一种牡蛎远缘杂种不育的育性恢复方法

摘要

本发明公开了一种牡蛎远缘杂种不育的育性恢复方法。采用远缘杂交方式，将香港牡蛎和长牡蛎进行性腺同步化处理，然后进行种间牡蛎杂交，获得高度不育的杂交后代F1；在杂交后代F1杂种成熟季节，对其育性进行分析，筛选可育个体；采取家系或者群体繁殖方式，进行杂种F1可育个体的自繁，获得杂种子二代F2；利用分子标记，从完全可育的杂种F2中筛选出与杂种F1基因型比较一致的个体，即获得了完全可育兼具杂种F1特征的群体，实现了杂种育性完全恢复。本发明解决了牡蛎在远缘杂交中经常出现杂交不育导致后续育种工作无法进行的难题，为其远缘回交、多元杂交及其杂种子代育种潜力评估等提供了数据和参考，也为其新品种研发提供了可能。

权利要求

1.一种牡蛎远缘杂种不育的育性恢复方法，其特征在于，包括以下步骤：a、杂交后代F1制备：采用远缘杂交方式，将香港牡蛎和长牡蛎进行性腺同步化处理，然后进行种间牡蛎杂交，获得高度不育的杂交后代F1；

b、可育个体筛选：在杂交后代F1杂种成熟季节，对其育性进行分析，筛选可育个体；

c、可育杂种自繁：采取家系或者群体繁殖方式，进行杂交后代F1可育个体的自繁，获得杂种子二代F2，这些子二代均是可育的；

d、分子标记复选：利用分子标记，从完全可育的杂种子二代F2中筛选出与杂交后代F1基因型比较一致的个体，即获得了完全可育兼具杂交后代F1特征的群体，实现了杂种育性完全恢复。

2.根据权利要求1所述的牡蛎远缘杂种不育的育性恢复方法，其特征在于，所述的分子标记为ITS核基因标记。

说明书

一种牡蛎远缘杂种不育的育性恢复方法

技术领域：

[0001] 本发明属于海洋农业中贝类遗传育种技术领域，具体涉及一种牡蛎远缘杂种不育的育性恢复方法。背景技术：

[0002] 杂交不育（Hybrid sterile）在远缘杂交中是一种普遍现象，是指亲缘关系较远的生物类型间所获得的杂种，因其生理功能不协调、生殖系统遭受扰乱而不能繁殖后代或者繁殖力低的现象。这种现象主要是由于物种是遗传性质上完全不同的进化单元，存在着生殖隔离机制导致的。杂交不育主要集中在作物、家畜等远缘杂交上（楼允东，1999）。但是，杂交不育并不绝对，如在鱼类上，可以划分为完全能育型、障碍性两性能育型、单性能育型、完全不育型等。

[0003] 对于水产动物而言，远缘杂交不育研究主要集中在鱼类上的鲑鳟类、鲤科类及罗非鱼类（Bartley et al.,2001）上。对于贝类，由于杂交种比较难于存活，往往在幼虫阶段就已经大量死亡，获得的少量稚贝也很难存活至性成熟，即使获得了少量的性成熟稚贝，也由于数量太少对其性腺生殖发育研究不具有统计学意义，故导致了贝类远缘杂种不育研究非常少（Gaffney & Allen，1993；张国范等，2004）。目前，有关贝类远缘杂交中的杂交不育报道中，Wang et al.（2011）发现海湾扇贝A.irradians irradians×紫扇贝A.purpuratus种间杂种全部为雌性，没有雄性个体出现，表现出单性能育；Zhang et al.（2012）发现香港牡蛎与长牡蛎杂种具有高度不育性，包括性腺不育、配子不育、合子不育三个特征，但是每一种不育程度均不完全。

[0004] 为此，如何对贝类中杂种不育进行育性恢复是一个新问题，因为人们并不像了解作物一样了解有关育性基因的信息，进行育性恢复。由于杂种不育没有功能性配子，或者说功能性配子很少，导致很难利用杂种作为中间材料开展下一步育种工作。在作物中，虽然很多杂种育性差，但是利用其产生的功能性配子与双亲种进行种间回交时可能会产生超级优势的回交新品系（种）。所以，恢复杂种育性，对于育种至关重要。张跃环（2012）发现，虽然香港牡蛎与长牡蛎杂种高度不育，产生的功能性配子极少，但是，利用育性较差的杂种与双亲回交时，可以产生明显的生长优势，那么，在不知道控制杂种育性基因信息的情况下，如何恢复杂种的育性是贝类育种中所面临的一个共同问题。到目前位置为止，尚未发现此类相关研究报道，这恰恰是本发明的创新点。发明内容：

[0005] 本发明的目的是提供一种牡蛎远缘杂种不育的育性恢复方法，该方法解决了牡蛎远缘杂种不育导致后续育种工作无法进行的难题，为其远缘回交、多元杂交及其杂种子代自繁育种潜力评估等提供了数据和参考，也为其新品种研发提供了可能途径。

[0006] 本发明的牡蛎远缘杂种不育的育性恢复方法，其特征在于，包括以下步骤：

[0007] a、杂种F1制备：采用远缘杂交方式，将香港牡蛎和长牡蛎进行性腺同步化处理，然后进行种间牡蛎杂交，获得高度不育的杂交后代F1；

[0008] b、可育个体筛选：在杂交后代F1杂种成熟季节，对其育性进行分析、筛选可育个体；由于贝类杂交不育的非绝对性，一般可从在不育群体中筛选出少数或者极少数可育雌雄个体；

[0009] c、可育杂种自繁：采取家系或者群体繁殖方式，进行杂种F1可育个体的自繁，获得杂种子二代F2，这些子二代均是可育的；

[0010] d、分子标记复选：利用分子标记，从完全可育的杂种F2中筛选出与杂种F1基因型比较一致的个体，即获得了完全可育兼具杂种F1特征的群体，实现了杂种育性完全恢复。

[0011] 所述的分子标记可以为ITS等核基因分子标记。

[0012] 本发明实际上是育性筛选过程，从不育杂种群体中找出携带育性基因个体，进行自繁；再根据孟德尔遗传定律，采用分子标记复选出与杂种F1基因型一致的可育群体。本发明解决了牡蛎在远缘杂交中经常出现杂交不育导致后续育种工作无法进行的难题，为其远缘回交、多元杂交及其杂种子代育种潜力评估等提供了数据和参考，也为其新品种研发提供了可能。附图说明：

[0013] 图1是本发明的技术路线图，实线部分为本发明核心内容，虚线部分为基础工作。

[0014] 图2是利用ITS2标记杂种自繁F2的遗传分离示意图。注：M：maker；1-2：杂交子亲本F1；3-10为杂种子二代F2（3-4为H型，5-8为HG型，9-10为G型）。具体实施方式：

[0015] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

[0016] 实施例1：

[0017] 第一步、杂种F1制备：采用种间杂交模式，以巨蛎属的香港牡蛎与长牡蛎为材料，首先将香港牡蛎和长牡蛎进行性腺同步化处理，然后进行二者的杂交，发现种间杂种F1具有高度不育性，获得高度不育的杂交后代F1。值得说明的是，在巨蛎属的种间杂交中，香港牡蛎×近江牡蛎、香港牡蛎×葡萄牙牡蛎、近江牡蛎×长牡蛎等杂交组合的杂种均是完全可育的，目前仅发现香港牡蛎与长牡蛎的杂种是高度不育的（图1）。

[0018] 第二步、可育个体筛选：在香港牡蛎与长牡蛎的杂种F1成熟季节，对其进行育性分析，杂种不育表现为：仅8.64%雌性个体完全可育，5.06%雄性个体产生很少量精子，1.40%为雌雄同体，从中筛选可育个体。

[0019] 第三步、可育杂种自繁：采用家系形式将筛选出杂种F1的少数可育个体自繁，获得杂种子二代F2，其中，建立了12个雌雄异体家系，3个雌雄同体自交家系。发现可育杂种F1所产生的卵子、精子均具有功能性。其中，精子完全具有受精能力，而卵子虽然受精率较高，但是孵化率相对较低，表现出一定程度的合子不育现象。

[0020] 第四步、分子标记复选：经过子代培育，在杂种F2成熟季节，发现所获得的子代均是可育的，出现了育性完全恢复现象。由于杂种F2会出现遗传分离现象，因此，采用ITS等核基因作为标记[引物：5’-GGGTCGATGAAGAACGCAG(5.8S)，5’-GCTCTTCCCGCTTCACTCG(18S)]，复选出与杂种F1基因型比较一致的F2个体群。结果表明：雌雄异体家系子二代F2中大约有50%出现了遗传分离，如图2中3-4的H型，9-10的G型，均为纯种类型；但仍有50%左右处于杂合状态，与杂种F1极其相似（表1，图2中5-8的HG型）；雌雄同体个体自繁家系中，所有子二代F2均处于杂合状态，均为HG型。由此可见，通过高度不育杂种F1自繁，可获得完全可育F2；再经过分子标记复选，可以得到与杂种F1遗传上相似、育性完全恢复杂种，实现了杂种育性完全回复。因此本发明可为其种间回交制种、多元杂交、自繁育种潜力评估等提供了高度可行性，为其新品种培育提供了途径。

[0021] 表1利用ITS2标记的杂种F2遗传分离概率

[0022]实验组 H型 HG型 G型
HH（n=30） 30 — —
GG（n=32） — 32 —
HG F2（n=210） 49 104 57

[0023]HG F2*（n=75） — 75 —

[0024] 注：n表示实验材料数量；*表示雌雄同体杂种自繁家系子二代F2。

[0025] 最后，应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。