实施方式涉及对于样本的核酸分析法。核酸分析法包括：将样本用第1引物和第2引物进行扩增反应，使扩增反应产物与核酸探针反应，测定杂交的有无和/或量，确定样本中的目标核酸的有无和/或存在量。由第1引物和/或第2引物产生的扩增产物形成茎环结构体。通过检出与环结构的序列互补的核酸探针和扩增产物的杂交的有无和/或存在量，来对于样本进行核酸分析。
1.非诊断治疗目的的核酸分析法，是对于样本的核酸分析法，目标核酸包含第1模板核酸和第2模板核酸，
所述第1模板核酸包含位于3’端的第1序列、与该第1序列的5’侧邻接的第1模板序列、和与该第1模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第2序列，以及所述第2模板核酸是所述第1模板核酸的互补链，包含位于其3’端的第3序列、与该第3序列的5’侧邻接的第2模板序列、和与该第2模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第
该核酸分析法具备以下(a-1)、(a-2)、(b)、(c)、(d)和(e)的工序：(a-1)准备用于扩增所述第1模板核酸和所述第2模板核酸的第1引物和第2引物，这里，所述第1引物包含作为所述第1序列的互补序列的S1序列、和与所述S1序列的5’端侧连接的S2序列，所述S2序列是作为所述第1模板序列的至少一部分的与所述第1序列的5’侧邻接或位于所述第1序列的5’侧的附近的序列，以及所述第2引物包含作为所述第3序列的互补序列的S3序列，并且
与所述第1引物的延伸链对应的第1复制链，在其同一链上形成第1茎环结构体，该第
1茎环结构体含有：包含第1茎部分的第1双链区域、和构成第1环部分的第1单链区域，所述第1双链区域包含来源于所述S2序列的第1茎部分和与该第1茎部分互补的来源于所述第1模板序列的互补序列的序列，所述构成第1环部分的第1单链区域包含所述S1序列，以及与所述第2引物的延伸链对应的第2复制链，在其同一链上形成第2茎环结构体，该第
2茎环结构体含有：包含第2茎部分的第2双链区域、 和构成第2环部分的第2单链区域，所述第2双链区域包含来源于所述S2序列的互补序列的第2茎部分和与该第2茎部分互补的来源于所述第2模板序列的互补序列的序列，所述构成第2环部分的第2单链区域包含所述S1序列的互补序列，(a-2)准备用于检出所述第1复制链和/或所述第2复制链的第1核酸探针和/或第
所述第1核酸探针是所述第1复制链的所述构成第1环部分的第1单链区域的至少一部分的序列或其互补序列，所述第2核酸探针是所述第2复制链的所述构成第2环部分的第2单链区域的至少一部分的序列或其互补序列，(b)使用所述第1引物和第2引物来扩增所述样本，
(c)使所述(b)中获得的扩增产物与所述第1核酸探针和/或第2核酸探针反应，(d)检出所述第1核酸探针和/或第2核酸探针与所述扩增产物的杂交的有无，和/或测定杂交量，(e)基于所述(d)的结果，确定所述样本中的目标核酸的有无，和/或确定存在量。
2.根据权利要求1所述的非诊断治疗目的的核酸分析法，所述扩增是PCR扩增反应。
3.根据权利要求2所述的非诊断治疗目的的核酸分析法，所述核酸探针被固定化于基体上。
4.根据权利要求3所述的非诊断治疗目的的核酸分析法，所述被固定化于基体上的核酸探针与所述扩增产物的杂交的检出和/或定量，使用显示电化学活性的嵌入剂来进行。
5.根据权利要求4所述的非诊断治疗目的的核酸分析法，所述样本包含基因，该分析的对象是该基因。
6.检测试剂盒，是用于在核酸分析法中使用的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含引物组和核酸探针，
由所述引物组扩增的第1模板核酸包含位于3’端的第1序列、与该第1序列的5’侧邻接的第1模板序列、和与该第1模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第2序列，以及由所述引物组扩增的第2模板核酸是所述第1模板核酸的互补链，包含位于其3’端的第3序列、与该第3序列的5’侧邻接的第2模板序列、和与该第2模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第4序列，所述引物组包含第1引物和第2引物，
所述第1引物包含作为所述第1序列的互补序列的S1序列、和与所述S1序列的5’端侧连接的S2序列，所述S2序列是作为所述第1模板序列的至少一部分的与所述第1序列的5’侧邻接或位于所述第1序列的5’侧的附近的序列，以及所述第2引物包含作为所述第3序列的互补序列的S3序列，所述核酸探针从以下的组中选择至少1种：
包含所述S1序列的至少一部分的序列的第1核酸探针，和
包含所述S1序列的互补序列的至少一部分的序列的第2核酸探针，所述核酸分析法，是对于样本的核酸分析法，
该核酸分析法具备以下(a)、(b)、(c)和(d)的工序：(a)使用所述第1引物和第2引物来扩增所述样本，
(b)使所述(a)中获得的扩增产物与所述第1核酸探针和/或第2核酸探针反应，(c)检出所述第1核酸探针和/或第2核酸探针与所述扩增产物的杂交的有无，和/或测定杂交量，(d)基于所述(c)的结果，确定所述样本中的目标核酸的有无，和/或确定存在量，其中，与所述第1引物的延伸链对应的第1复制链，在其同一链上形成第1茎环结构体，该第1茎环结构体含有：包含第1茎部分的第1双链 区域、和构成第1环部分的第1单链区域，所述第1双链区域包含来源于所述S2序列的第1茎部分和与该第1茎部分互补的来源于所述第1模板序列的互补序列的序列，所述构成第1环部分的第1单链区域包含所述S1序列，以及与所述第2引物的延伸链对应的第2复制链，在其同一链上形成第2茎环结构体，该第
2茎环结构体含有：包含第2茎部分的第2双链区域、和构成第2环部分的第2单链区域，所述第2双链区域包含来源于所述S2序列的互补序列的第2茎部分和与该第2茎部分互补的来源于所述第2模板序列的互补序列的序列，所述构成第2环部分的第2单链区域包含所述S1序列的互补序列，这里，所述第1核酸探针是所述第1复制链的所述构成第1环部分的第1单链区域的至少一部分的序列或其互补序列，所述第2核酸探针是所述第2复制链的所述构成第2环部分的第2单链区域的至少一部分的序列或其互补序列。
7.非诊断治疗目的的核酸分析法，是对于样本的核酸分析法，目标核酸包含第1模板核酸和第2模板核酸，
所述第1模板核酸包含位于3’端的第1序列、与该第1序列的5’侧邻接的第1模板序列、和与该第1模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第2序列，以及所述第2模板核酸是所述第1模板核酸的互补链，包含位于其3’端的第3序列、与该第3序列的5’侧邻接的第2模板序列、和与该第2模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第
该核酸分析法具备以下(a-1)、(a-2)、(b)、(c)、(d)和(e)的工序：(a-1)准备用于扩增所述第1模板核酸和所述第2模板核酸的第1引物和第2引物，这里，所述第1引物包含作为所述第1序列的互补序列的S1序列、和与所述S1序列的5’侧连接的S2序列，所述S2序列是作为所述第1模板序列的至 少一部分的、与所述第1序列的5’侧邻接或位于所述第1序列的5’侧的附近的序列，所述第2引物包含作为所述第3序列的互补序列的S3序列、和与所述S3序列的5’侧连接的S4序列，所述S4序列是作为所述第2模板序列的至少一部分的、与所述第3序列的
5’侧邻接或位于所述第3序列的5’侧的附近的序列，
与所述第1引物的延伸链对应的第1复制链，在其同一链上形成第1茎环结构体，该第
1茎环结构体含有：包含第1茎部分的第1双链区域、和构成第1环部分的第1单链区域，所述第1双链区域包含来源于所述S2序列的第1茎部分和与该第1茎部分互补的来源于所述第1模板序列的互补序列的序列，所述构成第1环部分的第1单链区域包含所述S1序列，与所述第1引物的延伸链对应的第2复制链，在其同一链上形成第2茎环结构体，该第
2茎环结构体含有：包含第2茎部分的第2双链区域、和构成第2环部分的第2单链区域，所述第2双链区域包含来源于所述S4序列的互补序列的第2茎部分和与该第2茎部分互补的来源于所述第1模板序列的互补序列的序列，所述构成第2环部分的第2单链区域包含所述S3序列的互补序列，与所述第2引物的延伸链对应的第3复制链，在其同一链上形成第3茎环结构体，该第
3茎环结构体含有：包含第3茎部分的第3双链区域、和构成第3环部分的第3单链区域，所述第3双链区域包含来源于所述S4序列的第3茎部分和与该第3茎部分互补的来源于所述第2模板序列的互补序列的序列，所述构成第3环部分的第3单链区域包含所述S3序列，与所述第2引物的延伸链对应的第4复制链，在其同一链上形成第4茎环结构体，该第
4茎环结构体含有：包含第4茎部分的第4双链区域、和构成第4环部分的第4单链区域，所述第4双链区域包含来源于所述S2序列的互补序列的第4茎部分和与该第4茎部分互补的来源于所述第2模板序列的互补序列的序列，所述构成第4环部分的第4单链区域包含所述 S1序列的互补序列，(a-2)准备用于检出所述第1复制链和/或所述第2复制链的、选自第1核酸探针、第
2核酸探针、第3核酸探针和第4核酸探针中的至少1种探针，这里，
所述第1核酸探针包含作为所述第1复制链的所述构成第1环部分的第1单链区域的至少一部分的序列的、所述S1序列的互补序列的至少一部分的序列，所述第2核酸探针包含作为所述第2复制链的所述构成第2环部分的第2单链区域的至少一部分的序列的、所述S3序列的至少一部分的序列，所述第3核酸探针包含作为所述第3复制链的所述构成第3环部分的第3单链区域的至少一部分的序列的、所述S3序列的互补的序列的至少一部分的序列，所述第4核酸探针包含作为所述第4复制链的所述构成第4环部分的第4单链区域的至少一部分的序列的、所述S1序列的至少一部分的序列，(b)使用所述第1引物和第2引物来扩增所述样本，
(c)使所述(b)中获得的扩增产物与所述第1核酸探针、第2核酸探针、第3核酸探针和第4核酸探针中的至少1种探针反应，(d)检出由所述(c)的反应生成的杂交的有无，和/或测定杂交量，(e)基于所述(d)的结果，确定所述样本中的目标核酸的有无，和/或确定存在量。
8.根据权利要求7所述的非诊断治疗目的的核酸分析法，所述扩增是PCR扩增反应。
9.根据权利要求8所述的非诊断治疗目的的核酸分析法，所述核酸探针被固定化于基体上。
10.根据权利要求9所述的非诊断治疗目的的核酸分析法，所述被固定化于基体上的核酸探针与所述扩增产物的杂交的检出和/或定量，使用显示电化学活性的嵌入剂来进行。
11.根据权利要求10所述的非诊断治疗目的的核酸分析法，所述样本包含基因，该分析的对象是该基因。
12.检测试剂盒，是用于在核酸分析法中使用的检测试剂盒，所述检测试剂盒包含引物组和核酸探针，
由所述引物组扩增的第1模板核酸包含位于3’端的第1序列、与该第1序列的5’侧邻接的第1模板序列、和与该第1模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第2序列，以及由所述引物组扩增的第2模板核酸是所述第1模板核酸的互补链，包含位于其3’端的第3序列、与该第3序列的5’侧邻接的第2模板序列、和与该第2模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第4序列，所述引物组包含第1引物和第2引物，
所述第1引物包含作为所述第1序列的互补序列的S1序列、和与所述S1序列的5’侧连接的S2序列，所述S2序列是作为所述第1模板序列的至少一部分的、与所述第1序列的
5’侧邻接或位于所述第1序列的5’侧的附近的序列，
所述第2引物包含作为所述第3序列的互补序列的S3序列、和与所述S3序列的5’侧连接的S4序列，所述S4序列是作为所述第2模板序列的至少一部分的、与所述第3序列的
5’侧邻接或位于所述第3序列的5’侧的附近的序列，
包含所述S1序列的互补序列的至少一部分的序列的核酸探针，包含所述S3序列的至少一部分的序列的核酸探针，和
包含所述S3序列的互补序列的至少一部分的序列的核酸探针；
该核酸分析法具备以下(a)、(b)、(c)和(d)的工序：(a)使用所述第1引物和第2引物来扩增所述样本，
(b)使所述(a)中获得的扩增产物与第1核酸探针、第2核酸探针、第3核酸探针和第
(c)检出由所述(b)的反应生成的杂交的有无，和/或测定杂交量，(d)基于所述(c)的结果，确定所述样本中的目标核酸的有无，和/或确定存在量，这里，与所述第1引物的延伸链对应的第1复制链，在其同一链上形成第1茎环结构体，该第
1茎环结构体含有：包含第1茎部分的第1双链区域、和构成第1环部分的第1单链区域，所述第1双链区域包含来源于所述S2序列的第1茎部分和与该第1茎部分互补的来源于所述第1模板序列的互补序列的序列，所述构成第1环部分的第1单链区域包含所述S1序列，与所述第1引物的延伸链对应的第2复制链，在其同一链上形成第2茎环结构体，该第
2茎环结构体含有：包含第2茎部分的第2双链区域、和构成第2环部分的第2单链区域，所述第2双链区域包含来源于所述S4序列的互补序列的第2茎部分和与该第2茎部分互补的来源于所述第1模板序列的互补序列的序列，所述构成第2环部分的第2单链区域包含所述S3序列的互补序列，与所述第2引物的延伸链对应的第3复制链，在其同一链上形成第3茎环结构体，该第
3茎环结构体含有：包含第3茎部分的第3双链区域、和构成第3环部分的第3单链区域，所述第3双链区域包含来源于所述S4序列的第3茎部分和与该第3茎部分互补的来源于所述第2模板序列的互补序列的序列，所述构成第3环部分的第3单链区域包含所述S3序列，与所述第2引物的延伸链对应的第4复制链，在其同一链上形成第4茎环结构体，该第
4茎环结构体含有：包含第4茎部分的第4双链区域、和构成第4环部分的第4单链区域，所述第4双链区域包含来源于所述S2序列的互补序列的第4茎部分和与该第4茎部分互补的来源于所述第2模板序列的互补序列的序列，所述构成第4环部分的第4单链区域包含所述S1序列的互补序列，这里，
所述第1核酸探针包含作为所述第1复制链的所述构成第1环部分的第1单链区域的至少一部分的序列的、所述S1序列的互补序列的至少一部分的序列，所述第2核酸探针包含作为所述第2复制链的所述构成第2环部分的第2单链区域的至少一部分的序列的、所述S3序列的至少一部分的序列，所述第3核酸探针包含作为所述第3复制链的所述构成第3环部分的第3单链区域的至少一部分的序列的、所述S3序列的互补的序列的至少一部分的序列，所述第4核酸探针包含作为所述第4复制链的所述构成第4环部分的第4单链区域的至少一部分的序列的、所述S1序列的至少一部分的序列。
核酸分析法
技术领域
[0001] 本发明的实施方式涉及核酸分析法。
背景技术
[0002] 在基因分析中，作为检出或定量具有特定序列的核酸的一般手法之一，有使用PCR扩增法的方法。在该方法中，将样本进行PCR扩增之后，对于扩增产物检出特定序列的有无或定量其存在量。
[0003] 在PCR扩增法中，使用用于扩增要检出或定量的目的序列的引物组，以样本所含的核酸作为模板核酸进行扩增。所得的扩增产物通过热处理等分解或分离成单链之后，例如，与用于检出目的序列的核酸探针反应。以由此生成的杂交的有无或量作为指标而最终实现目的序列的检出和/或定量。
[0004] 来自扩增产物的单链具有通过其序列而形成二级结构的倾向。另外，通过PCR扩增法获得的扩增产物包含彼此互补的双链。因此，为了供于检出和/或定量而被单链化，但单链化后的样品中存在包含彼此互补的序列的二种单链。因此，检出和/或定量中或检出和/或定量以前，有在样品中相遇的互补链彼此之间自发地形成双链的倾向。关于单链的这些倾向，可能在进行检出和/或定量上形成障碍。
发明内容
[0005] 发明所要解决的课题
[0006] 本发明所要解决的课题是提供能够正确、简便且短时间地进行的核酸分析法。
[0007] 用于解决课题的方法
[0008] 实施方式涉及对于样本的核酸分析法。核酸分析法包括：将样本用第1引物和第2引物进行扩增反应，使扩增反应产物与核酸探针反应，测定杂交的有无和/或量，确定样本中的目标核酸的有无和/或存在量。由第1引物和/或第2引物产生的扩增产物形成茎环结构体。通过检出与环结构的序列互补的核酸探针和扩增产物的杂交的有无和/或存在量，来对于样本进行核酸分析。
附图说明
[0009] 图1是显示实施方式中的扩增工序的1例的模式图。
[0010] 图2是显示实施方式中的扩增工序的1例的模式图。
[0011] 图3是显示实施方式中的扩增工序的1例的模式图。
[0012] 图4是显示实施方式中的扩增工序的1例的模式图。
[0013] 图5是显示实施方式中的扩增工序的1例的模式图。
[0014] 图6是显示实施方式中的扩增工序的1例的模式图。
[0015] 图7是显示实施例1的引物和探针的设计位置的图。
[0016] 图8是显示实施例1的电泳结果的图。
[0017] 图9是显示实施例1的检出结果的图。
[0018] 图10是显示实施例2的检出结果的图。
[0019] 图11是显示实施例2的检出结果的图。
[0020] 图12是显示实施例3的检出结果的图。
[0021] 图13是显示实施方式中的DNA芯片的1例的图。
[0022] 图14是显示实施方式中的DNA芯片的1例的图。
具体实施方式
[0023] 以下，对于本发明的实施方式进行详细说明。
[0024] [定义]
[0025] “扩增”或“扩增反应”是指使用引物组反复复制模板核酸，包含延伸工序和扩增工序等工序。扩增基本上可以是能够使用包含2种引物、例如正向引物和反向引物的引物组复制模板核酸的、其本身公知的任何方法。例如，优选PCR扩增方法、LCR扩增方法、RCA扩增方法、TMA扩增方法、NASBA扩增方法、SDA扩增方法和ICAN扩增方法。另外，根据需要，可以与该扩增反应同时组合进行使用逆转录酶的逆转录反应。同时进行扩增反应和逆转录反应的技术可以利用其本身公知的任何技术。
[0026] “核酸”是概括地表示DNA、RNA、PNA、LNA、S-寡核苷酸、膦酸甲酯寡核苷酸等可以将其一部分结构用碱基序列表示的物质的术语。例如，核酸可以是来源于天然的DNA和RNA等、一部分或完全人工合成和/或设计的人工核酸等、以及它们的混合物等。
[0027] “样本”是指应按照本实施方式进行分析方法的对象，只要是可能包含核酸的样品就可以。样本优选是不妨碍扩增反应和/或杂交反应的状态。例如，为了将从生物体等获得的材料作为按照本实施方式的样本使用，可以通过其本身公知的任何手段进行前处理。例如，样本可以是液体。
[0028] 将样本所含的核酸称为“受检核酸”。将样本核酸中包含要与引物退火而进行复制的多核苷酸的核酸称为“模板”。将模板中由引物组所含的2种引物所规定的部分称为“模板核酸”。进而对于“模板核酸”，将除了引物的结合区域(也称为“退火区域”)以外的区域在这里称为“模板序列”。
[0029] “目标序列”是要使用核酸探针进行检出或定量的序列。
[0030] “目标核酸”是包含目标序列的核酸，且是指在由引物从模板核酸复制出的核酸中的包含目标序列的核酸。在利用引物的复制是延伸的情况下，是包含目标序列的延伸产物，在利用引物的复制是扩增的情况下，是指包含目标序列的“扩增产物”。另外，也将“延伸产物”和“扩增产物”称为“复制链”。
[0031] “核酸探针”是包含相对于目标序列为互补的序列的核酸。核酸探针可以以游离的状态使用，也可以固定化于其本身公知的固相。优选的核酸探针被固定化于基体表面而使用。包含这样的基体、和被固定化于基体的核酸探针的装置一般可以通过DNA芯片来进行。
[0032] “DNA芯片”是利用具有与要检出的核酸互补的序列的核酸探针、和检出对象核酸之间的杂交反应，来分析核酸的装置。DNA芯片的术语与一般使用的“核酸芯片”、“微阵列”和“DNA阵列”等用语同义，可以互换地使用。
[0033] “来源于模板序列的序列”(或“来源于模板序列的互补序列的序列”)，是指反映了关于在引物组分别与模板核酸(或其互补序列)退火之后、由这些引物所规定的模板序列(或其互补序列)所含的区域的序列的序列信息，即，关于碱基序列和/或其序列的方向等信息的序列。
[0034] “互补”和“互补链”可以在2个单链核酸彼此具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的互补性的情况下使用。“同源”和“同源链”可以在2个单链核酸彼此具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或100％的同源性的情况下使用。
[0035] (1)模板核酸
[0036] 首先，在进行实施方式的核酸分析方法之前调制样本。样本只要是可能包含核酸、希望对于其中所含的核酸进行分析的对象即可。样本需要在其中适当地进行扩增反应，因而根据需要可以对于从要分析的对象得到的粗样本进行前处理而作为样本，另外，在适合扩增反应的情况下，也可以不进行前处理而将粗样本直接作为样本使用。
[0037] 在样本中存在具有要分析的序列的核酸的情况下，它们被作为最初的模板核酸使用。被作为模板核酸使用的受检核酸可以是单链也可以是双链。即使在假设对于单链的受检核酸开始扩增的情况下，扩增过程中其互补链也被复制。因此，当初存在的模板核酸作为第1模板核酸发挥功能，被复制，在扩增过程中形成的该模板核酸的互补链作为第2模板核酸发挥功能。
[0038] (2)茎环结构体
[0039] 茎环结构体具有例如在图1中用符号110表示的分子内结构，具有单链环部分和包含茎部分的双链部分。
[0040] 在本实施方式中，形成2种茎环结构体。1种是前述的符号110所示的、具有存在于5’末端侧的茎部分、与该茎部分的3’侧邻接的环部分、以及包含与该茎部分互补的序列的存在于3’末端侧的双链部分、和直链的单链部分的茎环结构体(图1)。另一种是符号115所示的茎环结构体。该茎环结构体含有：包含环部分的单链区域、和包含茎部分的双链区域。这2种茎环结构体可以通过使用包含针对1种模板核酸的正向引物和反向引物的1组引物组进行扩增反应来获得。
[0041] (3)核酸分析法
[0042] 对于作为实施方式的1例的核酸分析法进行说明。
[0043] 成为分析的对象的样本首先被正向引物和反向引物扩增。接着，使由此得到的扩增产物与包含特定的目标序列的互补序列的核酸探针反应。进而，检出核酸探针与扩增产物的杂交，和/或测定杂交量。基于该结果，可以对于样本所含的受检核酸得到序列信息。
[0044] 另外，所分析的项目例如是基因表达量的测定、来源于病毒和/或细菌等的核酸等的定量、对于多态性的基因型的鉴定和/或突变有无的检出等。但不限于这些。
[0045] ＜扩增工序＞
[0046] 在扩增工序中，选择反映要在本分析中得到信息的指标核酸，基于此设计模板核酸。
[0047] 应被扩增的双链核酸101包含第1模板核酸102和作为其互补链的第2模板核酸。第1模板核酸102包含位于3’端的第1序列103a、与第1序列103a的5’侧邻接的第1模板序列105a、和与第1模板序列105a的5’侧邻接且位于5’端的第2序列104a。第2模板核酸包含位于3’端的第3序列104b、与第3序列104b的5’侧邻接的第2模板序列
105b、和与第2模板序列105b的5’侧邻接且位于5’端的第4序列103b。
[0048] 为了扩增这样的模板核酸，适宜选择正向引物和反向引物。在图1中，显示第1引物106、和第2引物109。第1引物106和第2引物109哪一个都可以是正向引物也可以是反向引物。任一情况下都可以通过同样的手续获得同样的扩增产物。
[0049] 另外第1引物106包含与第1模板核酸102的第1序列103a互补的S1序列、和与S1序列的5’侧邻接且连接于5’端侧的S2序列108。在扩增反应中，第1引物106与第1序列103a结合而被延伸，由此形成延伸链110。这里，S2序列108设计成具有与第1模板核酸102所含的模板序列105a的一部分互补的序列那样。
[0050] 另一方面，第2引物109在扩增反应中与第2模板核酸的第3序列104b结合而被延伸，由此形成延伸链(未图示)。
[0051] 第1引物106的延伸链110通过变性而分离出2条单链复制链，形成与第1引物的延伸链对应的第1复制链110。第1复制链110在反应液中自发地形成分子内结构。该分子内结构是茎环结构。第1复制链110中，在包含来源于第1引物的S2序列的茎部分108，与其互补序列、即作为第1模板序列的互补序列105b的一部分的S2’序列之间，形成双链区域。随着该双链区域的形成，单链的环部分111形成。环部分111可以包含来源于第1引物的S1序列、和第1模板序列的互补序列105b的一部分。
[0052] 环部分111所含的来源于第1模板序列的互补序列105b的序列的长度，通过选择第1引物的序列S2的序列来确定。即，根据S2序列相对于从第1序列103a的5’端在3’方向离开多远的位置的序列互补，来决定最终得到的茎环结构体的环部分所含的来源于模板序列的序列的长度。环部分的序列中，如后所述，被设计了通过核酸探针检出的目标序列。通过使目标序列包含来源于模板序列的序列，从而对于排除由于检出来源于未反应的引物的检出信号而引起的假阳性的检出结果是有利的。
[0053] 换言之，可以通过将位于第1序列103a的5’端的5’侧、在用“S2’”表示的S2’序列的3’端的3’侧存在的识别序列114的长度设定为多长，来选择环部分所含的来源于模板序列的序列的长度。识别序列114可以与S1序列的至少一部分的序列一起作为目标序列而被核酸探针检出。因此，进一步优选为能够识别为来源于模板序列的序列的长度。
[0054] 这样，在1种实施方式中的扩增工序中，记载了使作为复制链的茎环结构体的环部分包含作为来源于模板序列的序列的识别序列，进而使要用核酸探针检出的目标序列包含该识别序列的例子。然而，识别序列也可以不包含在环部分中。即，也可以以不存在识别序列、环部分不包含来源于识别序列的序列的方式设计引物组。例如，如果利用能够检出包含茎序列的双链那样的检出原理，则可以利用其双链序列的存在，来区别来源于未反应的引物的检出信号和来源于扩增产物的信号，从而检出。因此，识别序列未必是必须的。此时，包含茎序列的双链部分具有某种程度的长度，比具有较短的长度更为有利。
[0055] 例如，识别序列114可以为0个碱基以上、1个碱基以上、2个碱基以上、3个碱基以上、4个碱基以上、5个碱基以上、6个碱基以上、7个碱基以上、8个碱基以上、9个碱基以上、10个碱基以上、11个碱基以上、12个碱基以上、13个碱基以上、13个碱基以上、14个碱基以上、15个碱基以上、20个碱基以上、25个碱基以上、30个碱基以上或35个碱基以上，又可以为50个碱基以下、40个碱基以下、35个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下、20个碱基以下，也可以是将这些中任一下限值和上限值组合而得的范围。优选为20～80个碱基，更优选为30～50个碱基。另外，该长度也可以考虑要分析的模板核酸的长度来选择。
[0056] 模板核酸的长度，根据要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的检出工序中的检出原理等来适宜选择即可。例如，可以为15个碱基以上、20个碱基以上、25个碱基以上、30个碱基以上、35个碱基以上、40个碱基以上、45个碱基以上、50个碱基以上、60个碱基以上、70个碱基以上、80个碱基以上、90个碱基以上、100个碱基以上、150个碱基以上、200个碱基以上、250个碱基以上、300个碱基以上、400个碱基以上、500个碱基以上、600个碱基以上、800个碱基以上、900个碱基以上或1000个碱基以上，可以为1500个碱基以下、
1000个碱基以下、900个碱基以下、800个碱基以下、700个碱基以下、600个碱基以下、500个碱基以下、400个碱基以下、300个碱基以下、200个碱基以下、150个碱基以下、100个碱基以下、90个碱基以下、80个碱基以下、70个碱基以下、65个碱基以下、60个碱基以下、55个碱基以下、50个碱基以下、45个碱基以下、40个碱基以下、35个碱基以下、30个碱基以下、25个碱基以下、20个碱基以下或15个碱基，也可以是将这些中任一下限值和上限值组合而得的范围。优选为50～1000个碱基，更优选为100～300个碱基。
[0057] 另外，第1引物的长度，根据要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的检出工序中的检出原理等来适宜选择即可。第1引物的长度例如，可以为2个碱基以上、3个碱基以上、4个碱基以上、5个碱基以上、6个碱基以上、7个碱基以上、8个碱基以上、9个碱基以上、10个碱基以上、11个碱基以上、12个碱基以上、13个碱基以上、13个碱基以上、14个碱基以上、15个碱基以上、20个碱基以上、25个碱基以上、30个碱基以上、35个碱基以上、40个碱基以上、45个碱基以上、50个碱基以上、60个碱基以上、70个碱基以上、80个碱基以上、90个碱基以上、100个碱基以上、110个碱基以上、120个碱基以上、150个碱基以上或
200个碱基以上，又可以为200个碱基以下、150个碱基以下、130个碱基以下、120个碱基以下、110个碱基以下、100个碱基以下、90个碱基以下、80个碱基以下、70个碱基以下、60个碱基以下、50个碱基以下、40个碱基以下、35个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下、
20个碱基以下，也可以是将这些中任一下限值和上限值组合而得的范围。优选为20～100个碱基，更优选为30～60个碱基。或者，例如，第1引物的长度可以为13～40个碱基、例如15～30个碱基，也可以为16～47个碱基、例如18～37个碱基。
[0058] S1序列和S2序列的长度，分别可以为2个碱基以上、3个碱基以上、4个碱基以上、5个碱基以上、6个碱基以上、7个碱基以上、8个碱基以上、9个碱基以上、10个碱基以上、
11个碱基以上、12个碱基以上、13个碱基以上、13个碱基以上、14个碱基以上、15个碱基以上、20个碱基以上、25个碱基以上、30个碱基以上、35个碱基以上、40个碱基以上、45个碱基以上、50个碱基以上、60个碱基以上、70个碱基以上，又可以为80个碱基以下、75个碱基以下、70个碱基以下、65个碱基以下、60个碱基以下、55个碱基以下、50个碱基以下、45个碱基以下、40个碱基以下、35个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下、20个碱基以下，也可以是将这些中任一下限值和上限值组合而得的范围。优选为10～50个碱基，更优选为15～30个碱基。
[0059] 另外，第2引物的长度，例如，可以为2个碱基以上、3个碱基以上、4个碱基以上、5个碱基以上、6个碱基以上、7个碱基以上、8个碱基以上、9个碱基以上、10个碱基以上、11个碱基以上、12个碱基以上、13个碱基以上、13个碱基以上、14个碱基以上、15个碱基以上、
20个碱基以上、25个碱基以上、30个碱基以上、35个碱基以上、40个碱基以上、45个碱基以上、50个碱基以上、55个碱基以上、60个碱基以上、65个碱基以上、70个碱基以上、80个碱基以上、90个碱基以上、100个碱基以上、110个碱基，又可以为150个碱基以下、120个碱基以下、110个碱基以下、100个碱基以下、90个碱基以下、80个碱基以下、70个碱基以下、
60个碱基以下、50个碱基以下、40个碱基以下、35个碱基以下、30个碱基以下或25个碱基以下、20个碱基以下、15个碱基以下、10个碱基以下，也可以是将这些中任一下限值和上限值组合而得的范围。优选为10～100个碱基，更优选为15～60个碱基。或者，例如，第2引物的长度可以为13～40个碱基、例如15～30个碱基，也可以为16～47个碱基、例如
18～37个碱基。
[0060] 具有茎环结构的复制链的长度，根据要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的检出工序中的检出原理等来适宜选择即可。虽然不限于此，但例如，可以为约5个碱基以上、约10个碱基以上、约15个碱基以上、约20个碱基以上、约30个碱基以上、约35个碱基以上、约40个碱基以上、约45个碱基以上、约50个碱基以上、约55个碱基以上、约60个碱基以上或约65个碱基以上，又可以为约100个碱基以下、约95个碱基以下、约90个碱基以下、约85个碱基以下、约80个碱基以下、约75个碱基以下、约70个碱基以下、约65个碱基以下、约60个碱基以下、约55个碱基以下、约50个碱基以下、约45个碱基以下、约40个碱基以下、约35个碱基以下、约30个碱基以下、约25个碱基以下或约20个碱基以下，可以是将这些下限和上限的任一值组合而得的长度。例如，可以为约10个碱基～约80个碱基、约10个碱基～约60个碱基、约20个碱基～80个碱基、约20个碱基～60个碱基。例如，以能得到所需的分子内结构的方式设计即可。
[0061] 另外，茎环结构体中的包含茎部分的双链的长度，根据要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的检出工序中的检出原理等来适宜选择即可。虽然不限于此，但例如，可以为约5个碱基以上、约10个碱基以上、约15个碱基以上、约20个碱基以上、约30个碱基以上、约35个碱基以上、约40个碱基以上、约45个碱基以上、约50个碱基以上、约55个碱基以上、约60个碱基以上或约65个碱基以上、约70个碱基以上、约75个碱基以上、约80个碱基以上、约90个碱基以上、约100个碱基以上、约110个碱基以上、约120个碱基以上、约130个碱基以上、约140个碱基以上、约150个碱基以上、约200个碱基以上、约300个碱基以上、约500个碱基以上、约800个碱基以上、约1000个碱基以上，又可以为约1800个碱基以下、约1500个碱基以下、约1300个碱基以下、约1200个碱基以下、约1100个碱基以下、约1000个碱基以下、约900个碱基以下、约800个碱基以下、约700个碱基以下、约600个碱基以下、约500个碱基以下、约400个碱基以下、约350个碱基以下、约300个碱基以下、约250个碱基以下、约200个碱基以下、约150个碱基以下、约100个碱基以下、约95个碱基以下、约90个碱基以下、约85个碱基以下、约80个碱基以下、约75个碱基以下、约70个碱基以下、约65个碱基以下、约60个碱基以下、约55个碱基以下、约50个碱基以下、约45个碱基以下、约40个碱基以下、约35个碱基以下、约30个碱基以下、约25个碱基以下或约20个碱基以下，可以是将这些下限和上限的任一值组合而得的长度。优选为10～1000个碱基，更优选为15～300个碱基。
[0062] 进而，茎环结构体中的单链环部分的长度，根据要分析的模板核酸和要分析的序列、以及后述的检出工序中的检出原理等来适宜选择即可。虽然不限于此，但例如，可以为约3个碱基以上、约4个碱基以上、约5个碱基以上、约6个碱基以上、约7个碱基以上、约8个碱基以上、约9个碱基以上、约10个碱基以上、约11个碱基以上、约12个碱基以上、约
13个碱基以上、约14个碱基以上、约15个碱基以上、约20个碱基以上、约30个碱基以上、约35个碱基以上、约40个碱基以上、约45个碱基以上、约50个碱基以上、约55个碱基以上、约60个碱基以上或约65个碱基以上、约70个碱基以上、约80个碱基以上、约90个碱基以上、约100个碱基以上、约110个碱基以上、约120个碱基以上、约130个碱基以上、约
140个碱基以上、约150个碱基以上、约160个碱基以上、约170个碱基以上、约180个碱基以上、约190个碱基以上、约200个碱基以上或约250个碱基以上，又可以为约300个碱基以下、约250个碱基以下、约200个碱基以下、约190个碱基以下、约180个碱基以下、约170个碱基以下、约160个碱基以下、约150个碱基以下、约140个碱基以下、约130个碱基以下、约120个碱基以下、约110个碱基以下、约100个碱基以下、约95个碱基以下、约90个碱基以下、约85个碱基以下、约80个碱基以下、约75个碱基以下、约70个碱基以下、约65个碱基以下、约60个碱基以下、约55个碱基以下、约50个碱基以下、约45个碱基以下、约40个碱基以下、约35个碱基以下、约30个碱基以下、约25个碱基以下、约20个碱基以下、约15个碱基以下或约10个碱基以下、约8个碱基以下，可以是将这些下限和上限的任一值组合而得的长度。优选为10～200个碱基，更优选为15～60个碱基。
[0063] 另外，在本扩增反应中，通过以扩增工序所得的复制链作为模板核酸进一步重复扩增工序，可以得到进一步的复制链。详细在后述，即，作为与第2引物的延伸链对应的第2复制链，得到图1的右侧倒数第2段所记载的复制链112。本复制链112包含3’末端的与S2序列互补的S2’序列113、与S2’序列113的5’侧邻接的与S1序列互补的S1’序列
103a、与S1’序列103a的5’侧邻接的第1模板序列的互补序列105a、和与第1模板序列的互补序列105a的5’侧邻接的第2引物序列109。该第2复制链与第1复制链110同样地形成茎环结构。即，S2’序列113与作为S2’序列113的互补序列的、第1模板序列的互补序列105a的一部分的序列结合，其结果形成环部分114。另外特别地，第2复制链通过在反应场存在的聚合酶而3’末端被进一步延伸。由此，茎部分113沿着其互补链延伸，得到包含更长的茎部分的双链。
[0064] 图2显示使用第1引物作为正向引物206、使用第2引物作为反向引物209时的扩增例。特别地，是以模板核酸的正链和负链明确的方式记载的图。图1中的S1序列记载为“F1序列”、S2序列记载为“F2序列”、S3序列记载为“B1序列”，以及第1模板核酸为负链(对应的各序列带有“(-)”的记号)、第2模板核酸为正链(对应的各序列带有“(＋)”的记号)，除此以外，与图1同样地开始、进行扩增反应。
[0065] 图3是特别地以模板核酸的正链和负链明确的方式记载了使用第1引物作为反向引物306、使用第2引物作为正向引物309时的扩增。图1中的S1序列记载为“B1序列”、S2序列记载为“B2序列”、S3序列记载为“F1序列”，以及第1模板核酸为正链(对应的各序列带有“(＋)”的记号)、第2模板核酸为负链(对应的各序列带有“(-)”的记号)，除此以外，与图1同样地开始、进行扩增反应。
[0066] 图4显示与第1引物具有S1序列和S2序列同样地，第2引物中除了S3序列之外在其5’端侧具有S4序列的实施方式。具体地，第1引物被作为正向引物使用，包含与S1序列对应的F1序列、和与S2序列对应的F2序列。第2引物被作为反向引物使用，包含与S3序列对应的B1序列、和与S4序列对应的B2序列。
[0067] 各个扩增工序与图1同样地进行，但与在图1的扩增反应中得到2种茎环结构体相对，在图4的扩增反应中得到共计4种茎环结构体。其中2种与图1同样地，由与第1引物的延伸链对应的第1复制链和与第2引物的延伸链对应的第2复制链构成。另外2种由在图3所示的扩增工序中得到的与第1引物的延伸链对应的第1复制链和与第2引物的延伸链对应的第2复制链构成。
[0068] 图5是显示图1的与第2引物的延伸链对应的复制链的形成过程的图。作为将图1进行了更具体的记载的图2的反应的持续扩增过程记载。图5中作为最初的模板使用的复制链，在图2中是与正向引物206的延伸链对应的复制链210。在图5中，与延伸链210结合的反向引物209延伸而生成延伸链502。延伸链502依赖于其序列而形成自发的分子内结构，从而形成茎环结构体505。茎环结构体505包含3’端的F2’序列(这是“F2序列”的互补序列)、与F2’序列的5’端侧邻接的F1’序列(这是“F1序列”的互补序列)、与F1’序列的5’端侧邻接的负链的模板序列、和与负链的模板序列的5’端侧邻接的B1序列。F2’序列具有与负链的模板序列的一部分互补的序列，因而在同一链上生成分子内结合，由此形成包含茎部分的双链区域和包含环部分的单链区域。进而，茎环结构体505的3’末端被反应液中的聚合酶进一步延伸。通过其延伸，除了环部分508以外的区域全部变成双链。
[0069] 图6与图5同样地显示除了茎环结构体的环部分以外的区域全部为双链的进一步的复制链的形成过程。在图6中，使用图3所示的反向引物308的延伸链311作为最初的模板核酸。在图6中，与延伸链311结合的正向引物309被延伸，生成延伸链602。延伸链602形成自发的分子结构，从而形成茎环结构体605。茎环结构体605具有3’端的B2’序列(这是“B2序列”的互补序列)、与B2’序列的5’端侧邻接的B1’序列(这是“B1序列”的互补序列)、与B1’序列的5’端侧邻接的正链的模板序列、和与正链的模板序列的5’端侧邻接的F1序列。B1’序列具有与正链的模板序列的一部分互补的序列，因而在同一链上生成分子内结合，由此形成包含茎部分的双链区域和包含环部分的单链区域。进而茎环结构体605的3’末端被进一步延伸。通过该延伸，茎环结构体606除了环部分607以外的区域全部变成双链。
[0070] ＜引物组＞
[0071] 实施方式中使用的引物组，只要包含通过2种引物而实现扩增的在其本身公知的任何扩增反应中使用的2种引物、即第1引物和第2引物即可。
[0072] 在PCR扩增的情况下，第1引物是正向引物或反向引物即可。在第1引物是正向引物的情况下，第2引物是反向引物即可。另外，在第1引物是反向引物的情况，第2引物是正向引物即可。
[0073] 例如，在应被扩增的核酸包含第1模板核酸和第2模板核酸，
[0074] 第1模板核酸包含位于3’端的第1序列、与该第1序列的5’侧邻接的第1模板序列、与该第1模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第2序列，并且
[0075] 第2模板核酸是第1模板核酸的互补链，包含位于其3’端的第3序列、与该第3序列的5’侧邻接的第2模板序列、和与该第2模板序列的5’侧邻接且位于5’端的第4序列的情况下，
[0076] 第1引物和第2引物是如下的构成即可。
[0077] [例1]
[0078] 第1引物包含作为第1序列的互补序列的S1序列、和与S1序列的5’端侧连接的S2序列。S2序列是作为第1模板序列的至少一部分的、与第1序列的5’侧邻接或位于第1序列的5’侧的附近的序列。
[0079] 第2引物包含作为第3序列的互补序列的S3序列。
[0080] 使用这样的引物扩增模板核酸时得到的扩增产物的一部分是茎环结构体。该茎环结构体具有如下的2种构成。
[0081] 与第1引物的延伸链对应的第1复制链，在其同一链上形成第1茎环结构体，该第1茎环结构体含有：包含第1茎部分的第1双链区域和构成第1环部分的第1单链区域。第
1双链区域包含来源于S2序列的第1茎部分和与该第1茎部分互补的来源于第1模板序列的互补序列的序列。构成第1环部分的第1单链区域包含S1序列、和任意与该S1序列的3’侧邻接的来源于第1模板序列的互补序列的序列。这里，在第1引物中，S2序列与第
1序列的5’侧邻接的情况下，构成第1环部分的第1单链区域可以在S1序列的3’侧不包含来源于第1模板序列的互补序列的序列。
[0082] 与第2引物的延伸链对应的第2复制链，在其同一链上形成第2茎环结构体，该第2茎环结构体含有：包含第2茎部分的第2双链区域和构成第2环部分的第2单链区域。第
2双链区域包含来源于S2序列的互补序列的第2茎部分和与该第2茎部分互补的来源于第
2模板序列的互补序列的序列。构成第2环部分的第2单链区域包含S1序列的互补序列、和任意与该S1序列的互补序列的5’侧邻接的来源于第2模板序列的互补序列的序列。这里，在第1引物中，S2序列与第1序列的5’侧邻接的情况下，构成第2环部分的第2单链区域可以在S1序列的5’侧不包含来源于第2模板序列的互补序列的序列。
[0083] [例2]
[0084] 或者，第1引物和第2引物也可以是如下的构成。
[0085] 所述第1引物包含作为第1序列的互补序列的S1序列、和与S1序列的5’侧连接的S2序列。S2序列是作为第1模板序列的至少一部分的、与第1序列的5’侧邻接或位于第1序列的5’侧的附近的序列。
[0086] 第2引物包含作为所述第3序列的互补序列的S3序列、和与S3序列的5’侧连接的S4序列。S4序列是作为第2模板序列的至少一部分的、与第3序列的5’侧邻接或位于第3序列的5’侧的附近的序列。
[0087] 使用这样的引物扩增模板核酸时得到的扩增产物的一部分是茎环结构体。该茎环结构体具有如下的4种构成。
[0088] 与第1引物的延伸链对应的第1复制链，在其同一链上形成第1茎环结构体，该第1茎环结构体含有：包含第1茎部分的第1双链区域和构成第1环部分的第1单链区域。第
1双链区域包含来源于S2序列的第1茎部分和与该第1茎部分互补的来源于第1模板序列的互补序列的序列。构成第1环部分的第1单链区域包含S1序列、和任意与该S1序列的3’侧邻接的来源于第1模板序列的互补序列的序列。这里，在S2序列与第1序列的5’侧邻接的情况下，构成第1环部分的第1单链区域可以在S1序列的3’侧不包含来源于第
1模板序列的互补序列的序列。
[0089] 与第1引物的延伸链对应的第2复制链，在其同一链上形成第2茎环结构体，该第2茎环结构体含有：包含第2茎部分的第2双链区域和构成第2环部分的第2单链区域。第
2双链区域包含来源于S4序列的互补序列的第2茎部分和与该第2茎部分互补的来源于第1模板序列的互补序列的序列。构成第2环部分的第2单链区域包含S3序列的互补序列、和任意与该S3序列的互补序列的5’侧邻接的来源于第1模板序列的互补序列的序列。
这里，在S4序列与第3序列的5’侧邻接的情况下，构成第2环部分的第2单链区域可以在S3序列的5’侧不包含来源于第1模板序列的互补序列的序列。
[0090] 与第2引物的延伸链对应的第3复制链，在其同一链上形成第3茎环结构体，该第3茎环结构体含有：包含第3茎部分的第3双链区域和构成第3环部分的第3单链区域。第
3双链区域包含来源于S4序列的第3茎部分和与该第3茎部分互补的来源于第2模板序列的互补序列的序列。构成第3环部分的第3单链区域包含S3序列、和任意与该S3序列3’侧邻接的来源于第2模板序列的互补序列的序列。这里，在S4序列与第3序列的5’侧邻接的情况下，构成第3环部分的第3单链区域可以在S3序列的3’侧不包含来源于第2模板序列的互补序列的序列。
[0091] 与第2引物的延伸链对应的第4复制链，在其同一链上形成第4茎环结构体，该第4茎环结构体含有：包含第4茎部分的第4双链区域和构成第4环部分的第4单链区域。第
4双链区域包含来源于S2序列的互补序列的第4茎部分和与该第4茎部分互补的来源于所述第2模板序列的互补序列的序列。构成第4环部分的第4单链区域包含S1序列的互补序列、和任意与该S1序列的互补序列的5’侧邻接的来源于第2模板序列的互补序列的序列。在S2序列与第1序列的5’侧邻接的情况下，构成第4环部分的第4单链区域可以在S1序列的互补序列的5’侧不包含来源于第2模板序列的互补序列的序列。
[0092] ＜检出工序＞
[0093] 接着模板核酸的扩增之后，检出上述的扩增工序所得的扩增产物中目的序列是否存在，或以怎样程度的量存在。
[0094] 检出使用核酸探针来进行。核酸探针包含要检出的目标序列的互补序列。在本核酸分析法中，应被核酸探针检出的目标序列，设计成包含在上述的扩增产物中的茎环结构体的环部分中那样即可。
[0095] 检出通过使固定化于基体上的核酸探针与扩增产物杂交来进行。然后，通过适宜的检出法来检出扩增产物与核酸探针的杂交。
[0096] ＜核酸探针＞
[0097] [例1]
[0098] 在使用上述的＜引物组＞的项目的[例1]所记载的引物组的情况下，例如，可以使用如下的2种核酸探针、即第1核酸探针和/或第2核酸探针。
[0099] 第1核酸探针可以包含第1复制链的构成第1环部分的第1单链区域的至少一部分的序列。这样的第1核酸探针可以在第1核酸探针的5’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的3’侧邻接的第1模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。或者，第1核酸探针可以包含作为第1复制链的构成第1环部分的第1单链区域的至少一部分的序列的、S1序列的至少一部分的序列。这样的第1核酸探针还可以在第1核酸探针的5’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的3’侧邻接的第1模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。这里，在第1引物中，S2序列与第1序列的5’侧邻接的情况下，可以不包含相对于来源于第1模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。
[0100] 第2核酸探针可以包含第2复制链的构成第2环部分的第2单链区域的至少一部分的序列。这样的第2核酸探针还可以在第2核酸探针的3’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的5’侧邻接的所述第2模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。或者，第2核酸探针还可以包含作为第2复制链的构成第2环部分的第2单链区域的至少一部分的序列的、S1序列的互补序列(即，S1’序列)的至少一部分的序列。这样的第2核酸探针还可以在第2核酸探针的3’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的5’侧邻接的所述第2模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。这里，在第1引物中，S2序列与第1序列的5’侧邻接的情况下，可以不包含相对于来源于第2模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。
[0101] 在使用上述的＜引物组＞的项目的[例2]所记载的引物组的情况下，例如，可以从如下的4种核酸探针，即第1核酸探针、第2核酸探针、第3核酸探针和第4核酸探针中的选择至少1种核酸探针来使用。
[0102] 第1核酸探针可以包含所述第1复制链的所述构成第1环部分的第1单链区域的至少一部分的序列。这样的第1核酸探针还可以在第1核酸探针的5’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的3’侧邻接的第1模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。或者，第1核酸探针可以包含作为所述第1复制链的所述构成第1环部分的第1单链区域的至少一部分的序列的、S1序列的互补的序列的至少一部分的序列。这样的第1核酸探针还可以在第1核酸探针的5’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的3’侧邻接的第1模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。这里，这里，在S2序列与第1序列的5’侧邻接的情况下，可以不包含相对于来源于第1模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。
[0103] 第2核酸探针可以包含第2复制链的构成第2环部分的第2单链区域的至少一部分的序列。这样的第2核酸探针还可以在第2核酸探针的3’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的5’侧邻接的第1模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。或者，第2核酸探针还可以包含作为第2复制链的构成第2环部分的第2单链区域的至少一部分的序列的、S3序列的至少一部分的序列。这样的第2核酸探针还可以在第2核酸探针的3’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的5’侧邻接的第1模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。这里，在S4序列与第3序列的5’侧邻接的情况下，可以不包含相对于来源于第1模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。
[0104] 第3核酸探针可以包含第3复制链的构成第3环部分的第3单链区域的至少一部分的序列。这样的第3核酸探针还可以在第3核酸探针的5’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的3’侧邻接的第2模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。或者，第3核酸探针可以包含作为第3复制链的构成第3环部分的第3单链区域的至少一部分的序列的、S3序列的互补的序列的至少一部的序列。这样的第3核酸探针还可以在第3核酸探针的5’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的3’侧邻接的第2模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。这里，在S4序列与第3序列的5’侧邻接的情况下，可以不包含相对于来源于第2模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。
[0105] 第4核酸探针还可以包含第4复制链的构成第4环部分的第4单链区域的至少一部分的序列。这样的第4核酸探针还可以在第4核酸探针的3’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的5’侧邻接的第2模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。或者，第4核酸探针还可以包含作为第4复制链的构成第4环部分的第4单链区域的至少一部分的序列的、S1序列的至少一部分的序列。这样的第4核酸探针还可以在第4核酸探针的3’侧进一步任意包含相对于来源于与所述一部分的序列的5’侧邻接的第2模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。这里，在S2序列与第1序列的5’侧邻接的情况下，可以不包含相对于来源于第2模板序列的互补序列的序列的至少一部分的序列为互补的序列。
[0106] ＜DNA芯片＞
[0107] 本实施方式中使用的DNA芯片只要具备基体和被固定化于基体上的核酸探针即可。DNA芯片的基体可以是以电流检出型为代表的电化学检出型、萤光检出型、化学显色型和放射能检出型等现有公知的任一种微阵列用的基体。
[0108] 任一种微阵列都可以通过其本身公知的方法制造。例如，在电流检出型微阵列的情况下，将阴性对照探针固定化区域和检出用探针固定化区域分别配置在不同的电极上即可。
[0109] 将DNA芯片的例子作为模式图示于图13，但不限于此。DNA芯片130在基体131上具备固定化区域132。核酸探针133被固定化于该固定化区域132。这样的DNA芯片130可以通过本领域公知的方法制造。配置于基体131的固定化区域132的数及其配置可以由本领域技术人员根据需要适宜设计变更。这样的DNA芯片可以优选用于使用萤光的检出方法。
[0110] 将DNA芯片的其他例示于图14。图14的DNA芯片140在基体141上具备电极142。核酸探针143被固定化于该电极142。电极142与小块144连接。介由小块144获得来自电极142的电信息。这样的DNA芯片140可以通过本领域公知的方法来制造。配置于基体141的电极142的数及其配置可以由本领域技术人员根据需要适宜设计变更。进而，本例的DNA芯片根据需要可以具备参照电极和对极。
[0111] 电极可以使用像金、金的合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓或钨那样的金属单质和它们的合金，或者像石墨、玻碳那样的碳或它们的氧化物或化合物，但不限于这些。
[0112] 像本例这样的DNA芯片可以适合用于电化学的检出方法。
[0113] ＜杂交条件＞
[0114] 杂交在杂种能充分形成的适当条件下进行即可。适当条件根据目标核酸的种类和结构、目标序列所含的碱基的种类、核酸探针的种类不同而不同。例如，可以在离子强度为0.01～5的范围、pH值5～9的范围的缓冲液中进行杂交。反应温度可以在10℃～90℃的范围。可以通过搅拌和/或振荡等来提高反应效率。反应溶液中可以添加像硫酸葡聚糖、鲑精子DNA、和牛胸腺DNA这样的杂交促进剂、EDTA、或表面活性剂等。
[0115] ＜洗涤条件＞
[0116] 杂交后，用于洗涤DNA芯片的洗涤液适合使用离子强度为0.01～5的范围、pH值5～9的范围的缓冲液。洗涤液优选包含盐和表面活性剂等。例如，使用氯化钠或柠檬酸钠调制的SSC溶液、Tris-HCl溶液、Tween20溶液、或SDS溶液等是适合使用的。洗涤温度例如在10℃～70℃的范围进行。洗涤液通过或滞留于探针固定化基体的表面或固定化了核酸探针的区域。或者，可以在洗涤液中浸渍DNA芯片。此时，洗涤液优选收纳于可以进行温度控制的容器中。
[0117] ＜检出方法＞
[0118] 由杂交工序所生成的杂种的检出，可以利用萤光检出方式和电化学的检出方式。
[0119] (a)萤光检出方式
[0120] 使用萤光标记物质进行检出。可以将核酸的扩增工序中使用的引物用像FITC、Cy3、Cy5、或罗丹明等萤光色素这样的萤光活性的物质进行标记。或者，也可以使用经这些物质标记后的第二探针。也可以同时使用多种标记物质。通过检出装置，来检出被标记后的序列或2次探针中的标记。根据所使用的标记使用适当的检出装置。例如，在使用萤光物质作为标记的情况下，使用萤光检出器进行检出。
[0121] (b)电化学的检出方式
[0122] 使用本领域公知的双链识别物质。双链识别物质可以从HOECHST33258、吖啶橙、喹吖因、道诺霉素、金属嵌入剂、双吖啶等双嵌入剂、三嵌入剂和多嵌入剂中选择。进而，可以将这些双链识别物质用电化学活性的金属络合物、例如二茂铁、紫精等修饰。
[0123] 双链识别物质根据种类不同而不同，一般以1ng/mL～1mg/mL的范围的浓度使用。此时，可以使用离子强度为0.001～5的范围、pH值5～10的范围的缓冲液。
[0124] 测定中，例如施加大于等于双链识别物质进行电化学反应的电位的电位，测定来源于双链识别物质的反应电流值。此时，电位可以以定速方式施加，或者以脉冲方式施加，或者可以施加定电位。还可以使用像恒电位仪、数字万用表、和函数发生器这样的装置来控制电流、电压。电化学的检出可以通过本领域公知的方法来实施。
[0125] ＜检测试剂盒＞
[0126] 本实施方式还可以是检测试剂盒的方式。检测试剂盒只要包含上述的任一实施方式的引物组和核酸引物即可，进一步还可以任意包含稀释液、各种酶、反应容器、操作说明书等。
[0127] 实施例1
[0128] 对于通过DNA芯片来检出使用环形成引物进行扩增而得的产物方法所示的实施例进行详述。
[0129] (1)扩增
[0130] ＜模板＞
[0131] 模板使用导入了枯草杆菌序列的质粒。枯草杆菌的序列在序列号1中显示。
[0132] ＜引物＞
[0133] 作为扩增297bp的通常PCR引物，准备5’-GGGAGCGAACAGGATTAGATACC-3’(F引 物、序 列 号 2)、5’-CTGACGACAACCATGCACC-3’(R引 物、序 列 号3)，作 为 扩 增322bp的 通 常PCR引 物，准 备5’-GTAGGTGGCAAGCGTTGTCC-3’(F引 物、序 列号 4)、
5’-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’(R引物、序列号5)。引物位置示于图7。另外作为茎短的环形成297bp目标扩增用，准备5’-CCCTAACACTTAGCACTCATCGTT-GGGAGCGAACAGGATTAGATACC-
3’(F引物、序列号6)、5’-GAAACCCCCTAACACTTAGC-GGGAGCGAACAGGATTAGATACC-3’(F引物、序列号7)、5’-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-GGGAGCGAACAGGATTAGATACC-3’(F引物、序列号8)。
[0134] R引物使用与通常PCR引物同样的引物(序列号3)。进而，作为茎长的环形成322bp目标扩增用，准备5’-GGTAGTCCACGCCGTAAACG-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’(R引物、序列号9)、5’-ATTAGATACCCTGGTAGTCCAC-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’(R引物、序列号10)、
5’-GGAGCGAACAGGATTAGATACCCT-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’(R引物、序列号11)，F引物使用与通常PCR引物同样的引物(序列号4)。序列号6、7、8、9、10和11的单链环长度分别为
42bp、52bp、66bp、40bp、50bp、60bp。
[0135] ＜扩增＞
[0136] 扩增使用KAPA2G Fast DNA试剂盒(KAPA Biosystems社制)，在95℃1分钟的热变性之后，将95℃5秒→65℃5秒进行40个循环。扩增装置在GeneAmp PCR9700(Applied Biosystems)中进行。扩增时间为47分钟左右。扩增后，通过电泳确认扩增产物。
[0137] (2)芯片检出
[0138] ＜检出探针＞
[0139] 为了对(1)中扩增的枯草杆菌的扩增产物进行芯片检出，准备5’-ACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACT-3’(序列号17)、5’-CTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAG-3’(序列号18)的2种长度不同的负链的探针。探针位置示于图7。另外，作为阴性对照，准备显示与枯草杆菌无关的序列的5’-TGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCA-3’(序列号19)。以上的探针为了固定化于金电极，而将3’末端侧进行硫醇修饰。
[0140] ＜探针固定化电极的制作＞
[0141] 探针的固定化利用硫醇与金的强的共价结合性来进行。将含1mM巯基己醇溶液的探针溶液点样在金电极上，使其干燥。同一探针点样各4电极。干燥后，用超纯水洗涤、风干，得到探针固定化电极。
[0142] ＜杂交＞
[0143] 将(1)中得到的扩增产物在95℃进行5分热变性后，添加2×SSC的盐，将该溶液浸渍于如上所述制作的探针固定化电极中，在64℃静置5分钟，进行杂交。然后，将探针固定化电极在0.2×SSC溶液中在25℃浸渍1分钟进行洗涤。接着，将探针固定化电极在包含作为嵌入剂的HOECHST33258溶液50μM的PIPES缓冲液中浸渍1分钟。然后，测定HOECHST33258溶液的氧化电流应答。
[0144] (3)结果
[0145] 图8显示电泳结果。用通常的PCR引物扩增而得的产物和用环形成引物扩增而得的产物，均在目的的区域确认了条带。对于环形成引物产物，有多个条带，启示形成了多种结构的目标结构的产物。图9显示芯片检出结果。对于用通常PCR引物扩增而得的产物，未发现信号增加。另一方面，对于用环形成引物扩增而得的产物，发现了信号增加。进而，与茎部分短的扩增产物相比，在检出了茎部分长的扩增产物的情况下，更加稳定地检出了高信号增加。关于环长度，至40bp～60bp确认了充分的信号增加。另外对于添加了TE代替模板的Negative(阴性)产物，确认了没有信号增加。
[0146] 实施例2
[0147] 作为通过DNA芯片来检出使用环形成引物进行扩增而得的产物的方法的进一步应用例，进行了不同的目标长度、不同的高速PCR酶的研究。进而进行了F引物、R引物两者为环形成引物的情况的研究。
[0148] (1)扩增
[0149] ＜模板＞
[0150] 使用与实施例1同样的模板。
[0151] ＜引物＞
[0152] 为了获得显示不同的目标长度的茎长的环形成目标，作为161bp目标用 准 备 5’-GCGTAGAGATGTGGAGGAAC-3’(F引 物、序 列 号 12)，作 为 322bp目 标 用准 备5’-GTAGGTGGCAAGCGTTGTCC-3’(F 引 物、序 列 号4)，作 为 511bp目 标 用 准备5’-AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCC-3’(F引物、序 列号13)，作 为734bp目标用准 备5’-CCTGTAAGACTGGGATAACTCCG-3’(F引物、序列号14)。进而，为了获得F引物和R引物两者为环形成引物的情况的产物，作为161bp目标用准备5’-GCTCCTCAGCGTCAGTTACA-GCGTAGAGATGTGGAGGAAC-3’(F引物、序列号15)、作为322bp目标用准备5’-GCTTTCACATCAGACTTAAGGAACC-GTAGGTGGCAAGCGTTGTCC-3’(F引物、序列号4)。R引物全部通用5’-ATTAGATACCCTGGTAGTCCAC-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’(序列号10)。
[0153] ＜扩增＞
[0154] 扩增使用(1)中所使用的KAPA2G Fast、和Takara SpeedSTARTM HS DNA聚合酶(TAKARA Bio社制)、Phire Hot Start II DNA聚合酶(Thermo Fisher Scientific社制)。
[0155] 反应条件通过与实施例1同样的方法进行。
[0156] (2)芯片检出
[0157] 省略杂交前的扩增产物的热处理。除此以外，通过与实施例1同样的方法进行。
[0158] (3)结果
[0159] 图10显示目标长度不同的扩增产物的检出结果。可见随着目标长度变长，信号增加逐渐变低的倾向，但均可观察到充分的信号增加。另外，即使在F和R引物两者为环形成引物的情况下，也确认了充分的信号增加。进而，如图11所示，在研究的3种高速PCR酶中全部确认了信号增加。
[0160] 实施例3
[0161] 作为通过DNA芯片来检出使用环形成引物进行扩增而得的产物的方法的进一步应用例，使用RoboCycler Gradient96(Stratagene社制)和UR104MKIII(Trust Medical社制)的旋转式PCR装置研究了扩增的短时间化。
[0162] (1)扩增
[0163] ＜模板＞
[0164] 使用与实施例1同样的模板。
[0165] ＜引物＞
[0166] 作为茎长的环形成166bp目标扩增用，使用5’-GCGTAGAGATGTGGAGGAAC-3’(F引物、序列号12)、5’-ATTAGATACCCTGGTAGTCCAC-AGCACTAAGGGGCGGAAACC-3’(R引物、序列号10)。
[0167] ＜扩增＞
[0168] 扩增使用KAPA2G Fast DNA试剂盒，对于RoboCycler Gradient96，在97℃1分钟的热变性之后，将97℃10秒→53℃10秒进行40个循环。扩增时间为18分30秒左右。对于UR104MKIII，制成酶量为推荐浓度的2倍的组成，在95℃1分钟的热变性之后，将95℃4秒→65℃7秒进行40个循环。扩增时间为10分30秒左右。
[0169] (2)芯片检出
[0170] 通过与实施例2同样的方法进行。
[0171] (3)结果
[0172] 如图12所示，显示了对于用RoboCycler和UR104MKIII扩增而得的产物，能够进行芯片检出。
[0173] 将上述实施例1～3中作为模板序列使用的枯草杆菌序列示于表1。
[0174] 表1
[0175] 序列号1 枯草杆菌序列
[0176] AGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAG GTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGC
[0177] 关于上述实施例1～3中使用的各引物的序列，在表2中记载。
[0178] 表2
[0179]
[0180] 将上述实施例1～3中使用的探针示于表3。
[0181] 表3
[0182]
