrogen公司制）中培养5天，获得含有＃1、＃2或＃3的培养上清。

[0251] 同样地，将序列号40所示的鸡单克隆抗体＃1的重链可变区基因扩增片段的两端用限制性酶处理后纯化，遵循常规方法插入这样的pcDNA4/myc-His（Invitrogen公司制）载体，所述pcDNA4/myc-His载体已插入了源于鸡抗体的前导序列和小鼠IgG1H链恒定区。另外，将序列号44所示的鸡单克隆抗体＃1的轻链可变区基因扩增片段的两端用限制性酶处理后纯化，遵循常规方法插入这样的pcDNA3.1/myc-His（Invitrogen公司制）载体，所述pcDNA3.1/myc-His载体已插入了源于鸡抗体的前导序列和小鼠IgG1L链恒定区。与上述同样地将它们导入CHO-K1细胞，制备稳定产生具有鸡单克隆抗体＃1的可变区的小鼠-鸡嵌合抗体＃1的细胞株。与上述方法同样地，对鸡单克隆抗体＃2和＃3制备稳定产生小鼠-鸡嵌合抗体＃2（＃2）和小鼠-鸡嵌合抗体＃3（＃3）的细胞株。

[0252] 将制备的细胞株使用150cm2瓶以5×105个/ml在30ml不含血清的OptiCHO培养基（Invitrogen公司制）中培养5天，获得含有小鼠-鸡嵌合抗体＃1、小鼠-鸡嵌合抗体＃2和小鼠-鸡嵌合抗体＃3的培养上清。

[0253] （3）使用了获得的单克隆抗体的胰癌细胞表面的CAPRIN-1表达

[0254] 接下来，对确认了CAPRIN-1基因表达的4种胰癌细胞株（Capan-2、MIAPaCa-2、PANC-1、BxPC-3），研究其细胞表面上是否表达CAPRIN-1蛋白质。将各细胞株的分别106个细胞于1.5ml容积的微量离心管离心分离。向其添加包含实施例4制备的、与癌细胞表面反应的＃1至＃22的针对CAPRIN-1的小鼠单克隆抗体和上述（2）制备的针对CAPRIN-1的小鼠-鸡嵌合抗体＃1、小鼠-鸡嵌合抗体＃2、小鼠-鸡嵌合抗体＃3的培养上清（100μl），冰上静置1小时。用PBS洗净后，悬浮于用包含0.1％FBS的PBS500倍稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体（Invitrogen公司制）中，冰上静置1小时。PBS洗净后，用Becton Dickinson株式会社的FACS Calibur测定荧光强度。另一方面，替代包含＃1至＃22的针对CAPRIN-1的小鼠单克隆抗体和小鼠-鸡嵌合抗体＃1、小鼠-鸡嵌合抗体＃2、小鼠-鸡嵌合抗体＃3的培养上清，使用同种型对照抗体进行与上述同样的操作，作为对照。其结果是，与对照相比较，添加了＃1-＃22的单克隆抗体、小鼠-鸡嵌合抗体＃1、小鼠-鸡嵌合抗体＃2、小鼠-鸡嵌合抗体＃3的细胞的荧光强度均加强20％以上。具体举例如下，在使用小鼠-鸡嵌合抗体＃1的情形，Capan-2、MIAPaCa-2、PANC-1、BxPC-3均显示200％以上的荧光强度增强。由此确认了上述人胰癌细胞株的细胞膜表面上表达CAPRIN-1蛋白。另外，上述荧光强度的增强率利用各细胞的平均荧光强度(MFI值)的增加率表示，通过以下计算式来算出。

[0255] 平均荧光强度的增加率(荧光强度的增强率)(％)＝((与抗人CAPRIN-1抗体反应的细胞的MFI值)－(对照MFI值))÷(对照MFI值)×100。

[0256] （4）针对CAPRIN-1的抗体对人胰癌细胞的抗肿瘤效果（ADCC活性）

[0257] 在上述获得的抗体中，使用人-鸡嵌合抗体＃1来评价对人胰癌细胞的细胞毒活性（ADCC活性）。使用Hitrap ProteinA SepharoseFF（GE Healthecare公司制）纯化包含上述（2）获得的人-鸡嵌合抗体＃1的培养上清，替换为PBS(-)，将用0.22μm的过滤器(Millipore公司制)过滤而得的产物用作活性测定用的抗体。将106个人胰癌细胞株MIAPaCa-2和Capan-2收集到50ml容量的离心管中，加入100μCi的铬51，在37℃孵育2小时。然后用含有10％FBS的RPMI1640培养基洗涤3次，向96孔V底板中每孔添加各2×103个细胞，作为靶细胞。向其中每孔添加上述纯化抗体1.2μg，进一步地，自人外周血淋巴细胞使用以下手法分离包含人NK细胞的细胞群。即，将人外周血单个核细胞与FITC荧光色素标记的抗体（抗人CD3抗体、抗人CD20抗体、抗人CD19抗体、抗人CD11c抗体、抗HLA-DR抗体（Becton&Dickinson公司））反应，使用Cell Sorter（FACS Vantage SE（Becton&Dickinson公司））获得了分离的不被上述抗体染色的包含NK细胞的细胞群，或者使用人NK细胞分离试剂盒（NK细胞分离试
5
剂盒（Miltenyi公司制）），获得了分离物。将获得的包含NK细胞的细胞以每孔2×10个添加，在37℃、5％CO2的条件下培养4小时。培养后，测定从受到破坏的肿瘤细胞中释放至培养上清液中的铬51的量，算出抗CAPRIN-1抗体对胰癌细胞的ADCC活性。作为其结果，对于MIAPaCa-2，虽然CAPRIN-1蛋白自体有反应，但是在与癌细胞的细胞表面不反应的单克隆抗体和不添加抗体的情形，细胞毒活性不到5％，而与此相反，人-鸡嵌合抗体＃1获得了32％的细胞毒活性。另外，对于Capan-2，虽然CAPRIN-1蛋白自体有反应，但是在与癌细胞的细胞表面不反应的单克隆抗体和不添加抗体的情形，细胞毒活性不到5％，而与此相反，人-鸡嵌合抗体＃1获得了20％以上的细胞毒活性。另外，对于＃1－＃22的针对CAPRIN-1的小鼠单克隆抗体、人-鸡嵌合抗体＃2和人-鸡嵌合抗体＃3，也与上述同样地研究了对MIAPaCa-2和Capan-2的细胞毒活性，虽然CAPRIN-1蛋白自体有反应，但是在与癌细胞的细胞表面不反应的单克隆抗体和不添加抗体的情形，对任一胰癌细胞的细胞毒活性均不到5％，与此相反，＃1－＃22的针对CAPRIN-1的小鼠单克隆抗体、人-鸡嵌合抗体＃2和人-鸡嵌合抗体＃3观察到了10％以上的细胞毒活性。以上结果显示了，获得的抗CAPRIN-1单克隆抗体通过ADCC活性破坏表达CAPRIN-1的癌细胞。另外，细胞毒活性是如上所述的那样，将本发明使用的针对CAPRIN-1的抗体、包含人NK细胞的细胞群和摄入了铬51的2×103个肿瘤细胞混合并培养4小时，培养后测定释放至培养基的铬51量，通过以下计算式＊算出的显示针对肿瘤细胞的细胞毒活性的结果。

[0258] ＊式：细胞毒活性（％）＝自添加了针对CAPRIN-1的抗体和包含人NK细胞的细胞群时的肿瘤细胞的铬51游离量÷自添加了1N盐酸的肿瘤细胞的铬51游离量×100

[0259] [实施例7]在小鼠体内抗CAPRIN-1单克隆抗体的抗肿瘤效果

[0260] 随后，在荷癌小鼠体内评价了获得的针对CAPRIN-1的单克隆抗体（人-鸡嵌合抗体＃1）的抗肿瘤效果。使用的抗体是与上述同样地经柱纯化培养上清后的物质。

[0261] 使用移植了表达CAPRIN-1的人胰癌细胞株Capan-2的荷癌Balb/c裸小鼠，研究针对CAPRIN-1的单克隆抗体的抗肿瘤效果。向6只Balb/c裸小鼠（日本SLC社制）的腹部皮下每只移植5×106个Capan-2细胞（购自ATCC），成长至肿瘤直径5mm左右的大小。其中，对3只荷癌小鼠，每只腹腔内施与针对CAPRIN-1的单克隆抗体200μg（200μl）。此后，一周2次地将同量的抗体施与荷癌小鼠的腹腔，每日计测肿瘤大小，观察抗肿瘤效果。另一方面，对剩下的3只荷癌小鼠，替代抗体，施与PBS（-），以它们作为对照组。其结果是，将对照组的肿瘤体积计为100％时，＃1－＃22的针对CAPRIN-1的小鼠单克隆抗体施与组在抗体施与后第27天肿瘤退缩至84％，第35天抑制肿瘤的增殖至75％。对人-鸡嵌合抗体＃1、＃2和＃3也进行了与上述同样的评价，结果是任一抗体施与后第27天均抑制肿瘤增殖至80％。由该结果，显示了获得的针对CAPRIN-1的抗体对于表达CAPRIN-1的人胰癌细胞发挥体内抗肿瘤效果。另外，肿瘤的大小使用0.5×（长径×短径×短径）的计算式来算出体积。

[0262] [实施例8]与癌细胞的细胞表面反应的针对CAPRIN-1的抗体所结合的CAPRIN-1蛋白质中的肽的鉴定

[0263] 使用上述获得的、与癌细胞的细胞表面反应的＃12-＃22的针对CAPRIN-1的单克隆抗体，进行它们识别的CAPRIN-1蛋白质中的部分序列的鉴定。

[0264] 首先，向用PBS以1μg/μl的浓度溶解了重组CAPRIN-1蛋白质溶液100μl中添加DTT（Fluka公司制），以使终浓度为10mM，在95℃反应5分钟，进行CAPRIN-1蛋白质内的二硫键的还原，接着添加终浓度为20mM的碘乙酰胺（和光纯药公司制），在37℃、避光条件下进行30分钟的硫醇基的烷基化反应。在得到的还原烷基化CAPRIN-1蛋白质40μg中分别添加50μg＃12-＃22的针对CAPRIN-1的单克隆抗体，定容至20mM磷酸缓冲液（pH7.0）1ml，一边搅拌混合一边在4℃反应一夜。

[0265] 接着，添加胰蛋白酶（Promega公司制），以使终浓度为0.2μg，在37℃反应1小时、2小时、4小时、12小时后，在预先用含有1％BSA（Sigma公司制）的PBS封闭，用PBS洗涤了的蛋白质A-玻璃珠（GE公司制）和1mM碳酸钙、NP-40缓冲液（20mM磷酸缓冲液（pH7.4）、5mM EDTA、150mM NaCl、1％NP-40）中混合，分别反应30分钟。

[0266] 将反应液用25mM碳酸铵缓冲液（pH8.0）洗涤后，使用0.1％甲酸100μl洗脱抗原抗体复合物，对于洗脱液，使用Q-TOF Premier（Waters-MicroMass公司制）进行LC-MS分析。分析按照仪器附带的说明书进行。

[0267] 作为其结果，作为＃12－＃22的针对CAPRIN-1的单克隆抗体都识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定为序列号273的多肽。进一步地，鉴定到单克隆抗体＃13－＃16、＃17－＃19和＃21识别作为上述序列号273多肽中的部分序列的序列号274的肽，进一步地判定了单克隆抗体＃13－＃16识别作为其部分序列的肽－序列号275的肽。

[0268] 另外，使用人-鸡嵌合单克隆抗体＃1、人-鸡嵌合单克隆抗体＃3、小鼠单克隆抗体＃1、＃2、＃3、＃4、＃5、＃6、＃7、＃8、＃9、＃10、＃11，进行了它们所识别的CAPRIN-1蛋白质中的表位肽的鉴定。合成了在人CAPRIN-1蛋白质的氨基酸序列中由12－16个氨基酸组成的93个候补肽，将它们用DMSO溶解为1mg/ml的浓度。

[0269] 将各肽溶解在0.1M碳酸钠缓冲液(pH值9.6)中，使其形成30μg/ml的浓度，向96孔板(Nunc公司制、制品编号：436006)的每孔中各添加100μl，在4℃静置一夜。丢弃液体，每孔各添加200μl10mM乙醇胺/0.1M碳酸钠缓冲液(PH9.6)，在室温静置1小时后，舍弃液体，利用含有0.5％吐温20的PBS(PBST)洗涤2次，由此制作将各肽固相化了的板。

[0270] 向其中以每孔50μl的量添加包含人-鸡嵌合单克隆抗体＃1（＃1）、人-鸡嵌合单克隆抗体＃3（＃3）和小鼠单克隆抗体（＃1、＃2、＃3、＃4、＃5、＃6、＃7、＃8、＃9、＃10、＃11）的细胞培养上清液，在室温振摇1小时后，除去液体，利用PBST洗涤3次。接着，分别对人-鸡嵌合单克隆抗体孔添加50μl用PBST稀释了3000－4000倍的HRP标记的抗人IgG（Invitrogen公司制）抗体作为2次抗体溶液；对小鼠单克隆抗体添加50μl用PBST稀释了3000－4000倍的HRP标记的抗小鼠IgG（Invitrogen公司制）抗体作为2次抗体溶液，然后除去液体，利用PBST洗涤6次。

[0271] 以每孔100μl的量添加TMB底物溶液(Thermo公司制)，并静置15～30分钟，进行显色反应。在颜色显现后，以每孔100μl的量添加1N硫酸以终止反应，使用吸光度计测定450nm和595nm的吸光度值。其结果是，作为任一抗CAPRIN-1抗体的人-鸡嵌合单克隆抗体＃1、抗体＃1－＃5的针对CAPRIN-1的单克隆抗体所识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定为序列号266的多肽。进一步地，作为人-鸡嵌合单克隆抗体＃1、小鼠单克隆抗体＃3和＃4所识别的、上述序列号266的多肽中的部分序列，鉴定为序列号267的肽；作为小鼠单克隆抗体＃1、＃2和＃5所识别的、上述序列号266的多肽中的部分序列，鉴定为序列号268的肽。因此，判定序列号266的多肽包含抗CAPRIN-1抗体的人-鸡嵌合单克隆抗体＃1、小鼠单克隆抗体＃1、＃
2、＃3、＃4和＃5的表位区域。另外，作为任一抗CAPRIN-1单克隆抗体＃6、＃7和＃8所识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定为包含序列号270的氨基酸序列的多肽。因此，判定序列号270的多肽包含抗CAPRIN-1抗体＃6、＃7和＃8的表位区域。另外进一步地，作为任一抗CAPRIN-
1单克隆抗体＃9、＃10和＃11所识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定为包含序列号272的氨基酸序列的多肽。因此，判定序列号272的多肽包含抗CAPRIN-1抗体＃9、＃10和＃11的表位区域。另外进一步地，作为人-鸡嵌合单克隆抗体＃3所识别的CAPRIN-1的部分序列，鉴定为包含序列号269的氨基酸序列的多肽。因此，判定序列号269的多肽包含人-鸡嵌合单克隆抗体＃3的表位区域。

[0272] 产业可利用性

[0273] 本发明的抗体可用于胰癌的治疗和/或预防。

[0274] 将本说明书中引用的所有刊物、专利和专利申请直接作为参考引入本说明书中。

[0275] 序列表独立文本

[0276] 序列号31－36、130、257－262：引物